Una Cámara de microfluidos Modelo de Flujo de Transfusión de Plaquetas y hemostasia Medidas de deposición de plaquetas y la formación de fibrina en tiempo real

En este trabajo se describe un modelo experimental de la hemostasia que mide simultáneamente la función plaquetaria y la coagulación. Plaquetas y fibrina de fluorescencia se mide en tiempo real, y la tasa de adhesión plaquetaria, la tasa de coagulación, y el inicio de la coagulación se determinan. El modelo se utiliza para determinar las propiedades procoagulantes de plaquetas bajo flujo en concentrados para la transfusión.

El objetivo general de este experimento microfluídico es medir simultáneamente la deposición de plaquetas en la formación de fibrina en una superficie reactiva en condiciones de flujo utilizando microscopía de video en tiempo real. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la medicina transfusional sobre los efectos de la preparación de concentrados de plaquetas en la naturaleza procoagulante de la sangre transfundida. La principal ventaja de esta técnica es que facilita el análisis simultáneo de la función plaquetaria y la coagulación en el flujo, lo que permite examinar la interacción entre ambos procesos.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la procoagulación plaquetaria inducida por la vía de contacto, también se puede aplicar al estudio de la vía extrínseca mediante el recubrimiento con factor tisular lipídico. La demostración del procedimiento estará a cargo de Rosalie Devloo, una técnica del laboratorio. Comience la configuración de la cámara de flujo de microfluídica pipeteando 0,8 microlitros de colágeno recién reconstituido en cinco sextos de la longitud de cada canal en un extremo de un nuevo biochip microfluídico desechable con ocho canales paralelos rectos y etiquetando este extremo del microchip como salida.

Incubar el biochip a cuatro grados centígrados durante al menos cuatro horas en un recipiente humidificado y sellado. Al final de la incubación, llene los canales codificados en un número igual de canales en forma de Y en un biochip de mezcla con tampón de bloqueo. Regrese el microchip al recipiente durante una hora a temperatura ambiente.

Luego, coloque un alfiler en un extremo de dos piezas de tubería de ocho centímetros de largo y una de dos centímetros de largo y en ambos extremos de una pieza de tubería de 46 centímetros de largo para cada canal en uso. A continuación, utilice el software Nanopump para enjuagar todo el fluido de la bomba en el tubo conectado con agua destilada y una jeringa en el pin del conector de la jeringa para llenar todos los demás tubos con tampón de bloqueo. A continuación, fije el biochip codificado en la platina del microscopio automatizado utilizando un gato de tijera de laboratorio para fijar el biochip de mezcla a la misma altura que la platina del microscopio.

Utilice las clavijas de los tubos de ocho centímetros para fijar estos trozos de tubo a la entrada del biochip de mezcla y coloque el extremo libre de cada tubo en un vial de solución salina tamponada HEPES. Ahora, conecte el biochip codificado al biochip de mezcla con la pieza de tubo de 46 centímetros en una línea flexible pero recta. Conecte una clavija del conector de la jeringa al tubo compatible con luer de la bomba de enjuague.

Luego, conecte el pin al extremo libre de la pieza de tubo de dos centímetros y fije el otro extremo del tubo a la salida del biochip codificado. Luego, enjuague todos los tubos y los canales con un mililitro de HBS. Para preparar las bombas de perfusión, abra el software del controlador de la bomba de perfusión microfluídica y haga doble clic en el icono de las jeringas para inicializar las bombas.

Seleccione el tipo de jeringa que se utilizará y desconecte la bomba de enjuague y el tubo de dos centímetros conectado a ella. Conecte el tubo desconectado de dos centímetros con su clavija de conector de jeringa al bloqueo luer de un trozo de tubo de desagüe de paredes gruesas y use una jeringa para llenar el tubo de paredes gruesas con una solución de pepsina estándar. A continuación, fije el extremo abierto del tubo de paredes gruesas con una abrazadera Kocher.

Conecte el tubo a la salida del biochip codificado. Desconecte los dos tubos de la cámara de flujo de mezcla juntos y deseche los recipientes de HBS. Después de obtener la muestra de sangre en recipientes de citrato de sodio evacuados, centrifugar los tubos y transferir el plasma rico en plaquetas a un nuevo tubo de centrifugación.

Vuelva a girar los recipientes con plasma rico en plaquetas. Luego, transfiera el plasma sobrenadante pobre en plaquetas a un tubo centrífugo diferente. A continuación, use una aguja de calibre 21 para perforar el fondo de los recipientes de citrato de sodio para permitir que los glóbulos rojos empaquetados goteen en un nuevo tubo cónico.

Cuando se hayan recogido todos los glóbulos rojos empaquetados, reconstituya suavemente la sangre combinando los glóbulos rojos empaquetados separados con plasma pobre en plaquetas y agregue plaquetas del banco de sangre preparadas para la transfusión para obtener muestras con una concentración de hematocrito del 40% y de 2,5 veces 10 a la quinta plaqueta por microlitro hasta un volumen final de 2,5 mililitros y obtener un hemograma completo. A continuación, agregue 13 microlitros de fibrinógeno marcado con fluoróforos a un tubo cónico de poliestireno. Seguido de un mililitro de la sangre reconstituida.

Mezcle otro mililitro de sangre con dos microlitros de tinte plaquetario fluorescente y agregue las muestras de sangre etiquetadas. Luego, invierta suavemente las muestras de sangre mezcladas e incube las células durante 10 minutos a 37 grados centígrados. Antes de comenzar el ensayo de perfusión, enfoque la óptica del microscopio en las fibras de colágeno adheridas al fondo del primer canal.

Con el software de adquisición, defina una región de interés en el canal seleccionado. Cargue un mililitro de tampón de coagulación precalentado en una jeringa de un mililitro y monte la jeringa en la bomba de perfusión. Después de una segunda inversión suave, cargue la sangre en una jeringa de dos mililitros y monte la jeringa en la bomba de perfusión.

Luego, use una clavija del conector de la jeringa para conectar ambas jeringas a una pieza de tubo de ocho centímetros y cebar los conectores y tubos a 400 microlitros por minuto. Cuando todos los tubos estén llenos de tampón de coagulación o sangre, fije el otro extremo de ambos tubos a las patas divididas del canal en forma de Y en el biochip de mezcla. A continuación, retire la pinza de Kocher en la salida del tubo de desagüe e inicie la perfusión a 4,4 microlitros por minuto para el tampón de coagulación y 44 microlitros por minuto para la sangre reconstituida.

Grabe imágenes cada 10 segundos durante 30 minutos en tiempo real, finalizando las bombas y la adquisición de imágenes después de 30 minutos o cuando la señal se sature. Luego, deseche todos los tubos y jeringas como desechos biopeligrosos. Este video proporciona un excelente ejemplo de la acumulación de trombos plaquetarios y depósito de fibrina.

Al comienzo de la perfusión, las plaquetas se adhirieron a la superficie reactiva, lo que resultó en un aumento constante de la fluorescencia verde registrada. Durante esta fase de adhesión, hay poca fluorescencia violeta, lo que indica que la fibrina está formada solo marginalmente. Al inicio de la coagulación, la violenta fibrina fluorescente se deposita rápidamente y la fluorescencia verde plaquetaria se acumula aproximadamente a la misma velocidad.

Por lo tanto, un momento de inicio de la coagulación puede extrapolarse como un determinante del potencial procoagulante plaquetario. La adición de inhibidor de tripsina de maíz a la sangre reconstituida no afecta a la adhesión plaquetaria, pero la coagulación no se inicia durante toda la duración del experimento de perfusión. Al aumentar el número de plaquetas en una muestra reconstituida, la tasa de adhesión, acumulación y coagulación aumenta linealmente.

El momento de inicio se acorta significativamente al aumentar la concentración de plaquetas, lo que sugiere que se requiere un número umbral de plaquetas depositadas activadas para desencadenar la coagulación. Además, en un análisis emparejado de canales recubiertos solo con colágeno, o en combinación con factor tisular lipídico recombinante, el inicio de la coagulación es significativamente más rápido, aunque ni la tasa general de coagulación ni la acumulación de plaquetas son diferentes entre las condiciones. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un experimento de cámara de flujo microfluídico con sangre reconstituida doblemente marcada para el análisis simultáneo de la función plaquetaria y la coagulación.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la medicina transfusional exploraran las interacciones entre las plaquetas y la coagulación bajo flujo. En este vídeo, nos centramos en demostrar un experimento estandarizado. Pero se pueden introducir cambios en el recubrimiento de la superficie, las tensiones del escudo o la concentración de calcio para responder a preguntas de investigación específicas de interés.