En Vitro Modelo de fisiológicos y patológicos de flujo de sangre con aplicación a las investigaciones de remodelado vascular celular

El objetivo general del siguiente experimento es observar los efectos de diferentes patologías de flujo pulsátil en las células endoteliales. In vitro. Esto se logra primero tratando químicamente los portaobjetos de vidrio y recubriéndolos con proteínas para asegurar la adhesión de las células durante la exposición al flujo.

Como segundo paso, se determina el índice de pulsatilidad del flujo, lo que permite comparar el flujo in vitro con los valores descritos en la literatura. Los portaobjetos colocados en la célula siguiente se conectan al sistema de flujo para medir la respuesta de la célula a las patologías de flujo. Los resultados muestran cambios en la morfología y la expresión de proteínas basados en perfiles de flujo mediante microscopía óptica y tinción inmunofluorescente.

La principal ventaja de esta técnica sobre la bomba peristáltica o pulsátil es la capacidad de ajustar la pulsatilidad del flujo para imitar la respuesta enferma o sana. Esto puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la enfermedad arterial. Para comenzar, coloque nuevos portaobjetos de vidrio de 75 milímetros por 50 milímetros por un milímetro en un plato de tinción de portaobjetos de vidrio limpio.

A continuación, añada una cantidad suficiente de una solución de ácido sulfúrico al 20% para sumergir completamente los portaobjetos de vidrio e incubarlos en la solución ácida durante la noche del día siguiente. Lave los portaobjetos tres veces sumergiéndolos en agua desionizada fresca durante cinco minutos cada vez. Una vez enjuagados, sumerja los portaobjetos en acetona durante 30 minutos y luego durante la noche en una solución de selina al 6%3% de tres aminoácidos propil trixi en acetona.

A continuación, enjuague los portaobjetos tres veces con acetona pura durante cinco minutos cambiando la acetona después de cada lavado. A continuación, lave los portaobjetos tres veces en agua desionizada durante cinco minutos, cambiando el agua desionizada después de cada lavado. A continuación, sumerja las láminas en glutaraldehído al 1,5% y déjelas sumergidas durante 60 minutos.

Una vez reticulados, lave los portaobjetos dos veces en agua desionizada, cambiando el agua desionizada Después de cada lavado, luego coloque los portaobjetos en etanol al 70% durante 30 minutos para esterilizarlos. Retire el etanol y permita que cualquier residuo restante se evapore de los portaobjetos. Una vez secos, rehidrate los portaobjetos colocándolos brevemente en agua desionizada estéril.

A continuación, retire el soporte de la corredera y colóquelo en una placa de Petri cuadrada de 100 milímetros por 100 milímetros. En la campana de flujo laminar recubra el portaobjetos funcionalizado con un mililitro de una solución de fibronectina de 25 microgramos por mililitro, cubriendo el área aproximada que estará expuesta a la cámara de cultivo celular. Luego cubra el plato e incube los portaobjetos a 37 grados centígrados durante una o dos horas Después de la incubación, aspire la solución restante y siembre 600, 000 células endoteliales en un mililitro de DMEM con 10% FBS en el lado recubierto del portaobjetos.

Cubra la cámara y luego incube las celdas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 120 minutos. Luego cubra las celdas con medio adicional y continúe incubándolas hasta que estén 70 a 80% confluentes. Conecte el circuito de flujo como se describe en el protocolo de texto adjunto y, como se muestra aquí, asegúrese de que la cámara de amortiguación y el medidor de flujo ultrasónico estén dispuestos en la dirección de flujo correcta.

A continuación, llene el flujo, el circuito y el depósito con agua desionizada. Asegúrese de que el tubo de salida del depósito esté sumergido dentro del volumen del depósito. A continuación, visualice la forma de onda de flujo utilizando un medidor de flujo.

Abra la válvula de liberación de aire en la cámara de amortiguación para cambiar la relación entre el volumen de fluido y aire. Cierre la válvula de liberación de aire a diferentes intervalos de nivel de fluido y calcule el índice de pulsatilidad. Para calcular el índice, evalúe la forma de onda de flujo, ya que el pico representa la VM máx.

El valle representa el v min y la media v es la media del registro de la señal. Los valores del índice de pulsos en un cuaderno. Marque el nivel de líquido y el índice de pulsatilidad resultantes en la cámara de amortiguación con un rotulador de tinta permanente para uso futuro.

Determine los niveles deseados del índice de pulsatilidad a partir de la literatura de patología a la que se hace referencia en el protocolo de texto adjunto mientras prepara el calentamiento de la cámara de flujo. DMEM suplementado con 1%FBS en un baño de agua a 37 grados centígrados. Retire uno de los portaobjetos recubiertos de celda del medio una vez que tengan un 70 a 80% de confluente y coloque una junta en la parte superior del lado asentado de la celda.

A continuación, alinee el canal de vacío de la cámara de flujo con los orificios de la junta. A continuación, conecte el tubo de vacío a los puertos de vacío, asegurándose de que no haya fugas de medios a la aspiradora. Coloque una lámina de policarbonato debajo del portaobjetos de vidrio y sujete el conjunto de la cámara de flujo con una abrazadera de resorte en cada uno de los lados cortos y dos abrazaderas de resorte a lo largo de los lados largos de la cámara de flujo.

A continuación, conecte la cámara de flujo, la entrada y la salida al circuito de flujo. Coloque el sistema de flujo en una incubadora configurada a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono y llene el circuito con el medio precalentado llenando el depósito con el medio y bombeándolo a baja pulsabilidad. Mantenga este flujo durante cuatro horas para preacondicionar las celdas.

A continuación, ajuste el volumen de fluido en la cámara de amortiguación al nivel de índice de pulsatilidad y al cultivo preestablecidos. Las celdas durante la duración deseada. Las células endoteliales que se muestran aquí se cultivaron sin flujo, con flujo constante y flujo pulsátil.

Se pueden observar cambios en la morfología desde la morfología típica de las células endoteliales hasta una morfología más parecida a la del huso después de 24 horas de exposición a un flujo pulsátil alto. Mientras que tanto el flujo estático como el constante muestran poca o ninguna diferencia en la morfología. Las células del músculo liso también se ven afectadas por el cocultivo con las células endoteliales expuestas a un alto flujo pulsátil, como lo indican aquí los diferentes niveles de alfa, músculo liso, actina y cadena pesada de miosina.

A lo largo de las diferentes condiciones de flujo, las células que estuvieron expuestas al flujo pulsátil mostraron las mayores cantidades de ambas proteínas, lo que es indicativo de hipertrofia y contractilidad. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener todos los sellos y asegurarse de que los niveles de líquido permanezcan constantes después de este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como el cocultivo de células endoteliales y células vasculares, para responder a preguntas adicionales, como las interacciones entre células.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo ensamblar el circuito de flujo, controlar el índice y exponer las células endoteliales al flujo pulsátil.