Name: Síntesis de Core-shell dopados con lantánidos Upconversion nanocristales para aplicaciones celulares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 51 s
Description: Aprende a sintetizar nanocristales de conversión ascendente dopados con lantánidos de núcleo-cáscara mediante coprecipitación a alta temperatura. Este método permite modificaciones superficiales biocompatibles para aplicaciones biomédicas celulares.

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Este trabajo fue apoyado parcialmente por NTU-AIT-MUV NAM/16001, RG110/16 (S), (RG 11/13) y (RG 35/15) otorgado en Universidad Tecnológica de Nanyang, Singapur y nacional Ciencias naturales Fundación de China (NSFC) (núm. 51628201).

PRECAUCIÓN: consulte todas las hojas de datos de seguridad del material (MSDS) antes de su uso. Utilice todas las prácticas de seguridad apropiadas cuando se realiza la síntesis de UCNs a temperatura elevada (~ 290 ° C), incluyendo el uso de controles de ingeniería (campana extractora) y equipo de protección personal (p. ej., gafas, guantes, bata de laboratorio, Pantalón largo y zapatos cerrados).
 1. síntesis de NaYF 4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%) @NaYF 4: nanocristales de core-shell de Nd(20%) <ol><li>síntesis de NaYF 4: nanoestructuras de base Yb/Tm/Nd(30/0.5/1%) <ol><li> Preparación de los RE (CH 3 CO 2) 3, solución stock de NaOH, NH 4 F metanol Nota: las tierras raras (RE) los iones lantánidos son itrio (Y), el iterbio (Yb), el Thulium (Tm) y el neodimio (Nd).
		<ol><li>Disolver 500 mg Yttrium(III) acetato hidrato en 5 mL de metanol (100 mg/mL), 250 mg hidroxiacetato hidrato de iterbio (III) en 5 mL de metanol (50 mg/mL), hidrato de acetato de Tulio (III) en 1 mL de metanol (10 mg/mL), de 10 mg y 10 mg hidroxiacetato hidrato de neodimio (III) en 1 mL metha Nol (10 mg/mL) en viales de vidrio con un baño de limpieza ultrasónico de 2 minutos</li>
			<li>Combina 400 mg de NaOH en un tubo de centrífuga de 50 mL con 20 mL de metanol con baño ultrasónico de limpieza para preparar la solución madre de NaOH (20 mg/mL).</li>
			<li>Combinar 600 mg NH 4 F en un tubo de centrífuga de 50 mL con 30 mL de metanol con baño de limpieza ultrasonidos para preparar NH 4 F solución (20 mg/mL). 
			Nota: Coloque la solución de los complejos de lantánidos, NaOH y NH 4 F en viales de vidrio, sellar con parafilm y almacenar en un refrigerador a ~ 4 ° C hasta que se necesite. Las soluciones stock de metanol preparado son reemplazadas una vez cada 2 semanas.</li>
		</ol></li> <li>Preparación de NaYF 4: Yb/Tm/Nd núcleo nanoestructura <ol><li>pipetear 3 mL de ácido oleico y 7 mL de 1-Octadeceno en un matraz de tres-cuello 50 mL.</li>
			Solución de <li>combinar 1.089 mL de la Y (CH 3 CO 2) 3 solución madre, 0,608 mL del Yb (CH 3 CO 2) 3 solución madre, 83,6 μl del stock 3 Tm (CH 3 CO 2), y 128,5 μl de la solución madre de Nd (CH 3 CO 2) 3 en el matraz.</li>
			<li>Colocar un termómetro (rango de 0 - de 360 ° C) en el frasco y que su punta toque la solución. Colocar el matraz en un recipiente de vidrio con aceite de silicona phenylmethyl.</li>
			<li>Calentar la solución a 100 ° C con una placa de evaporación de metanol. Conectar el matraz a una línea de Schlenk con un colector de doble vacío/gas para eliminar el metanol residual y mantener la mezcla de reacción bajo vacío durante 2-3 minutos removiendo.</li>
			<li>Aumentar la temperatura a 150 ° C y mantener esta temperatura durante 60 minutos mantener una velocidad de 700 rpm de agitación durante la síntesis. 
			Nota: Ajustar una moderada velocidad de agitación para evitar salpicaduras de la solución.</li>
			<li>Deje la placa y mantener el frasco a temperatura ambiente para permitir la solución enfríe lentamente. 
			Nota: El protocolo puede ser una pausa aquí.</li>
			Solución <li>combinar 2 mL de NaOH metanol y 2,965 mL de NH 4 solución metanol F en un tubo de centrífuga de 15 mL. Apriete el tubo con la tapa y mezcle la solución potente mezcla en Vortex durante 5 s.</li>
			<li>Agregar la mezcla de F 4 NH NaOH lentamente en el matraz con una pipeta de vidrio durante 5 min.</li>
			<li>Aumentar la temperatura de la mezcla a 50 ° C y mantener esta temperatura durante 30 minutos 
			Nota: Ajuste la temperatura a no más de 50 ° C debido a la alta temperatura promoverá cristal nucleación y crecimiento.</li>
			<li>Aumentar la temperatura (~ 100 ° C) para evaporar de metanol y conectar el matraz a una línea de Schlenk con un colector de doble vacío/gas para eliminar el metanol residual y mantener la mezcla de reacción bajo vacío para 2-3 min.</li>
			<li>Cambiar la posición de la llave de paso para llenar el matraz con el nitrógeno.</li>
			<li>Aumento de la temperatura hasta 290 ° C con una velocidad de calentamiento de ~ 5 ° C/min que la mezcla de reacción a 290 ° C 1,5 h.</li>
			<li>Deje la placa caliente y retire el matraz para permitir la mezcla de reacción se enfríe lentamente en temperatura agitación. 
			PRECAUCIÓN: Tenga cuidado de la placa caliente con temperatura alta (&#62; 400 ° C) para evitar quemaduras graves en contacto con la piel.</li>
			<li>Transferencia de la mezcla en el frasco en un tubo de centrífuga de 50 mL. Enjuagar el matraz con 30 mL de etanol y transferir la solución al tubo de centrífuga.</li>
			<li>Centrifugar el producto a 4.000 x g por 8 min a temperatura ambiente y descarte el sobrenadante.</li>
			<li>Añadir 10 mL de hexano al tubo de centrífuga y volver a dispersar el producto con la sonicación (60 kHz, 240 W) durante 2 min.</li>
			<li>Añadir 30 mL de etanol al tubo. Desactivación del producto a 4.000 x g por 8 min y entonces descarte el sobrenadante.</li>
			<li>Volver a dispersar los productos sólidos en el fondo del tubo de centrífuga con 5 mL de hexano. Almacene la solución en un refrigerador a ~ 4 ° C para un siguiente paso. 
			Nota: La emisión de la conversión ascendente de UCNs core-shell es probada por las soluciones de irradiación con un 808 nm láser (2 W).</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Preparación de NaYF 4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%) @NaYF 4: nanocristales de core-shell de Nd(20%) <ol><li>3 mL de ácido oleico y 7 mL de 1-Octadeceno se combinan en un matraz de 50 mL tres-cuello. Añadir 1,082 mL de la solución 3 Y (CH 3 CO 2) y 2,87 mL de la solución madre de Nd (CH 3 CO 2) 3 en el matraz.</li>
		<li>Añadir la nanoestructura de núcleo obtenida (80 mg en 5 mL de hexano de paso 1.1.2.18) en el frasco mientras que revuelve.</li>
		<li>Colocar un termómetro (rango de 0 - de 360 ° C) en el frasco y que su punta toque la mezcla. Colocar el matraz en un recipiente de vidrio con aceite de silicona phenylmethyl.</li>
		<li>Calentar la mezcla a 100 ° C en la parte superior de la placa caliente para evaporar el metanol y hexano. Conectar el matraz a una línea de Schlenk con un colector de doble vacío/gas para eliminar el solvente residual y mantener la mezcla de reacción bajo vacío durante 2-3 minutos removiendo.</li>
		<li>Aumentar la temperatura a 150 ° C y mantener durante 60 minutos mantener la velocidad de agitación a 700 rpm en la síntesis de. 
		Nota: Ajustar una moderada velocidad de agitación para evitar salpicaduras de la solución.</li>
		<li>Deje la placa caliente y retire el matraz para permitir que la solución se enfríe lentamente a temperatura ambiente. 
		Nota: El protocolo puede ser una pausa aquí.</li>
		Solución <li>pipeta 2 mL de NaOH metanol y 2,965 mL de NH 4 solución metanol F en un tubo de centrífuga de 15 mL. Apriete el tubo con la tapa y mezcle la solución potente mezcla en Vortex durante 5 s.</li>
		<li>Agregar la mezcla en el matraz con una pipeta de vidrio poco a poco más de 5 min.</li>
		<li>Aumentar la temperatura de la mezcla a 50 ° C y mantener a 50 ° C durante 30 minutos 
		Nota: Ajuste la temperatura no superior a 50 ° C debido a la alta temperatura promoverá cristal nucleación y crecimiento.</li>
		<li>Aumentar la temperatura (~ 100 ° C) para evaporar de metanol y conectar el matraz a una línea de Schlenk con un colector de doble vacío/gas para eliminar el metanol residual, manteniendo la mezcla de reacción bajo vacío para 2-3 min.</li>
		<li>Cambiar la posición de la llave de paso para llenar el matraz con el nitrógeno.</li>
		<li>Aumento de la temperatura hasta 290 ° C con una velocidad de calentamiento de ~ 5 ° C/min que la mezcla de reacción a 290 ° C 1,5 h.</li>
		<li>Deje la placa caliente y retire el matraz para permitir la mezcla de reacción se enfríe lentamente a temperatura ambiente mientras que revuelve. 
		PRECAUCIÓN: Tenga cuidado de la placa caliente con temperatura alta (&#62; 400 ° C) para evitar quemaduras graves en contacto con la piel.</li>
		<li>Transferencia de la mezcla en el frasco en un tubo de centrífuga de 50 mL. Enjuagar el matraz con 30 mL de etanol y transferir la solución al tubo de centrífuga.</li>
		<li>Centrifugar el producto a 4.000 x g por 8 min a temperatura ambiente y descarte el sobrenadante.</li>
		<li>Añadir 10 mL de hexano al tubo de centrífuga y volver a dispersar el producto con la sonicación (60 kHz, 240 W) durante 2 min.</li>
		<li>Añadir 30 mL de etanol al tubo. Desactivación del producto a 4.000 x g por 8 min y entonces descarte el sobrenadante.</li>
		<li>Volver a dispersar los productos sólidos en el fondo del tubo de centrífuga con 5 mL de hexano. Almacene la solución en un refrigerador a ~ 4 ° C hasta que sea necesario. 
		Nota: La emisión de la conversión ascendente de UCNs core-shell es probada por las soluciones de irradiación con un 808 nm láser (2 W).</li>
	</ol></li></ol> 2. Síntesis de nanoestructuras de UCNs biocompatibles <ol><li>preparación de nanopartículas de UCNs ligando libre <ol><li>combinar 30 mL de etanol con el preparado como oleato-capped UCNs solución (paso 1.2.18) en un tubo de centrífuga de 50 mL. Centrifugar la mezcla a 4.000 x g por 8 min a temperatura ambiente y descarte el sobrenadante.</li>
		<li>Combinar 10 mL solución acuosa ácida (pH = 4) ajustada por ácido clorhídrico (0.1m) con el precipitado en el tubo de centrífuga de 50 mL y disolver el precipitado por sonicación (60 kHz, 240 W) durante 30 minutos</li>
		<li>Transferencia del frasco de la solución en un vaso con vigorosa agitación durante 2 h.</li>
		<li>Extracto de la solución acuosa con 30 mL de éter dietílico para quitar el ácido de oleico, repetir tres veces.</li>
		<li>Añadir 10 mL de agua en las capas de éter combinado con suave agitación.</li>
		<li>Recoger la acuosa fase juntos (20 mL) y añadir acetona 20 mL con Vortex durante 5 s.</li>
		<li>Vuelta abajo el producto a 35.000 × g por 10 min y luego descartar el sobrenadante. Disolver el precipitado en 2 mL de agua.</li>
	</ol></li> <li>Preparación de polímero modificado UCNs (PAA-UCNs) <ol><li>combinar 200 mg de ácido poliacrílico (PAA, Mw = 1.800) con 20 mL de agua por sonicación (60 kHz, 240 W) durante 20 min agregar el mencionado UCNs ligando libre en la solución PAA con agitación vigorosa.</li>
		<li>Ajustar el pH a 7,4 con solución de NaOH (1 M) con sonicación (60 kHz, 240 W) de 30 minutos que la mezcla por 24 h a temperatura ambiente mientras que revuelve.</li>
		<li>Recoger el precipitado por centrifugación a 35.000 × g por 10 minutos vuelva a suspender el producto en 10 mL de agua por sonicación (60 kHz, 240 W) por 5 min y centrifugar nuevamente a 35.000 × g por 10 min repiten este paso tres veces.</li>
		<li>Volver a dispersar el producto en 8 mL de agua por sonicación (60 kHz, 240 W) para 5 minutos almacene la solución en un refrigerador a ~ 4 ° C hasta que sea necesario.</li>
	</ol></li> <li>Preparación de nanopartículas de UCNs DBCO funcional <ol><li>giro de la PAA@UCNs como preparado (1 mg) por centrifugación a 35.000 × g por 10 minutos Resuspender el precipitado en 1 mL seco DMF por sonicación (60 kHz, 240 W) durante 1 min. y centrifugar nuevamente a 35.000 × g durante 10 minutos repetir este paso dos veces.</li>
		Disolver el precipitado en 200 μL de <li>seco DMF en un frasco de vidrio. Añadir TOHB (12,2 mg), EDC (14 mg), DBCO-NH 2 (5 mg) y DIPEA (16 μL) en el frasco con agitación magnética de 24 h.</li>
		<li>Recoger el producto por centrifugación a 35.000 × g por 10 minutos quite el sobrenadante y resuspender el precipitado en 1 mL de DMSO y centrifugar nuevamente a 35.000 × g por 10 min Repita este paso tres veces.</li>
		<li>De la dispersión del producto en DMSO 0.2 mL y almacenar en un refrigerador a ~ 4 ° C antes de su uso.</li>
	</ol></li></ol> 3. Bioapplications de la DBCO-UCNs en los canales de regulación de membrana en las células de vida <ol><li>cultura la HEK293 células Dulbecco &#39; s Modified Eagle &#39; s medio (DMEM) suplementado con 10% FBS, 100 unidades/mL de penicilina, estreptomicina 100 μg/mL y mantienen en una incubadora humidificada con 5% CO 2 en las células de semillas de C. 1 × 10 5 37 en 1 mL DMEM/pozo de una placa de 12 pozos y mantenerlo en la incubadora durante 24 h.</li>
	<li>Combinan el plásmido (pCAGGS-ChR2-Venus, 1 μg) con el reactivo de transfección de P3000 (2 μL) en Eagle &#39; s medio esencial mínimo (MEM) (100 μL) tubo de microcentrífuga y añadir Reactivo de transfección (1,5 μl) en MEM (100 μL) en el tubo B. </li> <li>Incubar la mezcla de soluciones en los tubos A y B durante 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>La solución en el tubo A y B se combinan con 400 μL de MEM. Lavar las células con 1 mL de DMEM libre de suero dos veces.</li>
	<li>Añadir la mezcla de transfección de 600 μL en cada pocillo de una placa de 12 pozos e incubar las células en incubadora de 37 ° C por 4 h. quitar el medio y lavar dos veces con 1 mL DMEM.</li>
	<li>Añadir 1 mL de DMEM que contiene 1 μl Ac 4 ManNAz (50 mM en DMSO) en el pozo y mantenerlo en la incubadora por 2 días.</li>
	<li>Quitar el medio y lavar una vez con 1 mL de PBS. Añadir 1 mL de solución de tripsina-EDTA (0.25%) en cada pocillo de la placa de 12 pozos e incubar a 37 ° C hasta que las células han separado (~ 2 minutos). Volver a cultura las células en un plato confocal en el 1 × 10 5 células/pozo en 1 mL DMEM para pasar la noche.</li>
	<li>Quite el medio y añadir 1 mL de DMEM fresco con 2 μl DBCO-UCNs (50 mg/mL) en el plato por 2 h a 37 ° C. Para la proyección de imagen confocal, lavan las células dos veces con DMEM y añadir 1 μl Rhod-N 3 (10 mM) para 30 minutos</li>
	<li>Para el análisis de calcio intracelular, incubar las células con la mezcla de 1 μl de Rhod-3 AM (10 mM), 10 μl probenecida (250 mM) y 10 μl de tampón de carga (Pluronic surfactante polyols,0.1% w/v)) en medio DMEM de 1 mL por 30 min en la oscuridad.</li>
	<li>Lavar las células con DMEM libre de suero e irradiar con luz NIR de 808 nm en la dosis de 0,8 W/cm 2 durante 20 minutos (rotura de 5 min después de 5 min iluminación).</li>
	<li>Registrar los resultados de los proyección de imagen en el microscopio confocal (fuente de laser: 561 nm láser, rango de detector: 610/75 nm; objetivo: 100 x 1.4 NA aceite, tiempo de exposición: 100 ms). Añadir 1 mL de solución de tripsina-EDTA (0.25%) en cada pocillo e incubar a 37 ° C hasta que las células han separado (~ 2 minutos). Resuspenda las células en 1 mL de PBS para el análisis de flujo cytometry (FCM) (Ex: 561 nm, Em: 582/15 nm).</li>
</ol>

<ol><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+upconversion+through+energy+migration+in+core-shell+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Tuning upconversion through energy migration in core-shell nanoparticles.</a> Nat Mater. 10 (12), 968-973 (2011).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplified+stimulated+emission+in+upconversion+nanoparticles+for+super-resolution+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Amplified stimulated emission in upconversion nanoparticles for super-resolution nanoscopy.</a> Nature. 543 (7644), 229-233 (2017).</li>
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</ol>

No tenemos nada que revelar.

Este artículo presenta un método para la síntesis de core-shell dopados con lantánidos upconversion nanocristales (UCNs) y su modificación superficial con grupos funcionales para aplicaciones de celulares. Este nuevo nanomaterial posee excepcionales propiedades ópticas, que pueden emitir rayos UV y luz visible sobre excitación luz NIR a través de un proceso de conversión ascendente del multi-photon. En el presente Protocolo, las nanoestructuras de UCNs core-shell (NaYF4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%)@NaYF4: ...

En los últimos años, Nanocristales de upconversion dopados con lantánidos (UCNs) han sido ampliamente utilizados como una alternativa a los colorantes orgánicos convencionales y puntos cuánticos aplicaciones biomédicas, que se basan principalmente en su excelente química y propiedades ópticas, incluyendo gran biocompatibilidad, alta resistencia al fotoblanqueo y emisiones de banda estrecha1,2,3. Más importante aún, puede servir como un nanotransducer prometedor con tejido excelente penetración profundidad en vivo para convertir excitación de infrarrojo cercano (NIR) en una amplia gama de emisiones de la UV, visible y las regiones NIR a través de un multi-photon proceso de conversión ascendente de4,5. Estas características únicas hacen UCNs dopados con lantánidos servir como un vector especialmente prometedor para la detección biológica, la proyección de imagen biomédica y enfermedades teranosis6,7,8.
Los componentes generales de UCNs se basan principalmente en los iones lantánidos dopado en la matriz de host aislante que contiene un activador (por ejemplo, Yb3 +, Nd3 +) y un activador (por ejemplo, Tm3 +, Er3 +, Ho 3 +) en el cristal homogéneo9. La diferente óptica de emisión de los nanocristales se atribuye a la transición electrónica localizada dentro de los 4 orbitalesf de los dopantes de lantánido debido a su nivel de energía dispuesta como escala10. Por lo tanto, es fundamental para controlar con precisión el tamaño y la morfología de UCNs sintetizados con dopantes lantánido multicomponente. Por la derecha, algunos métodos prometedores han sido bien establecidas para la preparación de UCNs dopados con lantánidos, incluyendo descomposición térmica, alta temperatura Co-precipitación, síntesis hidrotermal, proceso sol-gel, etc.11 , 12 , 13 entre estos enfoques, el método de coprecipitación de alta temperatura es una de las estrategias más populares y convenientes para UCNs síntesis, que pueden ser controlados estrictamente para preparar deseado nanocristales de alta calidad con forma uniforme y distribución de tamaño en un relativamente corto tiempo de reacción y de bajo costo14. Sin embargo, mayoría nanoestructuras sintetizadas por este método están capped principalmente con ligandos hidrofóbicos tales como ácido oleico y oleylamine, que generalmente dificultan su bioapplication más debido a la limitada solubilidad del ligando hidrofóbico en solución acuosa 15. por lo tanto, es necesario realizar técnicas de modificación superficial adecuado para preparar UCNs biocompatibles en usos biológicos in vitro e in vivo.
Adjunto, presentamos el detallado procedimiento experimental para la síntesis de nanoestructuras de UCNs core-shell mediante el método de coprecipitación de alta temperatura y una técnica de modificación factible para funcionalizar polímero biocompatible en la superficie de UCNs para aplicaciones de celulares más. Este nanoplatform UCNs incorpora tres iones lantánidos (Yb3 +y3 +y Tm3 +) de los nanocristales para adquirir fuerte emisión azul (~ 480 nm) sobre excitación luz NIR a 808 nm, que tiene mayor profundidad de penetración en tejido vivo. Es bien sabido que Nd3 +-dopados UCNs mostrar efectos de absorción y calentamiento de agua minimizado en esta ventana espectral (808 nm) en comparación con el convencionales UCNs a 980 nm irradiación16,17, 18. Además, para utilizar el UCNs en sistemas biológicos, en primer lugar se quitan los ligandos hidrofóbicos (ácido oleico) en la superficie de UCNs por sonicación en solución ácida19. El ligando libre UCNs más se modifican con un polímero biocompatible (ácido poliacrílico, PAA) para la adquisición de gran solubilidad en soluciones acuosas20. Además, como una prueba de concepto en aplicaciones celulares, UCNs hidrofílicas son más funcionalizados con ligandos moleculares (cyclooctyne de dibencilo, DBCO) para una localización específica en el N3-etiqueta de la membrana de la célula. A luz NIR (808 nm) la irradiación, la emisión azul convertida a 480 nm puede activar con eficacia una proteína canal luz-bloqueado, channelrhodopsins-2 (ChR2), en la superficie de la célula y facilitar así la afluencia de cationes(por ejemplo, el ión Ca2 + ) a través de la membrana de las células vivas.
Este protocolo de video proporciona una metodología factible para la síntesis de UCNs dopados con lantánidos, modificación superficial biocompatible y bioapplication UCNs en células vivas. Las diferencias en las técnicas de síntesis y los reactivos químicos utilizados en crecimiento nanocrystal influirá el tamaño upconversion, morfología y distribución luminiscencia (UCL) espectros de nanoestructuras de UCNs final utilizado en experimentos de la célula. Este protocolo video detallado está preparado para ayudar a nuevos investigadores en este campo para mejorar la reproducibilidad de UCNs con el método de coprecipitación de alta temperatura y evitar los errores más comunes en UCNs modificación superficial biocompatible para más aplicaciones celulares.

<table><tbody><tr><td>1-Octadeceno</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O806</td><td></td></tr><tr><td>Ácido oleico</td> de grado técnico <td>Sigma Aldrich</td><td>364525</td><td>Grado técnico</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412</td><td>Grado técnico</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A405</td><td>Grado técnico</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Fisher Scientific</td><td>A18</td><td>Grado técnico</td></tr><tr><td>Hexano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H292</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de tulio (III) de grado técnico hidrato (Tm(CH3CO2)3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>367702</td><td>base de 99,9% de metales traza</td></tr><tr><td>Acetato de neodimio (III) hidrato (Nd(CH3CO<>2)3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>325805</td><td>99,9% de metales traza base</td></tr><tr><td>de acetato de iterbio (III) hidrato (Yb(CH3CO2)3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>326011</td><td>99,9% de metales traza base</td></tr><tr><td>Acetato de itrio (III) hidrato (Y(CH3CO<>2)3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>326046</td><td>base de 99,9% de metales traza</td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio (NaOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5881</td><td>grado reactivo</td></tr><tr><td>Fluoruro de amonio (NH4F)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>338869</td><td>reactivo ACS</td></tr><tr><td>Cloruro de hidrógeno (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144</td><td>grado</td></tr><tr><td>reactivo ácido poliacrílico (PAA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>323667</td><td>promedio Mw 1800</td></tr><tr><td>1-hidroxibenzotriazol hidrato (HOBT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>54802</td><td>Reactivo ACS</td></tr><tr><td>Clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropilo)carbodiimida (EDC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7750</td> grado <td>comercial</td></tr><tr><td>Dibenzociclooctino-amina (DBCO-NH2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>761540</td><td>ACS reactivo</td></tr><tr><td>N,N-diisopropiletilamina (DIPEA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D125806</td><td>reactivo ACS</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231</td><td></td></tr><tr><td>Línea celular HEK293</td> de grado técnico <td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td>riñón embrionario humano</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1051</td><td>ACS reactivo</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td>10.000 U/mL</td></tr><tr><td>plásmido (pCAGGS-ChR2-Venus)</td><td>Addgene</td><td>15753</td><td>Plásmido enviado como bacteria en agar puñalada</td></tr><tr><td>Dulbecco's Medio de Águila Modificado (DMEM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11965092</td><td>Alta Glucosa</td></tr><tr><td>Opti-Medio de Águila Modificado (MEM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>51985034</td><td>Medio de Suero Reducido</td></tr><tr><td>Lipofectamina 3000 Reactivo de Transfección</td><td>Thermo Fisher</td><td>L3000015</td><td>A Base de Lípidos</td></tr><tr><td>N-Azidoacetilmannosamina, Acetilada (Ac4ManNAz)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7605</td><td>Reactivo ACS</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>Thermo Fisher</td><td>25200056</td><td>Rojo de fenol</td></tr><tr><td>Rhod-3 AM Kit de imagen de calcio</td><td>Thermo Fisher</td><td>R10145</td><td>Colorante de fluorescencia</td></tr><tr><td>5-carboxitetrametilrodamina-azida (Rhod-N3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>760757</td><td>Azida-fluor 545</td></tr><tr><td>Plato confical</td><td>ibidi GmbH</td><td>81158</td><td>Fondo de vidrio, 35 mm</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cónicos de 50 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>Polipropileno</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cónicos de 15 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>Polipropileno Tubos</td>de</tr><tr><td>microcentrífuga cónicos de 1,5 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>616201</td><td>Polipropileno</td></tr><tr><td>Aceite de silicona de fenilmetilo</td><td>Productos</td><td>Clearco 63148-52-7</td><td>Menos de 320 grados centígrados</td></tr><tr><td>Termómetro de vidrio</td><td>GH Zeal</td><td>L0111/10</td><td>De -10 a 360 grados</td></tr><tr><td>Celsius Placa de 12 pocillos</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z707775</td><td>Poliestireno</td></tr></tbody></table>

síntesis de core-shell dopados con lantánidos upconversion nanocristales para aplicaciones celulares

Synthesis of Core-shell Lanthanide-doped Upconversion Nanocrystals for Cellular Applications

Nanocristales de upconversion dopados con lantánidos (UCNs) han atraído mucha atención en los últimos años basados en sus propiedades ópticas controlables y prometedoras, que permiten la absorción de luz de infrarrojo cercano (NIR) y posteriormente se pueden convertir en multiplexado de las emisiones que se extienden sobre una amplia gama de regiones de la UV a la visible a NIR. Este artículo presenta detallados procedimientos experimentales para la síntesis de la coprecipitación de alta temperatura de UCNs core-shell que incorporar iones lantánidos diferentes de nanocristales para convertir eficientemente la excitación de NIR penetrable de tejido profundo (808 nm) en una emisión de azul fuerte a 480 nm. Controlando la modificación superficial con polímero biocompatible (ácido poliacrílico, PAA), el preparado como UCNs adquiere gran solubilidad en soluciones tampón. Los nanocristales hidrofílicas son más funcionalizados con ligandos específicos (cyclooctyne de dibencilo, DBCO) para la localización en la membrana celular. A luz NIR (808 nm) la irradiación, la emisión convertida azul puede activar con eficacia la proteína de canal luz-bloqueado en la membrana celular y regula específicamente la afluencia de cationes (p. ej., Ca2 +) en el citoplasma. Este protocolo proporciona una metodología factible para la síntesis de core-shell dopados con lantánidos UCNs y posterior modificación superficial biocompatible para aplicaciones de celulares más.

El proceso de síntesis esquemática de core-shell UCNs dopados con lantánidos se muestran en la figura 1 y figura 2. La microscopía electrónica de transmisión (TEM) e imágenes de microscopia electrónica (HRTEM) transmisión de alta resolución de nanoestructuras de UCNs core y core-shell obtuvieron respectivamente (figura 1). El ligando libre UCNs preparados quitando el ácido oleico hidrofóbico en la su...

Se presenta un protocolo para la síntesis de core-shell dopados con lantánidos upconversion nanocristales (UCNs) y sus aplicaciones celulares para la regulación de la proteína de canal con iluminación de luz de infrarrojo cercano (NIR).

Síntesis de Core-shell dopados con lantánidos Upconversion nanocristales para aplicaciones celulares

Lanthanide-doped upconversion nanocrystals (UCNs) have attracted much attention in recent years based on their promising and controllable optical ...

El objetivo general de este procedimiento es sintetizar nanocristales de conversión ascendente dopados con lantánidos de núcleo y capa basados en un enfoque de coprecipitación a alta temperatura y realizar modificaciones de superficie biocompatibles que permitan aplicaciones celulares adicionales. En los últimos años, nuestro laboratorio ha desarrollado una conversión ascendente de nanocristales dopada con lantánidos muy singular, que indica propiedades ópticas muy únicas, por lo que puede absorber luz infrarroja de longitud de onda larga y básicamente convertir esta luz en emisiones multicolores en un rango de longitud de onda corta, incluida la UV visible incluso en las ventanas de luz infrarroja. Estas estructuras nanocristalinas únicas indican propiedades muy prometedoras para aplicaciones biomédicas.Este método proporciona un enfoque factible para la síntesis de nanoestructuras de conversión ascendente core-shell y su técnica de modificación de superficie biocompatible para la regulación de proteínas del canal de membrana de puerta de luz sobre la iluminación con luz infrarroja cercana. Para comenzar el procedimiento, prepare soluciones madre de los complejos de acetato de tierras raras en metanol. Prepare soluciones de 20 miligramos por mililitro de hidróxido de sodio y fluoruro de amonio en metanol.Almacene las soluciones madre a cuatro grados centígrados. Luego, pipetee tres mililitros de ácido oleico y siete mililitros de 1-octadeceno en un matraz de 50 mililitros, tres cuellos y fondo redondo. Agregue a esto 1.089 mililitros de la solución de acetato de itrio, 0.608 mililitros de la solución de acetato de iterbio, 83.6 microlitros de la solución de acetato de tulio y 128.5 microlitros de la solución de acetato de neodimio.Equipe el matraz con una barra de agitación y un termómetro. Caliente el matraz a 100 grados centígrados en un baño de aceite mientras revuelve hasta que el metanol se haya evaporado. A continuación, conecte el matraz a una línea Schlenk y bombee el matraz durante dos o tres minutos para eliminar el metanol residual.A continuación, coloque el matraz bajo una atmósfera de nitrógeno. Caliente la mezcla de reacción a 150 grados centígrados durante una hora mientras remueve a 700 rpm. Luego, deje que la mezcla se enfríe a temperatura ambiente.A continuación, coloque en un tubo de centrífuga de 15 mililitros dos mililitros de la solución madre de hidróxido de sodio y 2,965 mililitros de la solución madre de fluoruro de amonio. Tape herméticamente el tubo y agite la mezcla de hidróxido de sodio y fluoruro de amonio durante cinco segundos. En el transcurso de cinco minutos, use una pipeta de vidrio para agregar lentamente la mezcla de hidróxido de sodio y fluoruro de amonio al matraz de reacción mientras agita.Luego, caliente la mezcla de reacción a no más de 50 grados centígrados. Mantén la mezcla a esa temperatura durante 30 minutos. Luego, calienta la mezcla a 100 grados centígrados para evaporar el metanol.Conecte el matraz a la línea Schlenk y elimine el metanol residual al vacío durante dos o tres minutos. Llene el matraz con gas nitrógeno y caliente la mezcla de reacción a 290 grados centígrados a cinco grados centígrados por minuto. Mantenga la mezcla a 290 grados centígrados o ligeramente por encima de ellos durante 1,5 horas.Luego, deje que la mezcla se enfríe a temperatura ambiente mientras revuelve. Transfiera la mezcla de producto a un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Enjuague el residuo en el tubo con 30 mililitros de etanol.Centrifugar la mezcla a 4.000 veces g durante ocho minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y disperse los sólidos en 10 mililitros de hexanos por sonicación durante dos minutos. Agregue 30 mililitros de etanol a la dispersión, centrifugue la mezcla nuevamente en las mismas condiciones y deseche el sobrenadante.Disperse los sólidos en cinco mililitros de hexanos y almacene la dispersión a cuatro grados centígrados. Compruebe la emisión convertida hacia arriba de la solución UCNs core-shell tras la irradiación láser de 808 nanómetros en la oscuridad. Para comenzar a preparar UCN modificados con DBCO, lave los nanocristales de la cáscara del núcleo preparados en 30 mililitros de etanol por centrifugación.Deseche el sobrenadante y agregue 10 mililitros de una solución acuosa de ácido clorhídrico de pH cuatro. Sonicar la mezcla durante 30 minutos para disolver los sólidos. Transfiera la mezcla a un frasco de vidrio y revuelva vigorosamente durante dos horas.Luego, lava la mezcla con cuatro porciones de 30 mililitros de éter dietílico. Combine las fracciones de éter y reserve la capa acuosa lavada. Recupere los UCN libres de trazas de ligandos de las capas de éter con 10 mililitros de agua desionizada y combine las capas acuosas.Agregue 20 mililitros de acetona a las capas acuosas combinadas y agite la mezcla durante cinco segundos. Centrifugar la mezcla a 35.000 veces g durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante y disuelva el precipitado en dos mililitros de agua desionizada para obtener una solución de UCN libre de ligandos.A continuación, disuelva 200 miligramos de ácido poliacrílico en 20 mililitros de agua desionizada por sonicación durante 20 minutos. Agregue a esto la solución de UCN sin ligandos mientras revuelve vigorosamente. Ajuste el pH de la mezcla a 7,4 con una solución de hidróxido de sodio de un molar.Sonicar la mezcla durante 30 minutos y remover la mezcla durante 24 horas a temperatura ambiente. A continuación, centrifugar la mezcla a 35.000 veces g durante 10 minutos. Lavar los sólidos por centrifugación en 10 mililitros de agua desionizada cuatro veces.Disperse los sólidos lavados en ocho mililitros de agua desionizada para obtener una solución de 10 miligramos por mililitro de UCN modificados con polímeros. Centrifugar un miligramo de UCN modificados con polímeros a 35.000 veces g durante 10 minutos. Almacene la solución restante a cuatro grados centígrados.Lave los sólidos por centrifugación en porciones de un mililitro de DMF seco tres veces. Luego, disuelva el precipitado en 200 microlitros de DMF seco. Agregue a esta solución 12.2 miligramos de HOBT, 14 miligramos de EDC, cinco miligramos de DBCO-amina y 16 microlitros de DIPEA.Revuelve la mezcla a temperatura ambiente durante 24 horas. A continuación, centrifugar la mezcla durante 10 minutos a 35.000 veces g. Lave los sólidos cuatro veces por centrifugación en porciones de un mililitro de DMSO.Disperse los UCN modificados con DBCO en 0,2 mililitros de DMSO y almacene la dispersión a cuatro grados centígrados. Primero, siembre una vez 10 las quintas células HEK293 en una placa de 12 pocillos e incube las células a 37 grados centígrados durante 24 horas. Luego, en un tubo de microcentrífuga, combine un microgramo del plásmido elegido con dos microlitros de agente de transfección P3000 en 100 microlitros de MEM.En otro tubo de microcentrífuga, combine 1,5 microlitros del reactivo de transfección con 100 microlitros de MEM. Incuba ambas mezclas a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego, combine las mezclas y agregue 400 microlitros de MEM bajo en suero.A continuación, lave las células incubadas dos veces con porciones de un mililitro de DMEM sin suero. Distribuya la mezcla de transfección de 600 microlitros en los pocillos de la placa de 12 pocillos. Incubar las células a 37 grados centígrados durante cuatro horas.Luego, retire el medio y lave las células dos veces con porciones de un mililitro de DMEM. Distribuir entre los pocillos un mililitro de una solución tetraacetilada de N-azidoacetil-manosamina en DMEM. Incubar las células a 37 grados centígrados durante dos días.Luego, lave, tripsinice y vuelva a cultivar las células en una placa confocal durante la noche. A continuación, reemplace el medio con un mililitro de DMEM fresco que contenga dos microlitros de una solución de 50 miligramos por mililitro de DBCO-UCN. Incubar las células a 37 grados centígrados durante dos horas y lavar las células dos veces con DMEM.Apague la luz de la campana extractora y agregue las soluciones tampón de dieno adecuadas a las células para obtener imágenes de calcio, e incube las células durante 30 minutos en la oscuridad. Lavar las células con DMEM sin suero. Irradia las células con luz infrarroja cercana de 808 nanómetros que proporciona 0,8 vatios por centímetro cuadrado.Alterne cinco minutos de irradiación con descansos de cinco minutos hasta que las células hayan sido irradiadas durante 20 minutos. Tome imágenes de las células con un microscopio confocal. La microscopía electrónica de transmisión de los UCN del núcleo y de la capa central mostró estructuras esféricas con un espesor de la capa de unos cinco nanómetros.La TEM de alta resolución mostró un espaciamiento d consistente con nanoestructuras altamente cristalizadas. Después de la modificación de la superficie, los UCN se dispersaron fácilmente en una solución tampón. La dispersión dinámica de la luz indicó que el diámetro hidrodinámico de los DBCO-UCN en solución acuosa es de aproximadamente 96 nanómetros.Los potenciales zeta de los UCN modificados con PAA y DBCO indican superficies cargadas negativamente, lo que es consistente con la solubilidad y la estabilidad en soluciones tampón acuosas. Las pruebas de emisión convertida mostraron que los UCN modificados con PAA y DBCO tenían los mismos patrones de emisión que los UCN de la capa central base cuando se irradiaban con luz de 808 nanómetros. Se utilizaron células HEK293 marcadas con azida que expresan proteínas de canal activado por luz para probar las bioaplicaciones de DBCO-UCN.La localización de los UCN en las etiquetas de azida se atribuyó a que los grupos DBCO se tiñeron con un colorante que contenía azida. Cuando estas células se expusieron a la luz infrarroja cercana, los DBCO-UCN facilitaron el flujo de iones de calcio a través de la membrana celular, como se muestra mediante imágenes confocales y citometría de flujo con un indicador de calcio fluorescente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar los nanocristales de conversión ascendente core-shell con modificación de superficie biocompatible y sus aplicaciones biológicas adicionales para activar el canal iónico activado por luz en células vivas siguiendo este procedimiento.

synthesis-core-shell-lanthanide-doped-upconversion-nanocrystals-for

Research

Investigación

JoVE Journal

Chemistry

Química

Detalles del Protocolo se proporcionan para etiquetado células embrionarias humanas in vitro madre con segunda nanopartículas que generan armónicos. También se presentan metodologías para la investigación de células madre mediante microscopía multi-fotón y su diferenciación en grupos cardíacas.

Armónica Nanopartículas para Regenerativa de Investigación

Las moléculas de colorante orgánico y las nanopartículas de conversión ascendente recubiertas de ácido oleico no son solubles en agua. Este protocolo describe un método "plug and play" que permite la transferencia de moléculas de colorante orgánico y la conversión ascendente de partículas de su solvente hidrofóbico inicial a agua.

Un método &#39;Plug and Play&#39; para crear nanoconjuntos dispersables en agua que contiene un polímero anfífilo, colorantes orgánicos y conversión ascendente Nanopartículas

Se realiza la síntesis de nanopartículas de oro uniformes recubiertas con cubiertas semiconductoras de CdS o ZnS. El recubrimiento semiconductor se lleva a cabo depositando primero una capa de sulfuro de plata e intercambiando los cationes de plata por cationes de zinc o cadmio.

Síntesis, caracterización y funcionalización de híbridos Au / CdS y Au / ZnS Core / Shell nanopartículas

En este protocolo, jaula de la proteína quinasa A (PKA), un bioeffector de transducción de señal celular, fue inmovilizada en una superficie de nanopartículas, microinyectado en el citosol y activado por producir UV luz de radiación de infrarrojo cercano (NIR), induciendo desintegración de la fibra de estrés aguas abajo en el citosol.

Un sistema integrado para activar remotamente Transduction de la señal intracelular por fotoactivación de la cinasa mediada por nanopartículas de conversión ascendente

Se presentan procedimientos de fabricación para el ion lantánido altamente magnéticamente sensibles quelantes conjuntos polimoleculares. La respuesta magnética se basa en el tamaño de la Asamblea, que se adapta por extrusión a través de membranas nanopore. Las Asambleas alignability magnética y los cambios estructurales inducidos por la temperatura son monitoreados por las mediciones de birrefringencia, una técnica gratuito para resonancia magnética nuclear y dispersión de neutrones de ángulo...

Procedimientos de fabricación y medidas de birrefringencia para diseñar Ion lantánido magnéticamente sensibles quelantes ensamblajes de fosfolípidos

Aquí, presentamos un protocolo para obtener datos de imágenes hiperespectrales luminiscentes y para analizar las características de anisotropía óptica de cristales únicos basados en lantanoide utilizando un sistema de imágenes hiperespectrales.

Imágenes hiperespectrales como herramienta para estudiar la anisotropía óptica en cristales únicos moleculares basados en lantanoia

Este protocolo detalla la síntesis de nanocápsulas de conversión ascendente para su posterior uso en resinas fotopolimerizables para la impresión 3D volumétrica facilitada por la conversión ascendente por fusión triplete.

Síntesis de nanocápsulas de conversión ascendente de fusión triplete

Aquí, demostramos un protocolo para la síntesis en dos pasos de núcleos monocristalinos utilizando un par de marcos metal-orgánicos (MOF) no isoestructurales, HKUST-1 y MOF-5, que tienen redes cristalinas bien emparejadas.

Síntesis de estructuras metal-orgánicas de núcleo monocristalino

Se presenta un protocolo para la síntesis de nanomateriales luminiscentes persistentes (PLNP) y sus posibles aplicaciones en pantallas regrabables y procesamiento artístico utilizando el efecto de resplandor posterior bajo irradiación de luz ultravioleta (365 nm).

Síntesis de nanopartículas luminiscentes persistentes para pantallas regrabables y aplicaciones de iluminación

Este estudio investiga las mediciones ópticas estándar de dos cerámicas luminiscentes persistentes: SAO-B (azul) y SAO-G (verde), como la termoluminiscencia (TL) y la luminiscencia persistente (PersL). Al controlar la profundidad de la trampa de electrones, este trabajo innova métodos dinámicos anti-falsificación 'resueltos por temperatura' y 'resueltos en el tiempo'.

Control dependiente de fase de la profundidad de trampa y luminiscencia persistente en fósforos de aluminato de estroncio

Aprende a sintetizar nanocristales de conversión ascendente dopados con lantánidos de núcleo-cáscara mediante coprecipitación a alta temperatura. Este método permite modificaciones superficiales biocompatibles para aplicaciones biomédicas celulares.

Síntesis de Core-shell dopados con lantánidos Upconversion nanocristales para aplicaciones celulares

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