A gran escala de barrido Microscopía Electrónica de Transmisión (Nanotomy) de pez cebra cerebrales saludables y lesionados

El objetivo general de este experimento de microscopía electrónica a gran escala o de nanotomía es definir las alternancias desde el nivel macromolecular hasta el nivel tisular, en el caso actual, en el cerebro de pez cebra en degeneración. La nanotomía puede ayudar a responder preguntas clave en las ciencias de la vida. Por ejemplo, en la neurodegeneración y en la investigación de la diabetes tipo 1.

La principal ventaja de la nanotomía es que se obtiene información imparcial, que va desde macromoléculas, orgánulos, células, hasta tejidos. Esto permite la cuantificación y el intercambio de datos de acceso abierto a través de nanotomy.org. Aunque la nanotomía proporciona información sobre el mantenimiento inmunológico y la microglía en el cerebro neurodegenerativo del pez cebra, también se aplica a otros modelos de enfermedades, incluidos cultivos celulares, ratones e incluso tejidos humanos.

Generalmente, los científicos nuevos en esta técnica tienen dificultades porque la cantidad de datos es abrumadora. Esto puede ser mil veces más de lo que se obtiene con EM tradicional. Después de fijar las larvas de pez cebra de acuerdo con el protocolo de texto, corte las cabezas de las larvas rostralmente hasta el cerebro posterior para facilitar la penetración del osmio. Coloque las larvas en tetróxido de osmio al 1%, ferrocianuro de potasio al 1,5%, en cacodilato de sodio al 0,1 molar e incube en hielo durante dos horas.

Luego use agua destilada doble para enjuagar los embriones tres veces durante cinco minutos cada vez. Antes de la inclusión, las muestras deben deshidratarse en una serie de etanol. Para incrustar los embriones, después de incubar en resina epoxi diluida durante la noche según el protocolo de texto, retire la resina diluida y use resina pura para reemplazarla.

Incuba durante 30 minutos, luego reemplaza la resina por segunda vez e incuba durante otros 30 minutos. Después de refrescar la resina por tercera vez, incuba a temperatura ambiente durante tres horas. Luego, incube a 58 grados centígrados durante 15 minutos.

Finalmente, incubar a baja presión a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, bajo un microscopio de disección, utilice una aguja o un palillo de dientes para orientar las cabezas en moldes de inclusión planos de silicona disponibles en el mercado. A continuación, polimeriza la resina epoxi a 58 grados centígrados durante la noche.

Cuando el espécimen esté completamente endurecido, usa hojas de afeitar para recortar el exceso de resina del talón. Para detectar la posición correcta, use un cuchillo de vidrio o un cuchillo de histocuchillo de diamante en un ultramicrótomo para cortar secciones de larvas semifinas para azul de toluidina/fucsina básica. Transfiera las secciones semifinas a portaobjetos microscópicos recogiéndolos con una pipeta Pasteur de vidrio cuya punta se haya cerrado fundiéndola en una llama.

Secar en una placa caliente hasta que no quede agua. A continuación, coloque las muestras en azul de toluidina al 1% en agua e incube las secciones en una placa caliente durante 10 segundos para teñirlas. Luego, después de usar agua para enjuagar las secciones, use 05% de fucsina básica en tetraborato de sodio al 1% para teñir las muestras durante 10 segundos adicionales.

Con un microscopio óptico normal de 10X a 40X, examine las muestras. Cuando se alcance el sitio o la orientación adecuados, utilice estructuras anatómicas fácilmente identificables, incluidas las fosas olfativas, los ojos o los límites de la materia gris-blanca, para identificar la región del cerebro de interés durante el corte ultrafino y para ajustar el ángulo de corte cuando se inclina la muestra. Continúa seccionando el bloque de resina epoxi con un cuchillo de diamante para cortar secciones ultrafinas de 70 nanómetros.

Monte cada sección en una sola ranura L2 por 1 forma de rejilla de cobre con código de barras para permitir la adquisición ininterrumpida por las barras de la rejilla. Un milímetro cuadrado puede parecer pequeño. Simplemente encajará en la abertura.

De esta manera, evitamos que las barras de la cuadrícula bloqueen nuestra muestra. Tenga en cuenta que cada artefacto introducido en nuestra muestra se registrará en comparación con el EM tradicional. Contraste las muestras con metales pesados de acuerdo con el protocolo de texto y guárdelas en un cuadro de cuadrícula. Para montar la muestra en el microscopio electrónico de barrido, o SEM, coloque la rejilla de la caja de transferencia con la sección en el portamuestras de rejilla múltiple y transfiérala a la cámara del SEM.

Después de alinear el detector de acuerdo con el protocolo de texto, preirradie la muestra alejándola para que el área completa que se va a escanear se ajuste a la ventana de la imagen. Una vez que se haya cambiado la apertura a 120 micrómetros y se haya desenfocado la imagen, utilice la opción de escaneo de área reducida para que el área escaneada sea lo más ajustada posible. A continuación, establezca la velocidad de fotogramas para escanear el fotograma en aproximadamente uno o dos segundos.

A continuación, amplíe al menos 100X y escanee un área pequeña durante 10 segundos. Si el brillo en el área aún cambia, continúe con la pre-irradiación. Cuando esta área no cambia de brillo en comparación con su entorno, la irradiación previa es suficiente.

Mientras está enfocado, seleccione el área o característica más clara y establezca la velocidad de escaneo para que los detalles sean visibles. En el software del microscopio, ajuste el brillo y el contraste observando cuidadosamente el histograma para mantener todos los píxeles en el rango dinámico. Haz lo mismo con las áreas y características más oscuras.

Regrese al área brillante y verifique nuevamente para que haya algo de espacio a ambos lados del histograma. Para los pasos cuatro seis a cuatro ocho, el ajuste del brillo y el contraste debe hacerse con mucho cuidado para que toda el área esté dentro del rango dinámico. Aléjese para que el área completa que se va a escanear se ajuste a la ventana de imaginación e inicie el programa de adquisición de área grande.

A continuación, utilice la opción del asistente para configurar un mosaico seleccionando un área de la pantalla. Utilice un tamaño de píxel de dos a cinco nanómetros, dependiendo de los detalles que sean necesarios, y establezca un tiempo de permanencia de tres microsegundos para la microscopía electrónica de transmisión de barrido, o STEM. Presione optimizar para verificar la configuración del microscopio y se mostrará el tiempo necesario.

A continuación, vuelva a encender el generador de análisis externo y pulse continuar. Para analizar los datos STEM, abra un programa de visualización de archivos EM a gran escala y abra el archivo llamado mosaic info, que abrirá los archivos tif en mosaico. Elija la opción Puntada automática de todo el mosaico y elija los siguientes parámetros: el modo de superposición es igual a la mitad, el umbral de costura es igual a 0,90 y la reducción de ruido es igual a automática.

Si no se pueden cumplir los criterios de unión, acérquese y coloque manualmente el mosaico en su posición y haga clic en Continuar tal cual.Exporte los datos como un archivo HTML o como un solo tif. Incluya el tamaño de píxel final y el nombre del archivo para permitir las mediciones más adelante, luego analice los datos de acuerdo con el protocolo de texto. Como se muestra aquí, la nanotomía de secciones cerebrales de control revela características ultraestructurales típicas del tejido neural del prosencéfalo rostral, incluidos los haces de fibras olfativas, los núcleos neuronales y los subcompartimentos neuronales, incluidas las sinapsis.

Aquí, las estructuras subcelulares incluyen diferentes morfologías nucleares y focos en diferentes tipos de células y orgánulos, incluido el aparato de Golgi, el retículo endoplásmico, las mitocondrias, las vesículas sinápticas y las densidades postsinápticas. Inesperadamente, los núcleos de las células que recubren el ventrículo son muy densos en electrones en comparación con otras células dispersas más lateralmente en el cerebro. En la microglía, los núcleos también muestran focos oscuros, posiblemente heterocromatina, que están ausentes en otras células del cerebro.

Esta imagen de una EM a gran escala de una sección coronal en una larva de pez cebra sometida a ablación neuronal revela microglía fagocítica. También se encontraron rasgos característicos de la microglía en las células de mamíferos, incluido el aparato de Golgi prominente y numerosas inclusiones como los lisosomas. Una vez dominado, la adquisición se puede realizar en un día, mientras que el EM tradicional le costará al menos una semana.

Al intentar este procedimiento, es importante que un operador de microscopio desempeñe un papel crucial en la obtención de imágenes de alta calidad. Esta no es solo una técnica de presionar un botón. Ahora aplicamos la nanotomía no solo al modelo de degeneración neuronal del pez cebra, sino que también la usamos para el inmunomarcaje de células y para estudiar tejidos de moscas, tejidos humanos y más.

Esta técnica allana el camino para cualquier investigador en cualquier campo. Pueden volver a visitar los conjuntos de datos en línea en nanotomy.org. A continuación, pueden explorar las alteraciones putativas, que van desde la escala nanométrica hasta la milimétrica, y todos los modelos estudiados.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aplicar la nanotomía a su pregunta de investigación y al sistema celular o tisular que está investigando. No olvide que solo un profesional debe preparar la muestra debido a los reactivos tóxicos y a la consideración ética, pero todo el mundo puede probar la nanotomía. org en casa.