Un método rápido para el procesamiento de sangre para aumentar el rendimiento de los niveles plasmáticos de péptido en la sangre humana

El objetivo general de este método RAPID es mejorar el rendimiento de hormonas peptídicas endógenas que se medirán en la sangre humana. El método RAPID se estableció recientemente para su uso en ratas, y también es adecuado para su uso en sangre humana. El método RAPID mejora el rendimiento y permite la detección de la forma molecular correcta del péptido endógeno.

El método RAPID es fácil de usar. Sin embargo, el método RAPID requiere más tiempo y es más caro en comparación con la muestra de sangre estándar. Por lo tanto, podría ser más aplicable en el entorno de la investigación.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que la dilución oportuna de las muestras, así como la elución, son de gran importancia para garantizar un nivel adecuado de péptidos. Recoja sangre venosa a una hora estandarizada después de un ayuno nocturno de una vena del antebrazo. Y procese de acuerdo con los procedimientos estándar, o el método RAPID.

Instruya a los sujetos para que no hagan ejercicio ni fumen antes de la extracción de sangre. Para el procesamiento estándar, recoja la sangre en tubos refrigerados que contengan EDTA y centrifugue dentro de los 10 minutos a 3000 Gs durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Recoja el sobrenadante y manténgalo a menos 80 grados centígrados hasta su posterior procesamiento mediante radioinmunoensayo.

Para el procesamiento RAPID, diluya inmediatamente la sangre del uno al 10, en tampón RAPID helado. PH tres coma seis, que contiene amoniumasitato molar cero coma uno. Cloruro de sodio molar cero coma cinco e inhibidores enzimáticos.

En 10 minutos, centrifugar la muestra RAPID a 3000 Gs durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y recoger el sobrenadante con una pipeta. A continuación, cargue los cartuchos de cromatografía con actitonitrilo al 100%, a 10 mililitros por minuto. Después del equilibrio con trifluoroacético al 0,1% o TFA.

Cargue con el sobrenadante de muestra RAPID, a una velocidad constante de un mililitro por minuto, utilizando una bomba de jeringa. Después de lavar los cartuchos con tres mililitros de 0,1% de TFA, a 10 mililitros por minuto, eluir lentamente la muestra RAPID con dos mililitros de acetonitrilo al 70% que contengan 0,1% de TFA, a dos mililitros por minuto. Seque las muestras eluidas mediante centrifugación al vacío y almacene a menos 80 grados centígrados, hasta su posterior procesamiento mediante radioinmunoensayo.

Obtener péptidos humanos marcados con yodo 125 radio. Mantenga los péptidos en forma de polvo hasta el experimento. A continuación, diluir en ácido acético al 0,1%.

Para el procesamiento estándar, directamente después de la extracción de sangre, en tubos refrigerados que contienen EDTA, transfiera un mililitro de sangre en un tubo con 50 microlitros de radiomarcado, que contenga de 3000 a 6000 CPM. Para el procesamiento RAPID, transfiera un mililitro de sangre que contenga EDTA a un tubo que contenga nueve mililitros de tampón RAPID, y 500 microlitros de radiomarcaje contienen de 30.000 a 60.000 CPM. Debido a la dilución de uno a 10, utilice un volumen 10 veces mayor de radiomarcaje para el procesamiento RÁPIDO.

Inmediatamente después de aplicar los diferentes pasos del método RAPID, se evalúe la recuperación de péptidos marcados radiactivamente mediante el uso de un contador gamma. No seque las muestras por centrifugación al vacío, y tenga en cuenta que almacene a menos 80 grados centígrados. Para la medición, transfiera el sobrenadante a los tubos que se colocan en el contador gamma.

Y evalúe los recuentos por minuto. Mida todo el sobrenadante en muestras estándar. En muestras RAPID, analice una décima parte del volumen total para lograr una cantidad comparable de radiomarcaje utilizado.

Como estándar al 100%, utilice dos muestras con 50 microlitros de péptido radiomarcado con yodo 125 que no se sometan a procesamiento. Mida la radiactividad de todas las muestras al mismo tiempo. Extraiga la sangre, en tubos refrigerados que contengan EDTA, y transfiera un mililitro a tubos que contengan 200 microlitros de acil grelina radiomarcada, que contenga de 15.000 a 20.000 CPM, para el procesamiento estándar.

Para el procesamiento RAPID, transfiera un mililitro de sangre a un tubo que contenga nueve mililitros de tampón rápido y 200 microlitros de acilgrelina radiomarcada que contenga de 15.000 a 20.000 CPM. Después, procese las muestras como antes. Para un análisis posterior por HPLC de fase reversa, cargue directamente las muestras en una columna de C18 de enlace estable equilibrada en acetonitrilo al 17% en agua suplementada con 0,1% de TFA.

Después de cinco minutos de equilibrio, utilice un gradiente de 17 a 40% de acetonitrilo, para eluir la muestra en 40 minutos, a un mililitro por minuto. Recoja fracciones de un mililitro por minuto y analice la radiactividad con un contador gamma. En un experimento separado, cargue 200 microlitros de acil grelina radiomarcada que contiene de 15.000 a 20.000 CPM directamente en la columna y realice la HPLC como antes.

Para el radioinmunoensayo, descongele los sobrenadantes congelados y el polvo secado al vacío a temperatura ambiente. Inmediatamente antes del radioinmunoensayo, vuelva a suspender las muestras secas de RAPID en agua bidestilada, de acuerdo con el volumen original de plasma. Evalúe la kisspeptina y la grelina total, así como la acil grelina, utilizando radioinmunoensayos comerciales de acuerdo con los protocolos del fabricante.

Utilice tubos de borosilicato que permitan la formación estable de paletas. El primer día, incubar las muestras con tampón de ensayo y cuerpo primario en la dilución proporcionada por el fabricante durante un período de 24 horas. El segundo día, agregue el marcador de yodo 125, vórtice e incube durante un período de 24 horas.

Al tercer día, agregue el reactivo percipitante, el vórtice e incube según lo recomendado por el fabricante. A continuación, centrifugar los tubos a 3.000 Gs durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Retire los sobrenadantes y cuente la radiactividad en las paletas, utilizando un contador gamma.

Calcule la grelina desácil, como la diferencia entre la grelina total menos la grelina de acilo. Evalúa la relación acilo, desacilo grelina, buceando acilo por desacilo grelina para cada muestra individual. Si es posible, procese todas las muestras en un solo lote para evitar la variabilidad entre ensayos.

El procesamiento sanguíneo RAPID aumenta el rendimiento de péptidos radiomarcados con yodo 125 en la sangre humana, en comparación con el procesamiento sanguíneo estándar. Después del procesamiento sanguíneo estándar, la recuperación de péptidos radiomarcados osciló entre el 48% y el 68% en nueve péptidos. El procesamiento RAPID mejoró el rendimiento en todos los péptidos marcados con yodo 125, con una recuperación que osciló entre el 71% y el 98%Aquí se muestra el perfil de elución de la acil grelina marcada con yodo 125 en sangre humana siguiendo el procesamiento sanguíneo estándar o RAPID.

Después del procesamiento RAPID, la grelina marcada con yodo 125 eludió en la posición esperada. Mientras que después del procedimiento estándar, se observó un pico más temprano. Probablemente correspondiente a la grelina de desacilo.

Esto representó una degradación del 62% del péptido. El procesamiento sanguíneo RAPID mejora la proporción de acilo y desacil grelina en comparación con el procesamiento estándar. Después del procesamiento RAPID, la proporción de acilo y desacil grelina en sangre de sujetos de peso normal fue de uno a tres.

En comparación con uno a 23 después del procesamiento estándar de la sangre. Se observaron resultados similares en condiciones anoréxicas y obesas. El procesamiento sanguíneo RAPID da como resultado un aumento de los niveles sanguíneos endógenos de kisspeptina en comparación con el procesamiento estándar.

Tanto en los sujetos anoréxicos como en los de peso normal, los niveles circulantes de kisspeptina endógena fueron significativamente más altos después de RAPID en comparación con el procesamiento estándar. La diferencia no alcanzó significación en condiciones de obesidad. Una vez dominada y realizada correctamente, esta técnica se puede realizar en menos de una hora.

Este método es especialmente importante cuando la concentración esperada del péptido es baja o las diferencias entre los grupos son pequeñas. No se puede dar una recomendación general para los péptidos. El beneficio potencial de cada péptido debe probarse una vez al principio.

Esta técnica allana el camino para que los investigadores de diferentes campos exploren el rendimiento y, lo que es más importante, la forma molecular correcta de las hormonas peptídicas endógenas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aplicar el método RAPID para el procesamiento de sangre en humanos.