Síntesis de Core-shell dopados con lantánidos Upconversion nanocristales para aplicaciones celulares

El objetivo general de este procedimiento es sintetizar nanocristales de conversión ascendente dopados con lantánidos de núcleo y capa basados en un enfoque de coprecipitación a alta temperatura y realizar modificaciones de superficie biocompatibles que permitan aplicaciones celulares adicionales. En los últimos años, nuestro laboratorio ha desarrollado una conversión ascendente de nanocristales dopada con lantánidos muy singular, que indica propiedades ópticas muy únicas, por lo que puede absorber luz infrarroja de longitud de onda larga y básicamente convertir esta luz en emisiones multicolores en un rango de longitud de onda corta, incluida la UV visible incluso en las ventanas de luz infrarroja. Estas estructuras nanocristalinas únicas indican propiedades muy prometedoras para aplicaciones biomédicas.

Este método proporciona un enfoque factible para la síntesis de nanoestructuras de conversión ascendente core-shell y su técnica de modificación de superficie biocompatible para la regulación de proteínas del canal de membrana de puerta de luz sobre la iluminación con luz infrarroja cercana. Para comenzar el procedimiento, prepare soluciones madre de los complejos de acetato de tierras raras en metanol. Prepare soluciones de 20 miligramos por mililitro de hidróxido de sodio y fluoruro de amonio en metanol.

Almacene las soluciones madre a cuatro grados centígrados. Luego, pipetee tres mililitros de ácido oleico y siete mililitros de 1-octadeceno en un matraz de 50 mililitros, tres cuellos y fondo redondo. Agregue a esto 1.089 mililitros de la solución de acetato de itrio, 0.608 mililitros de la solución de acetato de iterbio, 83.6 microlitros de la solución de acetato de tulio y 128.5 microlitros de la solución de acetato de neodimio.

Equipe el matraz con una barra de agitación y un termómetro. Caliente el matraz a 100 grados centígrados en un baño de aceite mientras revuelve hasta que el metanol se haya evaporado. A continuación, conecte el matraz a una línea Schlenk y bombee el matraz durante dos o tres minutos para eliminar el metanol residual.

A continuación, coloque el matraz bajo una atmósfera de nitrógeno. Caliente la mezcla de reacción a 150 grados centígrados durante una hora mientras remueve a 700 rpm. Luego, deje que la mezcla se enfríe a temperatura ambiente.

A continuación, coloque en un tubo de centrífuga de 15 mililitros dos mililitros de la solución madre de hidróxido de sodio y 2,965 mililitros de la solución madre de fluoruro de amonio. Tape herméticamente el tubo y agite la mezcla de hidróxido de sodio y fluoruro de amonio durante cinco segundos. En el transcurso de cinco minutos, use una pipeta de vidrio para agregar lentamente la mezcla de hidróxido de sodio y fluoruro de amonio al matraz de reacción mientras agita.

Luego, caliente la mezcla de reacción a no más de 50 grados centígrados. Mantén la mezcla a esa temperatura durante 30 minutos. Luego, calienta la mezcla a 100 grados centígrados para evaporar el metanol.

Conecte el matraz a la línea Schlenk y elimine el metanol residual al vacío durante dos o tres minutos. Llene el matraz con gas nitrógeno y caliente la mezcla de reacción a 290 grados centígrados a cinco grados centígrados por minuto. Mantenga la mezcla a 290 grados centígrados o ligeramente por encima de ellos durante 1,5 horas.

Luego, deje que la mezcla se enfríe a temperatura ambiente mientras revuelve. Transfiera la mezcla de producto a un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Enjuague el residuo en el tubo con 30 mililitros de etanol.

Centrifugar la mezcla a 4.000 veces g durante ocho minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y disperse los sólidos en 10 mililitros de hexanos por sonicación durante dos minutos. Agregue 30 mililitros de etanol a la dispersión, centrifugue la mezcla nuevamente en las mismas condiciones y deseche el sobrenadante.

Disperse los sólidos en cinco mililitros de hexanos y almacene la dispersión a cuatro grados centígrados. Compruebe la emisión convertida hacia arriba de la solución UCNs core-shell tras la irradiación láser de 808 nanómetros en la oscuridad. Para comenzar a preparar UCN modificados con DBCO, lave los nanocristales de la cáscara del núcleo preparados en 30 mililitros de etanol por centrifugación.

Deseche el sobrenadante y agregue 10 mililitros de una solución acuosa de ácido clorhídrico de pH cuatro. Sonicar la mezcla durante 30 minutos para disolver los sólidos. Transfiera la mezcla a un frasco de vidrio y revuelva vigorosamente durante dos horas.

Luego, lava la mezcla con cuatro porciones de 30 mililitros de éter dietílico. Combine las fracciones de éter y reserve la capa acuosa lavada. Recupere los UCN libres de trazas de ligandos de las capas de éter con 10 mililitros de agua desionizada y combine las capas acuosas.

Agregue 20 mililitros de acetona a las capas acuosas combinadas y agite la mezcla durante cinco segundos. Centrifugar la mezcla a 35.000 veces g durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante y disuelva el precipitado en dos mililitros de agua desionizada para obtener una solución de UCN libre de ligandos.

A continuación, disuelva 200 miligramos de ácido poliacrílico en 20 mililitros de agua desionizada por sonicación durante 20 minutos. Agregue a esto la solución de UCN sin ligandos mientras revuelve vigorosamente. Ajuste el pH de la mezcla a 7,4 con una solución de hidróxido de sodio de un molar.

Sonicar la mezcla durante 30 minutos y remover la mezcla durante 24 horas a temperatura ambiente. A continuación, centrifugar la mezcla a 35.000 veces g durante 10 minutos. Lavar los sólidos por centrifugación en 10 mililitros de agua desionizada cuatro veces.

Disperse los sólidos lavados en ocho mililitros de agua desionizada para obtener una solución de 10 miligramos por mililitro de UCN modificados con polímeros. Centrifugar un miligramo de UCN modificados con polímeros a 35.000 veces g durante 10 minutos. Almacene la solución restante a cuatro grados centígrados.

Lave los sólidos por centrifugación en porciones de un mililitro de DMF seco tres veces. Luego, disuelva el precipitado en 200 microlitros de DMF seco. Agregue a esta solución 12.2 miligramos de HOBT, 14 miligramos de EDC, cinco miligramos de DBCO-amina y 16 microlitros de DIPEA.

Revuelve la mezcla a temperatura ambiente durante 24 horas. A continuación, centrifugar la mezcla durante 10 minutos a 35.000 veces g. Lave los sólidos cuatro veces por centrifugación en porciones de un mililitro de DMSO.

Disperse los UCN modificados con DBCO en 0,2 mililitros de DMSO y almacene la dispersión a cuatro grados centígrados. Primero, siembre una vez 10 las quintas células HEK293 en una placa de 12 pocillos e incube las células a 37 grados centígrados durante 24 horas. Luego, en un tubo de microcentrífuga, combine un microgramo del plásmido elegido con dos microlitros de agente de transfección P3000 en 100 microlitros de MEM.

En otro tubo de microcentrífuga, combine 1,5 microlitros del reactivo de transfección con 100 microlitros de MEM. Incuba ambas mezclas a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego, combine las mezclas y agregue 400 microlitros de MEM bajo en suero.

A continuación, lave las células incubadas dos veces con porciones de un mililitro de DMEM sin suero. Distribuya la mezcla de transfección de 600 microlitros en los pocillos de la placa de 12 pocillos. Incubar las células a 37 grados centígrados durante cuatro horas.

Luego, retire el medio y lave las células dos veces con porciones de un mililitro de DMEM. Distribuir entre los pocillos un mililitro de una solución tetraacetilada de N-azidoacetil-manosamina en DMEM. Incubar las células a 37 grados centígrados durante dos días.

Luego, lave, tripsinice y vuelva a cultivar las células en una placa confocal durante la noche. A continuación, reemplace el medio con un mililitro de DMEM fresco que contenga dos microlitros de una solución de 50 miligramos por mililitro de DBCO-UCN. Incubar las células a 37 grados centígrados durante dos horas y lavar las células dos veces con DMEM.

Apague la luz de la campana extractora y agregue las soluciones tampón de dieno adecuadas a las células para obtener imágenes de calcio, e incube las células durante 30 minutos en la oscuridad. Lavar las células con DMEM sin suero. Irradia las células con luz infrarroja cercana de 808 nanómetros que proporciona 0,8 vatios por centímetro cuadrado.

Alterne cinco minutos de irradiación con descansos de cinco minutos hasta que las células hayan sido irradiadas durante 20 minutos. Tome imágenes de las células con un microscopio confocal. La microscopía electrónica de transmisión de los UCN del núcleo y de la capa central mostró estructuras esféricas con un espesor de la capa de unos cinco nanómetros.

La TEM de alta resolución mostró un espaciamiento d consistente con nanoestructuras altamente cristalizadas. Después de la modificación de la superficie, los UCN se dispersaron fácilmente en una solución tampón. La dispersión dinámica de la luz indicó que el diámetro hidrodinámico de los DBCO-UCN en solución acuosa es de aproximadamente 96 nanómetros.

Los potenciales zeta de los UCN modificados con PAA y DBCO indican superficies cargadas negativamente, lo que es consistente con la solubilidad y la estabilidad en soluciones tampón acuosas. Las pruebas de emisión convertida mostraron que los UCN modificados con PAA y DBCO tenían los mismos patrones de emisión que los UCN de la capa central base cuando se irradiaban con luz de 808 nanómetros. Se utilizaron células HEK293 marcadas con azida que expresan proteínas de canal activado por luz para probar las bioaplicaciones de DBCO-UCN.

La localización de los UCN en las etiquetas de azida se atribuyó a que los grupos DBCO se tiñeron con un colorante que contenía azida. Cuando estas células se expusieron a la luz infrarroja cercana, los DBCO-UCN facilitaron el flujo de iones de calcio a través de la membrana celular, como se muestra mediante imágenes confocales y citometría de flujo con un indicador de calcio fluorescente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar los nanocristales de conversión ascendente core-shell con modificación de superficie biocompatible y sus aplicaciones biológicas adicionales para activar el canal iónico activado por luz en células vivas siguiendo este procedimiento.