Investigación básica en medicina de Plasma - un enfoque de rendimiento de procesamiento de líquidos a las células

El objetivo general de estos ensayos de secuencia basados en pocillos múltiples es comprender mejor los efectos del plasma físico frío sobre los oxidantes, a las respuestas biológicas in vitro, utilizando espectroscopía de emisiones ópticas, análisis de líquidos y ensayos de actividad celular, microscopía y citometría de flujo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la medicina del plasma, especialmente con respecto a las especies directivas derivadas del plasma, importantes para la inducción de la muerte de las células cancerosas inmunogénicas. La principal ventaja de esta técnica es su enfoque semiautomatizado.

Utiliza placas de 96 pocillos, para aumentar la velocidad y la productividad de la investigación. Las implicaciones de esta técnica se extienden a futuras terapias con plasma, como en dermatología u oncología. Y, ya que proporcionan los medios para identificar las especies directivas derivadas del plasma, que son relevantes para las respuestas biológicas.

La demostración del procedimiento estará a cargo de Felix Niessner, un técnico de nuestro laboratorio. Para el monitoreo de especies de plasma, coloque un chorro de plasma atmosférico frente a un espectrofotómetro de emisiones ópticas, perpendicular al eje de la pluma, y utilice el software dedicado para registrar la fotoemisión y la longitud de onda de cada condición de gas, a un flujo de gas de alimentación estándar de dos litros por minuto. Para el análisis de superóxido tratado con plasma, establezca un protocolo final para la mesa XYZ, con los respectivos tiempos de tratamiento y posiciones de pocillo adecuados.

Luego, agregue 100 microlitros de mezcla maestra recién preparada a los pocillos de una placa transparente de fondo plano de 96 pocillos por triplicado, y use un lector de microplacas para medir la absorbancia a 550 nanómetros. Para analizar los efectos del tratamiento con plasma sobre las respuestas metabólicas celulares, en una campana de flujo laminar, se siembraron una vez 10 a las cuatro células de interés en 100 microlitros de medio de cultivo celular completamente suplementado, por pocillo, en una placa de 96 pocillos de fondo plano, e incubar durante la noche. Después del cultivo nocturno en una incubadora de cultivos celulares, use la mesa XYZ para tratar los pocillos solo con plasma o gas, de acuerdo con el análisis experimental, y devuelva las células a la incubadora durante otras 20 horas.

Al final de la segunda incubación, agregue 25 microlitros de medio de cultivo celular fresco, suplementado con 500 micromolares de Resazurin a las células, así como a los tres pocillos de control de fondo solo con Resazurina. Regrese las células a la incubadora, para una incubación de tres horas. A continuación, mida la fluorescencia en un lector de microplacas.

Para la obtención de imágenes de las células tratadas con plasma, después de leer la fluorescencia, reemplace los sobrenadantes con 100 microlitros de medio de cultivo celular fresco, suplementado con un microgramo por mililitro de yoduro de propidio. Coloque la placa en una platina de microscopio motorizada y seleccione el objetivo de 20x para obtener imágenes de las células. A continuación, utilice el software de análisis de imágenes cuantitativas adecuado para determinar el área citosólica total en las imágenes digitales de contraste de fase, de todos los campos de visión de cada pocillo.

Para el análisis por citometría de flujo de las células tratadas con plasma, después de la toma de imágenes, lavar las células en cada pocillo dos veces con 200 microlitros de PBS, suplementado con calcio y magnesio por lavado, seguido de marcado, con 15 anagramos por mililitro de anticuerpo monoclonal anti-calreticulina de ratón, en 50 microlitros de PBS, más calcio y magnesio por pocillo. Después de 15 minutos en la incubadora de cultivo celular, lave las células dos veces con 200 microlitros de medio de cultivo celular completo y agregue 100 microlitros de solución de desprendimiento celular a cada pocillo durante 20 minutos, a 37 grados centígrados. Cuando las células se hayan desprendido, cargue la placa en el citómetro de flujo y adquiera un mínimo de 1.000 eventos en la población de dispersión frontal y lateral, generalmente asociada con las células viables.

A continuación, utilice el software de análisis de citometría de flujo adecuado para determinar la población de interés y determinar la intensidad de fluorescencia media de la expresión de calreticulina. La espectroscopia de emisiones ópticas se puede utilizar para seguir los distintos picos vinculados a los componentes reactivos del plasma en diferentes condiciones de gas de alimentación. Para el tratamiento con plasma de líquidos, primero se determina la evaporación causada por el gas argón y el plasma de argón, y las condiciones producen diferentes resultados de evaporación, ya que el plasma también ejerce efectos sobre la temperatura.

De manera similar a los resultados de la espectroscopia de emisiones ópticas para radicales hidroxilo, la deposición de peróxido de hidrógeno disminuye significativamente con la mezcla de oxígeno o nitrógeno, pero aumenta con el gas de alimentación humidificado. Además, la adición de nitrógeno al gas de alimentación conduce a concentraciones de nitrato significativamente más altas, en comparación con los líquidos tratados con plasma de argón. La mayor parte del superóxido se produce en condiciones de gas argón seco, con aditivos de oxígeno y/o nitrógeno que apagan significativamente la generación de superóxido, excepto en presencia de plasma de oxígeno argón humidificado.

Las intensidades de fluorescencia de la resazurina y las células tratadas con plasma son similares a los cambios físicos observados visualmente en los sobrenadantes de los cultivos celulares, lo que confirma los efectos citotóxicos del tratamiento prolongado con plasma. También se observa una disminución en el área total de la célula en los pocillos de muestra del tratamiento con plasma, particularmente en las condiciones de gas de alimentación humidificado, con una regulación general al alza de la tinción de calreticulina en las células de melanoma miren, en respuesta a exposiciones más cortas al tratamiento con plasma. Si se realizan correctamente, los ensayos celulares mytoplex y la lectura se pueden completar en solo unas pocas horas.

Siguiendo este procedimiento, también se pueden realizar otros métodos, como el cocultivo con células inmunitarias o el análisis de sobrenadantes de cultivos celulares. Esto ayuda a responder preguntas adicionales sobre la liberación de presas, citoclientes o proteínas redux, así como el reconocimiento inmunitario de las células de melanoma tratadas con plasma. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para futuras investigaciones sobre los ciclos del melanoma, por ejemplo, con esferoides tumorales en 3D.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar investigación básica en medicina del plasma, desde la fase de gas del plasma, sobre moléculas reactivas y líquidos, hasta las respuestas biológicas en las células de melanoma.