Evaluación electrofisiológica de Atria murino con mapeo óptico alta resolución

Este protocolo describe la evaluación electrofisiológica de atria murino utilizando un sistema de mapeo óptico con una alta resolución espacial y temporal, incluyendo grabaciones duales de la tensión de la membrana y Ca^{2 +} transitoria bajo programado estimulación a través de un catéter electrodo especializados.

El objetivo general de este experimento es lograr una evaluación detallada de la aurícula murina con una alta resolución temporal y espacial durante el ritmo sinusal normal y la arritmia auricular inducida por estimulación eléctrica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo electrofisiológico cardíaco, como cómo las mutaciones genéticas contribuyen a las arritmias auriculares. La principal ventaja de esta técnica es que podemos obtener un mapeo óptico preciso en las aurículas, centrándonos en el mecanismo de iniciación y mantenimiento de las arritmias auriculares.

Los detalles sobre la configuración del aparato de Langendorff, incluido el montaje del circuito de perfusión, se proporcionan en el protocolo de texto. Los parámetros de imagen también se proporcionan en el texto. Para preparar al ratón para la canulación, trátelo con heparina y anestesiarlo como se detalla en el texto.

Asegúrese de confirmar la anestesia con una prueba de reflejos antes de continuar. Para continuar, asegure el mouse en posición supina en la placa de operación. Luego, abra la pared abdominal por debajo del nivel de la apófisis xifoides con unas tijeras.

A continuación, haga una incisión transversal en el diafragma y corte ambos lados de las costillas en la línea axilar medial sin dañar el corazón. A continuación, extirpe rápidamente el corazón junto con los vasos y tejidos adyacentes. A continuación, lave el corazón con 10 mililitros de PBS helado y retire los pañuelos circundantes.

Luego, en la aorta ascendente, introduzca la punta de la aguja desafilada de calibre 21 conectada al circuito de perfusión. Debajo de un estereoscopio, fíjelo en su posición con suturas. Ahora, perfunde el corazón con la solución de Tyrode aireada con oxígeno puro durante 10 minutos.

Durante la perfusión, controle continuamente la presión de perfusión. Manténgalo entre 80 y 100 milímetros de mercurio. Durante la perfusión, inserte un tubo delgado de polietileno en la vena cava superior y use suturas para mantenerlo en su lugar.

Luego, coloque el corazón en la cámara de vidrio caliente. Una vez en la cámara, perfore la cavidad ventricular izquierda con una aguja permanente de calibre 24 atravesando el ápice ventricular para evitar dañar la aurícula. A continuación, se retira la aguja interna, dejando una cánula externa en el ventrículo izquierdo.

A continuación, introduzca un catéter de electrodos cuadripolares hecho a medida a través del tubo en la vena cava superior para estimular la aurícula derecha. Ahora, inserte un electrodo de alfiler en el ápex ventricular para registrar continuamente los electrocardiogramas bipolares entre el electrodo de pin y la aguja de canulación. Monitorizar continuamente el electrocardiograma y la presión de perfusión durante todo el estudio.

Para teñir para registros individuales del voltaje de la membrana, primero minimice la iluminación ambiental. La temperatura de la solución de perfusión debe mantenerse a 37 grados centígrados. Administre 10 mililitros de tinte durante dos a cinco minutos por la vía de perfusión.

A continuación, ahuyenta la mancha perfundiendo la solución de Tyrode durante cinco minutos. Asegúrese de mantener la presión de perfusión entre 80 y 100 milímetros de mercurio. A continuación, administrar un mililitro de blebbistatina diluida por vía de perfusión.

Confirmar la eliminación de la contracción del corazón. Además, asegúrese de que el corazón haya absorbido la mancha de manera homogénea. Antes de continuar, configure los electrodos de estimulación y el estimulador y encuentre el umbral de estimulación.

Para continuar, coloque con cuidado un cubreobjetos en el corazón perfundido para aplanar la superficie auricular y evitar el artefacto de movimiento de la vibración de la solución. Confirme que el atrio se adhiere correctamente al cubreobjetos. Ahora, se pueden evaluar varios regimientos de ritmo.

Para un ritmo constante o en ráfaga, administre 99 latidos en un intervalo de ritmo que comience en 150 milisegundos o el intervalo más largo que evite superar el ritmo intrínseco. A continuación, reduzca el intervalo de estimulación progresivamente en pasos de cinco milisegundos hasta 40 milisegundos, o hasta que el intervalo no logre excitar la aurícula. Para la estimulación de estímulo único y adicional, establezca la duración del ciclo de estimulación de la unidad básica o se deben probar S1.At al menos tres intervalos de S1 a S1, como 120, 100 y 80 milisegundos.

A continuación, establezca el primer estímulo adicional, o S2, en menos 10 milisegundos para la duración del ciclo básico, y entregue el S2 después del último estímulo de ritmo del impulso básico. Gradualmente, acorte el intervalo de acoplamiento de S2 progresivamente, en pasos de cinco milisegundos hasta que S2 no logre despolarizar la aurícula. Determine el período refractario efectivo como el intervalo S2 más largo que no logra despolarizar la aurícula.

A la hora de determinar el umbral del paciente o el período refractario efectivo, a veces es difícil confirmar la captura auricular mediante la observación de la estimulación en el electrocardiograma. En tales casos, debe verificarlo mediante mapeo óptico. Para continuar, aplique la estimulación de estímulos adicionales doble y triple para inducir taquiarritmias auriculares de acuerdo con el protocolo de texto.

El voltaje de membrana en un corazón de Langendorff se registró monitoreando la señal de fluorescencia de di-4-ANEPPS a 10.000 cuadros por segundo. Se obtuvo un mapa de activación mediante estimulación constante desde la aurícula derecha y se pudo analizar un patrón de conducción detallado en las pequeñas aurículas murinas. Se utilizaron RH237 y Rhod2AM para monitorizar la transitoriedad del calcio en la aurícula izquierda durante el mismo protocolo de estimulación constante.

El muestreo a 1.000 fotogramas por segundo fue lo suficientemente rápido como para comparar los potenciales de acción en la transitoriedad del calcio. A continuación, se generó taquiarritmia de aurícula en corazones tomados de ratones 10 días después del procedimiento de constricción aórtica transversa, que aplicaron una sobrecarga de presión a la aurícula. Se utilizaron estímulos adicionales triples de 120 a 80 milisegundos para generar la taquiarritmia y se observó la propagación de la taquiarritmia al pasar por el circuito de reentrada.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener las aurículas libres de cualquier daño o estrés que pueda alterar las propiedades electrofisiológicas de las aurículas.