Acondicionamiento previo de las vías respiratorias de los ratones con bleomicina aumenta la eficacia del pulmón Orthotopic Engraftment de la célula de cáncer

El objetivo general de este procedimiento es aumentar la eficiencia del trasplante de células de cáncer de pulmón iniciadoras de tumores en las vías respiratorias de ratones. Este método puede ayudar a establecer nuevos modelos preclínicos para responder a preguntas clave en la biología del cáncer, incluidas las causas de la resistencia a los medicamentos y la relación entre la fibrosis y el cáncer de pulmón. La principal ventaja de esta técnica es que aumenta la eficiencia del trasplante de células iniciadoras de tumores en los pulmones de una variedad de cepas de ratones.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia, ya que nos permite modelar una mayor variedad de subtipos de cáncer de pulmón humano, que se sabe que tienen diferentes respuestas clínicas al tratamiento. Para este protocolo, primero se debe inyectar bleomicina a los ratones. Luego, después de 14 días, se inyectan las células tumorales.

El procedimiento para ambas inyecciones es muy similar y se describe aquí. Dos horas antes de la inyección, descongele el caldo de bleomicina en hielo y dilúyalo hasta la concentración de trabajo. Manténgalo en hielo.

Para un bolo celular, tenga preparada una suspensión celular como se describe en el protocolo de texto. El tiempo de procedimiento para cada ratón es de unos 10 minutos en total. Asegúrese de confirmar la anestesia adecuada con un pellizco en los dedos de los pies y aplique ungüento veterinario en los ojos.

En este momento, si el ratón tiene pelo oscuro, afeita toda el área de las costillas tanto ventral como dorsalmente para que se pueda visualizar correctamente. Luego, coloque el ratón en la plataforma de intubación asegurándolo por sus dientes frontales con su espalda contra la plataforma. Si se va a inyectar un bolo celular, vuelva a suspenderlo ahora con una trituración suave.

Ahora ilumine la región superior del pecho, abra la boca y saque suavemente la lengua con pinzas planas. Prepare un catéter intravenoso para la tráquea retirando la aguja, luego colóquelo sobre la abertura traqueal. A continuación, inserte el catéter en la tráquea hasta que la parte superior del catéter esté cerca de los dientes frontales e ilumine el interior del catéter para confirmar su colocación.

A continuación, dispense los 50 microlitros de bleomicina recién hecha, o suspensión celular, directamente en el catéter. Espere unos segundos para que todo el volumen desplácese por el catéter. A continuación, retire el catéter y deséchelo con lejía al 10%.

Si el ratón no inhala el líquido, controle cuidadosamente su respiración y ajuste la posición del catéter. Si el ratón deja de respirar, retire inmediatamente el catéter y permita que el ratón respire antes de volver a insertar el catéter. Después de retirar el catéter, continúe realizando el procedimiento para tener cinco ratones tratados, aún anestesiados y listos para obtener imágenes.

Para la recuperación, coloque el ratón en decúbito supino sobre una almohadilla térmica aprobada por IACUC en una jaula de recuperación y vigílelo hasta que se haya recuperado por completo. Dos o tres minutos después de inyectar las células, inyecte 100 microlitros de luciferina por vía retroorbital, utilizando una aguja de insulina. Alternar el ojo utilizado para la inyección en cada sesión de imagen.

Después de esperar al menos dos minutos, coloque hasta cinco ratones en un generador de imágenes de bioluminiscencia animal, en la posición de decúbito esternal y adquiera una imagen dorsal utilizando los ajustes de luminiscencia. En el panel de control, ajuste la configuración de resolución y sensibilidad para medir la luminiscencia de las celdas. Para la mayoría de las aplicaciones, comience con tres minutos, establezca el agrupamiento en medio, establezca el f/stop en uno, establezca el campo de visión en d y establezca la altura del sujeto en 1,5.

Si la inyección fue exitosa, se detecta una señal en el área superior del tórax en un pulmón o en ambos pulmones. Si las células se agrupan en la entrada de la tráquea, la inyección no tuvo éxito. Después de tomar la imagen dorsal, voltee los ratones y adquiera una imagen ventral y ajuste la configuración según sea necesario.

Después de las imágenes, proceda con los cuidados postoperatorios como se describe en el protocolo de texto. Luego, repita este protocolo de imágenes tres días después del injerto y semanalmente a partir de entonces. Para analizar las imágenes, utilice un software de análisis de bioluminiscencia.

Primero, cargue todas las imágenes apropiadas de la serie. Esta sección se detalla en un paquete de software. A continuación, para cada ratón, en la primera imagen de la serie, cree una región cuadrada de interés y colóquela sobre la zona superior del pecho que cubra toda la región pulmonar.

A continuación, con un clic derecho, acceda a la función copiar todas las regiones de interés y utilice esta herramienta para aplicar las mismas regiones de interés a cada imagen del grupo. Luego, dentro de cada imagen, ajusta las posiciones de los cuadrados para cubrir la parte superior del pecho de cada mouse. Haga esto tanto para la vista ventral como para la dorsal.

Ahora, en la esquina superior izquierda de la ventana de la imagen, seleccione la función de fotones. A continuación, seleccione la opción de medición. A continuación, los datos de las regiones de interés se muestran en una tabla de salida como flujo total.

Analice estos datos según sea necesario. Cuando estaban inmunocomprometidos, los ratones atímicos fueron tratados con bleomicina. Antes del injerto de bolo celular, se observó fibrosis transitoria en el día 14 en ratones tratados con bleomicina, pero no en ratones tratados con vehículo.

A continuación, las células de la línea celular de cáncer de pulmón humano establecida, H2030, se introdujeron por vía intratraqueal en los pulmones de estos ratones. Después de 35 días, los ratones tratados con bleomicina tenían una alta carga de tumores pulmonares. Sin embargo, en los animales tratados con el vehículo, no se detectaron tumores.

La carga pulmonar-tumoral se confirmó mediante histología. Los pulmones pretratados con vehículo no tenían evidencia de nódulos tumorales, mientras que los pulmones pretratados con bleomicina tenían nódulos tumorales grandes. Después de trasplantar una línea celular metastásica H2030 BrM 3, a los 39 a 57 días, la bioluminiscencia era demasiado intensa para la obtención de imágenes, por lo que la metástasis se analizó en órganos distantes ex vivo.

Se pudieron detectar pequeñas lesiones en varios tejidos, lo que sugiere que este método es prometedor para estudiar la enfermedad diseminada espontáneamente. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 10 minutos por jaula de cinco ratones sin imágenes y 20 minutos por jaula cuando también se obtienen imágenes de los ratones. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe asegurarse de que se inserte correctamente el catéter y que se controle la respiración del animal.

Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como estudios farmacológicos o química aminoacética del tejido recolectado, para responder preguntas adicionales, como cómo responden los tumores injertados a los medicamentos o la caracterización de las interacciones del estroma tumoral específicas de los pulmones. Después de su desarrollo, esta técnica se puede aplicar a diferentes cepas de ratón y modelos tumorales, incluidos los xenoinjertos derivados de pacientes en un entorno fisiológicamente relevante. No olvide que trabajar con bleomicina puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como la manipulación en una capucha de riesgo biológico y la eliminación adecuada mientras se realiza este procedimiento.