Name: A gran escala de barrido Microscopía Electrónica de Transmisión (Nanotomy) de pez cebra cerebrales saludables y lesionados (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Aprende nanotomía a gran escala para estudiar neurodegeneración en cerebros de Danio rerio sanos y lesionados mediante microscopía electrónica de transmisión. Esta técnica permite adquirir imágenes de alta resolución nanométrica.

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Mayor parte del trabajo se ha realizado en el Centro de Microscopía e Imagen UMCG (UMIC), que está patrocinado por NWO 175-010-2009-023 y ZonMW 91.111.006; STW &quot;Valle de Microscopía 12718&quot; para BNGG. Este trabajo fue patrocinado por una subvención ZonMW VENI, una subvención de la integración profesional Marie Curie (ahorro de morir neuronas) y una beca de Alzheimer Nederland a TJvH

Todos los experimentos con larvas de pez cebra fueron aprobados por el Comité de Experimentación Animal de la Universidad de Groningen según las directrices nacionales y de la UE. 1. Preparación de muestras <ol><li> Fijación e inclusión <ol><li> Fijación <ol><li> Anestesiar larvas de peces en tricaína (0,003%) añadido a la (NaCl 5 mM, KCl 0,17 mM, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO 4, HEPES 10 mM, pH 7,6) E3 agua pez cebra y prueba para la profundidad de la anestesia por meter suavemente con una punta de pipeta 200 l bajo microscopio de disección hasta que el movimiento ya no se detectó (Figura 1A). </li><li> Cuando el procesamiento de muestras para EM correlativo después de la adquisición de datos de formación de imágenes in vivo en el uso o formación de imágenes confocal 2 fotón en 1,8% de agarosa como se describe, 5,15 larvas corrección en agarosa usando 4% PFA en PBS que contenía Triton-X-100 (0,05%). </li><li> Cortar las larvas a partir de agarosa y el proceso paraEM-5 a gran escala. </li><li> Fijar larvas en fresco de paraformaldehído al 4% en PBS que contenía Triton-X-100 (0,05%) durante 2 horas a temperatura ambiente en tubos de plástico. Nota: Las células cultivadas en cultivo (in vitro) se puede fijar directamente en glutaraldehído, como se describe en el siguiente paso (1.1.1.5). </li><li> Retire la solución y añadir 100 l 0,5% PFA, 2% de glutaraldehído (GA), y de cacodilato de sodio 0,1 M (pH 7,4). Almacenar durante la noche a 4 ° C. Las muestras de enjuague dos veces en cacodilato de sodio 0,1 M. </li><li> Cortar cabezas de larvas rostral a la parte posterior del cerebro para facilitar la penetración de osmio. Utilice finas jeringas / fórceps. </li><li> Postfix larvas en el 1% tetróxido de osmio (OsO4) /1.5% ferrocianuro de potasio (K 4 [Fe (CN) 6]) en cacodilato de sodio 0,1 M en hielo durante 2 horas y enjuague 3 x 5 min en doble H2O destilada </li><li> Deshidratar en etanol por 20 min incubaciones en concentraciones crecientes de etanol (50%, 70%, 3 veces 100%). </li></ol></li><li>Incorporación <ol><li> Preparar resina epoxi de acuerdo a las recetas estándar que se utilizan en los laboratorios de EM. Nota: Utilizamos resina epoxi de la siguiente manera: la mezcla 19,8 g glycid éter 100, 9,6 g de anhídrido de ácido 2-dodecenilsuccínico y 11,4 g de anhídrido metilnádico usando un agitador magnético. Añadir 0,5 g DMP-30 (tris (dimetilaminometil) fenol) y mezclar de nuevo. </li><li> Incubar toda la noche larvas en resina epoxi 50% en etanol (v / v) mientras gira (RT). </li><li> Reemplazar diluido epoxi-resina con resina pura. Incubar durante 30 min, añadir resina fresca de nuevo y se incuba durante otros 30 min. Una vez más volver a cargar la resina y luego incubar 3 horas a RT, seguido por 15 min a 58 ° C y otra 1 hora a RT bajo baja presión (200 mbar). </li><li> Oriente las cabezas en moldes de incrustación de silicio plana disponibles comercialmente bajo un microscopio de disección con una aguja o un palillo con el anterior orientada hacia el lado del molde o según sea necesario (Figura 1B). </li><li> Polimerizar res epoxien toda la noche a 58 ° C. Si la resina epoxi es todavía demasiado blando permitir que otro día para polimerizar y endurecer a 58 ° C. Prueba de rigidez mediante la aplicación de presión con las pinzas. Si esto deja fácilmente una muesca permite un día más para polimeriza y se endurece a 58 ° C. Cuando la muestra está completamente endurecidos proceder al corte y seccionamiento. </li><li> Recorte el exceso de resina con la colilla usando hojas de afeitar (Figura 1B). </li></ol></li></ol></li><li> Seccionamiento, contraste y montaje <ol><li> Seccionamiento <ol><li> bloque de resina epoxi Sección utilizando un ultramicrotomo. </li><li> Utilice un cuchillo de vidrio o una histoknife diamante para cortar delgadas secciones (500 nm) para el azul de toluidina fucsina / básico (Figura 1D) tinción para detectar la posición correcta. </li><li> Transferencia semi-delgadas secciones sobre portaobjetos de microscopio recogiéndolos con una pipeta Pasteur de vidrio cuya punta ha sido cerrado por la fusión en una llama. Seca sobre una placa caliente uasta sin agua se deja. Mancha durante 10 seg con azul de toluidina al 1% en agua en una placa caliente y después de enjuagar con agua, la mancha durante 10 s con 0,05% fucsina básica en tetraborato de sodio 1%. Examinar con un microscopio óptico normal en 10 veces a 40 veces. </li><li> Cuando se alcanza el sitio / orientación apropiada dentro del cerebro, continuar seccionando el bloque de resina epoxi con un cuchillo de diamante para cortar secciones ultrafinas (~ 70 nm; Figura 1E) </li><li> Utilizar las estructuras anatómicas fácilmente identificables en y alrededor del cerebro, incluyendo fosas olfativas, los ojos, los límites de materia gris-blanco, para identificar la región de interés durante el corte ultra fino y para ajustar el ángulo de corte cuando se inclina la muestra. </li><li> Montar en la sección de redes L2 x 1 cobre de una sola ranura (Figura 1F), para permitir la adquisición ininterrumpida por barras de rejilla. Formvar utilizar rejillas recubiertas para apoyar las secciones. </li></ol></li><li> contrastando <ol><li> cortes ultrafinos de manchas en la parrillas de 2 min en acetato de uranilo al 2% en metanol seguido de Reynolds citrato de plomo para otro 2 min 16. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Adquisición de imágenes <ol><li> STEM gran escala NOTA: Nosotros usamos EM de exploración con un generador de barrido externo capaz de adquirir múltiples grandes campos de visión en alta resolución 3,5,7,17 ​​usando la detección de STEM. Típicamente, una imagen generada de esta manera es equivalente a los campos de visión de ~ 100 imágenes Microscopio Electrónico de Transmisión (TEM), lo que reduce significativamente la cantidad de la costura. <ol><li> Montaje de la muestra en el microscopio <ol><li> Coloque la rejilla con sección en el soporte de la muestra de rejilla múltiple y transferir a la cámara de la SEM. </li></ol></li><li> La alineación del detector de STEM <ol><li> Ponga la rejilla con la muestra bajo la viga y moverlo hacia arriba por lo que será aprox. 5 mm desde el polo de la lente. Adquirir una imagen a 20 kV usandoel detector en-lente. </li><li> Centrarse en el borde de la red y ajustar la distancia de trabajo a 4,0 mm. </li><li> Mueva el soporte de la muestra a una posición segura y llevar en el detector de STEM. </li><li> Centre el orificio del detector de STEM en el campo de la imagen girando los tornillos de ajuste de imagen, mientras que la velocidad máxima con el detector en el objetivo. </li><li> Con cuidado, traer de vuelta el soporte de la muestra que acaba de encajar entre el polo de la lente y el detector. </li><li> Adquirir una imagen con el detector de lente para asegurarse de estar en el área de la sección. </li><li> Cambiar a STEM detección (medio de ganancia y de todos los cuadrantes establecidos en &quot;menos&quot;) y adquirir una imagen y seleccionar el área a digitalizar. </li><li> Elevar el voltaje de aceleración de 21 kV y esperar a la estabilización de la viga (imagen estable de nuevo) y luego ir a 29 kV en pasos de 2 kV. </li></ol></li><li> Adquisición de imágenes <ol><li> Pre-irradiar la muestra (para evitar cambios de brillo causadas por el haz de electrones) por el zoomasí que el área completa que va a escanear se ajusta a la ventana de la imagen. </li><li> Cambiar la apertura a 120 micras (para mantener el rango dinámico adecuado las ganancias detectores tienen que ser reducido a un paso). </li><li> De-foco para que la imagen es borrosa. </li><li> Hacer que el área explorada lo más ajustado posible utilizando la opción de escaneo área reducida. </li><li> Ajuste la velocidad de exploración de tal manera que un fotograma se explora en aprox. 1-2 seg. Nota: Dependiendo del tamaño y el tejido esta toma típicamente ½ hr (100 x 100 FOV micras) hasta un máximo de 3 h (1.000 x 500 micras). </li><li> Zoom al menos 100X y escanear un área pequeña de 10 seg. Nota: Cuando esta área no cambia el brillo en comparación con su entorno, previa a la irradiación es suficiente. </li><li> Traer de vuelta a la abertura de 30 micras (STEM y ganancia en medio) </li><li> Enfoque la muestra. </li><li> Alinear abertura con el elemento oscilante (con un aumento de ~ 40,000X). </li><li> Mientras que en el enfoque seleccionar el área más ligero / función, ajuste la velocidad del análisis que los detallesson visibles. </li><li> En el software de microscopio ajustar el brillo y contraste observando cuidadosamente el histograma para mantener todos los píxeles de la gama dinámica. Haga lo mismo para los más oscuros zona / características. </li><li> Volver a la zona luminosa y puedes volver a intentarlo. Estar en el lado seguro, de modo que hay un poco de espacio en ambos lados del histograma. </li><li> Alejar lo que el área completa que va a escanear se ajusta a la ventana de imagen, e iniciar el programa de adquisición de área grande. </li><li> Use la opción de asistente para configurar un mosaico puede seleccionar un área de la pantalla. Uso tamaño de píxel 2-5 nm dependiendo de qué datos son necesarios. Use el tiempo de permanencia de 3 microsegundos para STEM. </li><li> Seleccione la opción &quot;enfoque automático en el azulejo anterior&quot;, utilice el software de adquisición de enfoque automático de gran escala con ajustes de fábrica por defecto, la casilla de verificación &quot;verificar la configuración antes de la ejecución&quot; y definir dónde guardar los datos. </li><li> Pulse &quot;optimizar&quot; para comprobar los ajustes del microscopio. Nota: Ahora el tiempo necesario será shpropio. Esto podría ser de hasta 72 hr para las zonas 1 x 0,5 mm. </li><li> En la ventana de tipo &quot;resolución máxima de baldosas&quot; 20.000 azulejos de modo individuales no serán más grandes que 20k x 20k, la prevención de los efectos de borde romo. Pulse el botón &quot;ejecutar&quot;. </li><li> Cuando se le preguntó para comprobar el enfoque y el brillo / contraste (B / C), apague el generador de exploración externa y cuidadosamente ajustar el enfoque y el astigmatismo en el software del microscopio. No cambie B / C. Nota: La etapa puede ser movido y ampliación cambiado, pero la ampliación tiene que ser fijado de nuevo al tamaño del pixel deseado. </li><li> Encienda el generador de exploración externa de nuevo y pulse el botón &quot;continuar&quot;. </li></ol></li></ol></li></ol> Análisis 3. Datos <ol style="margin-left: 40px;"><li> Abra programa visor de archivos de EM a gran escala y abrir el archivo &quot;Info mosaico&quot;. Esto abrirá todos los archivos TIF con azulejos. Esto se lleva a cabo preferiblemente en otra estación de trabajo para no obstruir las nuevas adquisiciones. </li><li> opción &#39;au elegirpara coser la totalidad del mosaico (modo de parámetros se superponen en la mitad, cosiendo umbral de 0,90, la reducción de ruido automático. En caso de costura criterios no pueden cumplirse, acercar y colocar manualmente fondo en posición y haga clic en &#39;continuar tal como está). </li><li> Exportar como un archivo html, o alternativamente como una sola TIF. Tenga en cuenta que para exportar TIF podría ser necesaria una reducción de escala. Incluir el tamaño final del pixel en el nombre de archivo que permite mediciones más tarde. </li><li> Realizar anotaciones en el archivo TIF abriéndolo en un programa de edición de imágenes. En paralelo, abra el archivo html con zoom en un navegador web para la observación de resolución óptima. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

EM permite el análisis del contexto celular con una alta resolución de imagen de macromoléculas en contexto biológico. Sin embargo, esto típicamente limita el campo de visión. Mayor escala 3D EM es particularmente adecuado para la conectividad neuronal mediante la creación de mapeo resolución nanoescala 3 reconstrucciones tridimensionales, lo que requiere el procesamiento de datos complejos 10. Por el contrario, 2D gran escala EM requiere solamente una sola sección y la costura de los datos de imagen, y la evaluación de los datos es posible por cualquier persona con acceso a un navegador de Internet. Nosotros y otros previamente usamos EM gran escala para analizar tejidos y animales enteros. En cuanto a la mayoría de los enfoques, TEM y la costura a base de SEM tienen sus propias ventajas. En este caso, se utilizó la transmisión de escaneo EM (STEM) que permite la generación de un gran campo de visión en alta resolución. Típicamente, una imagen de STEM es equivalente a los campos de visión de aproximadamente 100 imágenes de TEM, lo que reduce significativamente la cantidad de costura cuando se generan imágenes grandes fields de vista con alta resolución. Si se necesita una resolución más alta, TEM puede ser ventajoso. STEM tiene la ventaja sobre TEM que las muestras no se pueden utilizar en contraste con un buen contraste ultraestructural 6. Además, el método descrito aquí puede ser simplemente ajustado para su uso con la detección de electrones retrodispersados ​​(BSD) en secciones montadas sobre obleas de sílice, ampliando el uso en varios sistemas de microscopio. Los archivos de EM tejido HTML con zoom son muy útiles para la cuantificación, el intercambio de datos que pueden no haber sido analizado a su contenido completo, que combina LM y datos de EM (CLEM) 8, a efectos de presentación en la investigación científica, para analizar los datos del paciente, y para la educación. Alternativamente, en EM a gran escala en un SEM, pero no en un TEM, obleas de sílice se pueden utilizar, que tiene dos ventajas principales: BSD se puede utilizar, que es más generalmente disponibles en microscopios electrónicos de barrido que el tallo de detección. En segundo lugar, el montaje de grandes secciones (&gt; 1 mm 2 zonas deintereses) es sencillo. Montaje sobre rejillas ranuradas individuales es una labor intensiva y técnicamente desafiante. Comparación detallada entre TEM, SEM y STEM se detalla en otro lugar 6. Una desventaja de las imágenes BSD es que, en comparación con el tallo, las imágenes han aumentado el ruido. Esto en parte se puede compensar mediante el aumento del tiempo de permanencia de píxel, lo que resulta en tiempos de adquisición mucho más largos. Aunque para la preparación de muestras de procesamiento relativamente estándar EM (fijación, inclusión y corte) que se necesita 5-7, es técnicamente difícil de cortar secciones ultrafinas grandes completamente desprovisto de artefactos. Las secciones son muy frágiles, se rompen con facilidad, se pliegan o se destruyen durante la exploración, que por lo general toma varias horas por el conjunto de datos. Sin embargo, debido a la distribución en línea de los datos imparciales primas, debería ser posible comparar más fácilmente con los datos publicados, y utilizar el conjunto de datos publicada en el dominio abierto como controles. En la actualidad, unos dispositivos capaces de EM de laEl análisis RGE escala están en uso, y por lo tanto la accesibilidad a esta técnica es algo limitada, aunque la mayoría de los centros de imágenes celebran los esfuerzos de colaboración. Para las secciones de gran escala el tejido tiene que ser fijado adecuadamente a lo largo de la muestra. Es por ello que se utiliza una mezcla de la rápido pero moderada fijador PFA en combinación con la lenta pero fuerte fijador GA. Cortar y recoger grandes secciones sin artefactos es difícil. Trabajando con las obleas en combinación con BSD es más fácil en comparación con la recogida de las secciones en las redes con un solo orificio. tinción poste de metal pesado es más crítica en comparación con EM clásica. Dado que toda la sección se crea una imagen cada artefacto será visible. TEM usuarios les suele resultar difícil cambiar a un SEM, debido a la diferencia en la operación del microscopio. La cuantificación y el intercambio de datos - La cuantificación de características subcelulares es difícil en un solo EM imágenes. La posibilidad de acercar y alejar de gran escalaimágenes permite fácilmente la identificación de células de interés, que puede ser seguido por mediciones nanoescala dentro de las células. Estos datos indican que determinados tipos de células pueden ser identificados rápidamente y cuantificados de forma imparcial en estas secciones de tejido de gran tamaño, sobre la base de características detectables a diferentes escalas. Por ejemplo microglia se pueden identificar en función de su morfología y citoplasma denso. Posteriormente, al hacer zoom sobre las células individuales, características subcelulares y moleculares a nanoescala de estas células se puede medir en el mismo conjunto de datos, como se mostró anteriormente para la anchura ER dentro de un gran escala tejido EM cultura conjunto de datos 2. Una ventaja adicional de nanotomy es que la celebración de grandes conjuntos de datos en línea escala permitirá a otros, para controlar los datos, tal vez para otras funciones, y sacar sus conclusiones sobre la nueva hipótesis. CLEM - Además de facilitar la EM cuantitativa, EM gran escala hace que sea más fácil para correlacionar la luz microscoetiquetado fotografia a nivel de EM 8. En el presente ejemplo se muestra la presencia de microglia fagocíticas en un modelo de ablación de pez cebra. Una cuestión importante en la neurociencia es lo que las funciones y las contribuciones individuales son de la microglía y los posibles otras fuentes de fagocitosis y las células inmunes. Los primeros estudios han demostrado EM características subcelulares distintivos de microglia en la enfermedad 18. Desafortunadamente, es difícil para etiquetar selectivamente microglia en particular en un entorno patológico, ya que presentan grandes similitudes con otras células inmunes en la expresión génica, morfología y función. Por lo tanto, no está claro si y cuando microglia en el nivel ultraestructural difieren de las células inmunes de otras fuentes incluyendo derivado de monocitos infiltración de macrófagos. La comprensión de si existen diferencias ultraestructurales entre estas células servirá de punto de partida para el análisis de las diferencias funcionales. La combinación de marcadores transgénicos o expresión selectiva y CLEM permite detreflejo de características ultraestructurales selectivas para poblaciones específicas. Diagnóstico y presentación y la educación - Al visualizar a nanoescala microescala dentro de un único conjunto de datos los datos de EM se facilita en gran medida a una amplia audiencia. Con el incremento de posibilidades y herramientas para la EM correlativa y en gran escala anticipamos un renacimiento de EM en la investigación básica y médica. Nuestro método representado aquí se aplica a un modelo de lesión de pez cebra cerebro 5, pero se ha utilizado en el tejido humano 7, cerebro de rata 3, en un modelo de rata para la diabetes 4 y en el cultivo celular 2, y también se puede utilizar en combinación con un TEM enfoque basado en 1 que muestra la versatilidad de este método. El operador del microscopio ya no es altamente grabación seleccionada, y por lo tanto, las imágenes sesgadas, pero todas las numerosas características ultraestructurales se registran y abierto para el análisis de todo el mundo.

los avances técnicos recientes han mejorado la versatilidad, la aplicabilidad y la naturaleza cuantitativa de la EM, lo que lleva a un renacimiento del análisis ultraestructural. Los avances incluyen EM 3D, 2D EM gran escala y la mejora de los métodos y reactivos para correlacionada microscopía óptica y microscopía electrónica (CLEM) para comparar otros modos de análisis microscópico directamente con el nivel de EM 8-10. A gran escala 2D EM es particularmente adecuado para cuantificar o identificar (novela) características de la enfermedad de la patología humana, el estudio de modelos animales para los modelos de enfermedad y de cultivo de tejidos. Debido a la normalmente pequeño campo de vista es difícil correlacionar los cambios en la alta ampliación a una escala amplia de tejido, así como para analizar unbiasedly y cuantitativamente características ultraestructurales. Para el análisis patológico de los tejidos humanos o la evaluación de la patología en modelos animales, hematoxilina y eosina (H &amp; E) de color secciones de parafina embebido fijo formaldehído (FFPE) tisSue es la norma. Además de la simple tinción H &amp; E immunolabeling también se realiza para identificar anormalidades patológicas. Si tales tejidos podrían ser analizados en el nivel EM, tipos de células específicos, y los cambios subcelulares pudieron ser identificados. La naturaleza no sesgada de EM gran escala permite la búsqueda de características inesperadas y novedosas de la enfermedad. Por áreas de gran escala em up a milímetros cuadrados se pueden visualizar. Nanotomy a la rata islotes pancreáticos 4, el cultivo de células 2, 3 ratas cerebro, piel y mucosa 7 y todo larvas de pez cebra 1,5 (www.nanotomy.org) Nosotros y otros aplicados con anterioridad. El pez cebra son muy adecuados para formación de imágenes in vivo, en particular para visualizar los tipos de células que son de difícil acceso en los tejidos de mamíferos incluyendo las células inmunes del cerebro 11. Aquí el procedimiento nanotomy se describe en detalle, se aplica a secciones coronales de cabezas de pez cebra sometidos a ablación neuronal condicional por conversión de metronidazol por neuronalnitrorreductasa expresada (www.nanotomy.org) 5,12-14. Todos los datos en bruto se presenta como archivos HTML con zoom, la visualización molecular para cambiar la escala de los tejidos. La presentación de los datos en bruto permite análisis imparciales de las bases de datos desde otros ángulos de expertos de todo el mundo.

<table><tbody><tr><td><fuerte>químicos</fuerte></td>bajo punto de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>fusión agarosa</td><td>VWR</td><td>444152G</td><td></td></tr><tr><td>tricaine</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>triton-X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>glutaraldehído</td><td>Polysciences</td><td>1909</td><td></td></tr><tr><td>cacodilato de sodio</td><td>Sigma</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>tetróxido de osmio</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>19114</td><td></td></tr><tr><td>ferrocianuro de potasio (K4[Fe(CN)]6)</td><td>Merck</td><td>4984</td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td>VWR</td><td>20821.365</td><td></td></tr><tr><td>acetato de uranilo&nbsp;</td><td>Merck</td><td>8473</td><td></td></tr><tr><td>tetraborato de sodio</td><td>Merck</td><td>1063808</td><td></td></tr><tr><td>azul de toluideno</td><td>Merck</td><td>1273</td><td></td></tr><tr><td>fucsina básica</td><td>BDH</td><td>340324</td><td></td></tr><tr><td>citrato de plomo</td><td>BDH</td><td>descontinuado</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>EPON</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-dodecenilsuccínico anhídrido&nbsp;</td><td>Serva</td><td>20755</td><td></td></tr><tr><td>anhídrido metilnádico</td><td>Serva</td><td>29452</td><td></td></tr><tr><td>éter glicídico 100</td><td>Serva</td><td>21045</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30&nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>553</td><td></td></tr><tr><td>molde de incrustación plano estándar</td><td>Electrónica Microscopy Sciences</td><td>70901</td><td></td></tr><tr><td>cuchillo de diamante</td><td>Diatome Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rejillas de cobre&nbsp;</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica cinta de carbono de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>doble cara&nbsp;</td><td>Microscopía electrónica Ciencias</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de escaneo EM Zeiss Supra55</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ultramicrótomo Leica EM UC7</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>atlas generador de escaneo externo&nbsp;</td><td>Fibics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a gran escala de barrido microscopía electrónica de transmisión (nanotomy) de pez cebra cerebrales saludables y lesionados

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain

A gran escala de microscopía electrónica en 2D (EM), o nanotomy, es la aplicación a nivel de los tejidos de la microscopía electrónica de resolución nanoescala. Los demás y que se aplicaban anteriormente EM gran escala para la piel islotes pancreáticos humanos, cultivo de tejidos y toda larvas de pez cebra 1-7. Aquí se describe un método universalmente aplicable para la exploración EM tejido a gran escala para la detección imparcial de características sub-celulares y moleculares. Nanotomy se aplicó para investigar la sana y un cerebro de pez cebra neurodegenerativa. Nuestro método se basa en los protocolos de preparación de muestras estandarizadas EM: La fijación con glutaraldehído y osmio, seguido de la incrustación de resina epoxi, ultrafina seccionar y el montaje de ultrafinas secciones en las redes de un solo agujero, seguido por el poste de tinción con uranilo y plomo. A gran escala de las imágenes 2D EM mosaico se adquieren mediante un escaneo EM conectado a un generador de exploración amplia zona exterior mediante un ME de transmisión de barrido (STEM). Gran escala EM imágenes son típicamente ~ 5 - 50 G i pixelestamaño n, y se ve mejor usando archivos HTML con zoom, que se pueden abrir en cualquier navegador web, similar a los mapas geográficos HTML en línea. Este método se puede aplicar a tejidos (humanos), secciones transversales de animales enteros, así como el cultivo de tejidos 1-5. Aquí, los cerebros de pez cebra se analizaron en un modelo de ablación neuronal no invasiva. Visualizamos dentro de un solo conjunto de datos de tejido, celular y cambios subcelulares que se puede cuantificar en varios tipos de células incluyendo neuronas y la microglia, macrófagos del cerebro. Además, nanotomy facilita la correlación de EM con microscopía de luz (CLEM) 8 en el mismo tejido, como áreas de superficie grandes de captación de imagen previamente usando microscopía de fluorescencia, posteriormente se puede someter a gran área EM, resultando en la nano-anatomía (nanotomy) de tejidos. En total, nanotomy permite la detección imparcial de las características a nivel de EM de manera cuantificable en todo el tejido.

A gran escala EM conjunto de datos de secciones coronales de la cabeza de larvas de pez cebra de 1 semana de edad, muestra muchos tejidos y características celulares de una imagen a gran escala en el apartado (www.nanotomy.org). Nanotomy de secciones de cerebro de control revela características ultraestructurales típicas de tejido neural del cerebro anterior rostral incluidos los paquetes de olfativas fibra, núcleos neuronales y neuronales sub-compartimientos incluyendo sinapsis (Figura 2A, www.nanotomy.org). tipos de células en la cabeza que se pueden distinguir incluyen condrocitos con grandes vacuolas en la mandíbula inferior, la mielina osmiófilo de las células nerviosas olfativas, células endoteliales de una pequeña embarcación, estructuras incluyen la meninge (el homólogo de pez cebra de las meninges, la envolvente capa membranosa el cerebro de los mamíferos). estructuras subcelulares incluyen el glicocálix de la epidermis, diferentes morfologías nucleares y focos en diferente cel<html> l tipos y organelos, incluyendo aparato de Golgi, el retículo endoplasmático (ER), mitocondrias y vesículas sinápticas y densidades postsinápticas. Inesperadamente los núcleos de las células que recubren el ventrículo son muy densa de electrones en comparación con otras células dispersas más lateralmente en el cerebro. Además, estos núcleos ventriculares muestran focos oscura que están ausentes en otras células en el cerebro y aparecen diferentes en tamaño y estructura de la heterocromatina, que se encuentra en los núcleos de microglia fagocítica (Figura 2). Las células que recubren el ventrículo en el desarrollo de pez cebra se incluyen las células gliales radiales y sobre todo progenitores neuronales, lo que puede reflejar un estado alterado de la cromatina de las células más diferenciadas. A medida que las células madre en el tejido en general son bastante raros, nanotomy para correlacionar etiquetado tejido para marcadores de células madre con escala de tejido, por lo tanto EM que podrían utilizarse para identificar las características ultraestructurales de las células madre. ve_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; EM (www.nanotomy.org) de una sección coronal en una larva de pez cebra de someterse a la ablación neuronal a gran escala revela muchos tejidos específicos, y las características celulares y moleculares que no se encuentran en los animales control. características celulares incluyen microglia fagocítica y vacuolas del tamaño de las células, es probable que representa las células que mueren (Figura 2B, www.nanotomy.org). EM estudios previos han identificado microglia en los vertebrados 18,19. rasgos característicos de microglia incluyen núcleos alargados , grumos de cromatina irregular al lado de la envoltura nuclear, aparato de Golgi prominente, polirribosomas libres, retículo endoplásmico rugoso (ER) con larga cisternas estrecha, citoplasma relativamente oscuro / densa, y numerosas inclusiones, tales como los fagosomas, las gotas de lípidos y los lisosomas. Todos estos sellos, atribuidas a la microglía en los tejidos de mamíferos, también se encontraron en estas células en el cerebro de pez cebra (Figura 2B, www.nanotomy.org). &lt;p class = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53635/53635fig1.jpg" /> Figura 1: Flujo de trabajo de Tejido a gran escala de Microscopía Electrónica de cerebros de pez cebra. (A) 7 días de edad, larvas de pez cebra. (B) cabezas de larvas de pez cebra al lado del otro embebidas en resina epoxi. Cuchillo (C) de cristal por un semi enrarezca el seccionamiento y la orientación de la muestra. (D) sección toluidina semithin Representante azul manchada que muestra dos de lado a lado incrustado larvas de pez cebra. cuchillo (E) de diamante para cortar ultrafinas secciones (70 nm). (F) de imagen editados en (D) de la sección del cerebro de las larvas de pez cebra todo en la parrilla de un solo agujero para indicar posicionamiento. (G) sistema de microscopía utilizado para gran escala 2D EM en este estudio. (H) Flujo de procesamiento de imágenes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53635/53635fig1large.jpg" target="_blank">por favor, haga clic aquí</a>para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53635/53635fig2.jpg" /> . Figura 2: Nanotomy Resultados:. A partir de macromoléculas al tejido (A) Nanotomy del cerebro de los 7 días de control después de la fecundación y (B) tratados (ablación neuronal; Figura 1), que muestra características específicas a la neuronal ablación cerebral degenerativa (B) Estos incluir microglia fagocíticas, células oscuras sometidos a la muerte celular y la apariencia esponjosa de tejido neural ((A) y (B)). Los paneles superiores (adaptado de 5): 10 veces vista ampliada de la región han manifestado en los del centro. paneles Media: 10 veces vista ampliada de la región indican en los paneles inferiores. (A, panel central) de visión de alta magnificación de neurópila mostrando sinapsis en (A, panel inferior), vesículas sinápticas (SVS) yla densidad postsináptica (PD). (B, panel central) de visión de alta magnificación de la microglía ameboide o, posiblemente, un macrófago (panel central, M) que muestra las características típicas amoeboid microgliales (panel inferior), incluyendo aparato de Golgi prominente (G), incluyendo inclusiones vacuolas lisosomales (L). Las barras de escala: 50 micras (parte superior), 5 micras (medio) y 0,5 micras (abajo). Esta cifra se ha modificado desde el 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53635/53635fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura</a> , o visitar la línea de datos completo (nanotomy.org).

La microscopía electrónica (EM) 2D a gran escala, o nanotomía, es la aplicación en todo el tejido de la EM de resolución a nanoescala. Aquí describimos un método universal de nanotomía aplicado para investigar el cerebro de las larvas de pez cebra en la salud y en caso de lesión cerebral no invasiva.

A gran escala de barrido Microscopía Electrónica de Transmisión (Nanotomy) de pez cebra cerebrales saludables y lesionados

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution electron microscopy. Others and we previously ...

El objetivo general de este experimento de microscopía electrónica a gran escala o de nanotomía es definir alteraciones desde el nivel macromolecular hasta el nivel tisular, en este caso concreto, en el cerebro de pez cebra en degeneración. La nanotomía puede ayudar a responder preguntas clave en ciencias de la vida, por ejemplo, en la investigación de la neurodegeneración y de la diabetes tipo 1.La principal ventaja de la nanotomía es que se obtiene información imparcial, que abarca desde macromoléculas, orgánulos, células hasta tejidos. Esto permite la cuantificación y el intercambio de datos de acceso abierto a través de nanotomy.org. Aunque la nanotomía proporciona información sobre el mantenimiento inmunitario y la microglía en el cerebro neurodegenerativo del pez cebra, también se aplica a otros modelos de enfermedades, incluyendo cultivos celulares, ratones e incluso tejidos humanos.Por lo general, los científicos nuevos en esta técnica tienen dificultades porque la cantidad de datos es abrumadora. Esto puede ser mil veces más de lo obtenido con el microscopio electrónico tradicional. Después de fijar las larvas de pez cebra según el protocolo descrito, corte las cabezas larvales rostralmente al cerebelo para facilitar la penetración del osmio. Coloque las larvas en osmio tetroxido al 1%, ferrocianuro potásico al 1,5%, en cacodilato sódico 0,1 molar e incube en hielo durante dos horas.Luego, use agua doblemente destilada para enjuagar los embriones tres veces durante cinco minutos cada vez. Antes de incluirlos, las muestras deben deshidratarse en una serie de etanol. Para incluir los embriones, después de incubarlos en resina epoxi diluida durante la noche según el protocolo descrito, retire la resina diluida y sustitúyala por resina pura.Incube durante 30 minutos, luego reemplace la resina por segunda vez e incube otros 30 minutos. Después de renovar la resina por tercera vez, incube a temperatura ambiente durante tres horas. A continuación, incube a 58 grados Celsius durante 15 minutos.Finalmente, incubar bajo presión baja a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, bajo un microscopio de disección, utilizar una aguja o palillo para orientar las cabezas en moldes de inclusión planos de silicona disponibles comercialmente. Luego, polimerizar la resina epoxi a 58 grados Celsius durante la noche.Una vez que la muestra esté completamente endurecida, utilice cuchillas de afeitar para recortar el exceso de resina del soporte. Para determinar la posición adecuada, use un cuchillo de vidrio o un cuchillo histológico de diamante en un ultramicrotomo para cortar secciones semicortas de larvas para tinción con azul de toluidina/fucsina básica. Transfiera las secciones semicortas a portaobjetos microscópicos recogiéndolas con una pipeta Pasteur de vidrio cuya punta haya sido sellada mediante fusión en una llama.Seque en una placa caliente hasta que no quede agua. A continuación, coloque las muestras en azul de toluidina al 1% en agua e incube las secciones en una placa caliente durante 10 segundos para teñirlas. Luego, después de enjuagar las secciones con agua, use fucsina básica al 0,5% en tetraborato de sodio al 1% para teñir las muestras durante 10 segundos adicionales.Con un microscopio óptico normal a 10X a 40X, examine las muestras. Cuando se alcance el sitio u orientación adecuados, utilice estructuras anatómicas fácilmente identificables, incluyendo las fosas olfatorias, los ojos o los límites entre materia gris y blanca, para identificar la región cerebral de interés durante el corte ultradelgado y para ajustar el ángulo de corte cuando la muestra esté inclinada. Continúe cortando el bloque de resina epóxica con un cuchillo de diamante para obtener secciones ultradelgadas de 70 nanómetros.Monte cada sección en una rejilla de cobre codificada con barras cuadrada L2 por 1 ranura para permitir la adquisición sin interrupciones por las barras de la rejilla. Un milímetro cuadrado puede parecer pequeño. Apenas cabrá en la abertura.De esta manera, evitamos que las barras de la rejilla obstruyan nuestra muestra. Tenga en cuenta que todos los artefactos introducidos en nuestra muestra serán registrados en comparación con el microscopio electrónico tradicional. Contraste las muestras con metales pesados según el protocolo descrito en el texto y almacénelas en una caja de rejillas. Para montar la muestra en el microscopio electrónico de barrido, o SEM, coloque la rejilla desde la caja de transferencia con la sección en el portaobjetos múltiple para rejillas y transfiérala a la cámara del SEM.Después de alinear el detector según el protocolo descrito, preirradiar la muestra alejando la imagen para que toda el área que se escaneará quepa en la ventana de la imagen. Una vez que la abertura se haya cambiado a 120 micrómetros y la imagen se haya desenfocado, utilice la opción de escaneo de área reducida para hacer que el área escaneada sea lo más ajustada posible. A continuación, configure la velocidad de cuadro para escanear cada cuadro en aproximadamente uno o dos segundos.Luego aumente el zoom al menos 100X y examine un área pequeña durante 10 segundos. Si el brillo en el área aún cambia, continúe con la preirradiación. Cuando esta área no cambie en brillo en comparación con sus alrededores, la preirradiación será suficiente.Mientras esté enfocado, seleccione la zona o característica más clara y ajuste la velocidad de escaneo de modo que los detalles sean visibles. En el software del microscopio, ajuste el brillo y el contraste observando cuidadosamente el histograma para mantener todos los píxeles dentro del rango dinámico. Haga lo mismo para las zonas y características más oscuras.Vuelva al área brillante y verifique nuevamente para que haya espacio en ambos lados del histograma. Para los pasos cuatro seis a cuatro ocho, el ajuste del brillo y el contraste debe hacerse con mucha precaución para que toda el área esté dentro del rango dinámico. Reduzca el zoom para que el área completa que se escaneará quepa en la ventana de imagen y comience el programa de adquisición de gran área.Luego, utilice la opción de asistente para configurar un mosaico seleccionando un área de la pantalla. Use un tamaño de píxel de dos a cinco nanómetros, dependiendo de los detalles necesarios, y establezca un tiempo de permanencia de tres microsegundos para la microscopía electrónica de transmisión con barrido, o STEM. Presione optimizar para verificar la configuración del microscopio y se mostrará el tiempo necesario.Luego encienda nuevamente el generador de escaneo externo y presione continuar. Para analizar los datos de STEM, abra un programa visor de archivos de microscopía electrónica a gran escala y abra el archivo llamado información del mosaico, el cual abrirá los archivos tif en mosaico. Elija la opción Unir automáticamente todo el mosaico y seleccione los siguientes parámetros: modo de superposición igual a mitad, umbral de unión igual a 0,90 y reducción de ruido igual a automático.Si no es posible cumplir con los criterios de unión, acerque la imagen y coloque manualmente la tesela en la posición deseada y haga clic en Continuar así. Exporte los datos como un archivo HTML o como un único archivo tif. Incluya el tamaño final del píxel y el nombre del archivo para permitir mediciones posteriores, y luego analice los datos según el protocolo descrito en el texto. Como se muestra aquí, la nanotomía de secciones cerebrales de control revela características ultraestructurales típicas del tejido neural del prosencéfalo rostral, incluyendo haces de fibras olfativas, núcleos neuronales y subcompartimentos neuronales, incluyendo sinapsis.Aquí, las estructuras subcelulares incluyen diferentes morfologías nucleares y focos en diversos tipos celulares y orgánulos, como el aparato de Golgi, el retículo endoplasmático, las mitocondrias, las vesículas sinápticas y las densidades postsinápticas. Inesperadamente, los núcleos de las células que revisten el ventrículo son muy densos al electrón en comparación con otras células dispersas más lateralmente en el cerebro. En la microglía, los núcleos también muestran focos oscuros, posiblemente heterocromatina, que están ausentes en otras células del cerebro.Esta imagen de un EM a gran escala de una sección coronal en una larva de pez cebra sometida a ablación neuronal revela microglía fagocítica. En estas células también se encontraron características propias de la microglía en células de mamíferos, incluyendo un aparato de Golgi prominente y numerosas inclusiones como lisosomas. Una vez dominada, la adquisición puede realizarse en un día, mientras que el EM tradicional le costará al menos una semana.Si bien se intenta este procedimiento, es importante que el operador del microscopio desempeñe un papel crucial para obtener imágenes de alta calidad. Esta no es simplemente una técnica de presionar un botón. Ahora hemos aplicado la nanotomía no solo al modelo de pez cebra de degeneración neural, sino que también la hemos utilizado para la inmunomarcación de células y para estudiar tejidos de moscas, tejidos humanos y más.Esta técnica allana el camino para cualquier investigador en cualquier campo. Pueden revisar los conjuntos de datos en línea en nanotomy.org. Luego pueden explorar alteraciones putativas, que van desde la escala de nanómetros hasta la escala de milímetros, y todos los modelos estudiados.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aplicar la nanotomía a su pregunta de investigación y al sistema celular o tisular que está estudiando. No olvide que solo un profesional debe realizar la preparación de muestras debido a los reactivos tóxicos y a las consideraciones éticas, pero cualquiera puede probar el sitio web nanotomy.org desde casa.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

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Aquí se presenta un protocolo para obtener imágenes in vivo de todo el cerebro de larvas de pez cebra utilizando microscopía de fluorescencia tridimensional. El procedimiento experimental incluye la preparación de muestras, la adquisición de imágenes y la visualización.

In vivo Imágenes de todo el cerebro de larvas de pez cebra usando microscopía de fluorescencia tridimensional

Aprende nanotomía a gran escala para estudiar neurodegeneración en cerebros de Danio rerio sanos y lesionados mediante microscopía electrónica de transmisión. Esta técnica permite adquirir imágenes de alta resolución nanométrica.

A gran escala de barrido Microscopía Electrónica de Transmisión (Nanotomy) de pez cebra cerebrales saludables y lesionados

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