Name: Transferencia adoptiva de macrófagos estimulados por IL-33 en modelos de ratón inducidos por bleomicina para estudiar su efecto sobre la fibrosis pulmonar idiopática in vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Aprende a aislar macrófagos intersticiales pulmonares y transferirlos adoptivamente tras estimulación con IL-33 en modelo murino. Este método permite estudiar in vivo la fibrosis pulmonar idiopática.

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Los autores reconocen el tema especial de gestión de laboratorio de la Universidad de Jiangnan: construcción de una biblioteca digital basada en muestras patológicas (JDSYS202223) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81800065).

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética de Bienestar Animal Experimental de la Universidad de Jiangnan (JN No. 20211130m1720615[501]).
NOTA: En total, se utilizaron 10 ratones machos C57BL / 6 de 6-8 semanas de edad y con un peso de 20-25 g en este estudio. Los tres grupos experimentales en el estudio incluyeron tres ratones receptores cada uno, y se utilizó un ratón huésped para el aislamiento IM.
1. Agotamiento de macrófagos pulmonares de ratón
<ol><li>Saque el frasco de liposomas de clodronato (consulte la Tabla de materiales) del refrigerador con 30 minutos de anticipación, caliéntelo a temperatura ambiente e invierta varias veces para asegurar una mezcla uniforme. NOTA: Los liposomas de clodronato encapsulan las moléculas hidrofílicas de bifosfonato de diclorometileno. Cuando estos liposomas son consumidos por los macrófagos, el clodronato es liberado gradualmente por la acción de la fosfatasa lisosoma, y su acumulación consecuentemente desencadena la apoptosis celular y el agotamiento de los macrófagos7.</li>
	<li>Anestesiar ratones con isoflurano al 3%. Verifique la profundidad de la anestesia pellizcando un pie para verificar la conciencia. Aplique ungüento veterinario en ambos ojos para evitar la sequedad bajo anestesia.</li>
	<li>Aspirar 60 μL de liposomas de clodronato utilizando una pipeta con una punta de succión estéril. Administre el medicamento gota a gota en la cavidad nasal del ratón anestesiado, de modo que cuando el ratón inhala, el medicamento se inhala en la tráquea. Después de cada gota, asegúrese de que el ratón inhale el medicamento por completo y respire de manera uniforme. Administrar liposomas que contengan PBS solo como control8 (Figura 2).</li>
	<li>Coloque a los ratones en una tabla de temperatura constante de 38 ° C para recalentarlos y acelerar su recuperación. Monitoree a los ratones hasta que se despierten. Después de que los ratones se recuperen bien y logren la decúbito esternal, transfiéralos a la jaula.</li>
	<li>Utilice ratones con macrófagos alveolares agotados 2 días después del tratamiento con liposomas de clodronato como ratones receptores para el experimento de transferencia. NOTA: En este estudio, el agotamiento de los macrófagos alveolares se confirmó mediante la comprobación de la expresión de los marcadores de macrófagos como se describió anteriormente 8,9 después de la administración de liposomas de clodronato por inhalación (ver Figura complementaria 1).</li>
</ol>2. Aislamiento y cultivo de MIs
<ol><li>Anestesiar al ratón huésped con una inyección intraperitoneal de ketamina (120 mg/kg) y xilazina (16 mg/kg). Confirme la profundidad de la anestesia a través de la pérdida del reflejo de pellizco del dedo del pie. Aplique ungüento veterinario en ambos ojos para evitar la sequedad bajo anestesia. Luego, desinfecte la piel del ratón anestesiado con 75% de alcohol y yodo. Use tijeras para cortar a través de la piel y exponer el tejido cardiopulmonar</li>
	<li>Aspirar 10 ml de 1x PBS en una jeringa con una aguja de 20 G e insertar la punta de la aguja en la aurícula derecha del ratón (Figura 3A). Corte la vena cava inferior del ratón con tijeras quirúrgicas y luego perfunda manualmente el ratón con PBS a una velocidad constante (10-20 ml / min) hasta que el tejido pulmonar se vuelva blanco. Extirpar el tejido pulmonar y transferirlo a PBS helado en una placa de cultivo (Figura 3B).</li>
	<li>Cortar el tejido pulmonar en fragmentos de aproximadamente 2 mm x 2 mm x 2 mm. Luego, agregue 15 ml de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contiene 1% de colagenasa A al tejido pulmonar para aislar los macrófagos. Incubar a 100 rpm durante 30 min en una mesa de agitación a 37 °C.</li>
	<li>Aspire la suspensión de tejido pulmonar a través de una jeringa de 10 ml al menos 20 veces para que sea lo más fina posible. Filtre esta suspensión a través de un filtro celular de 40 μm. Centrifugar el filtrado a 400 x g durante 10 min y desechar el sobrenadante.</li>
	<li>Lisar los glóbulos rojos en el gránulo agregando 3 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos (ver Tabla de materiales) en hielo durante 2-3 minutos.</li>
	<li>Después de la centrifugación a 150 x g durante 5 min, resuspender el pellet celular con 10 ml de DMEM (que contiene 100 U/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina). Contar las células con un hemocitómetro.</li>
	<li>Sembrar las células en placas de cultivo celular adherente de 10 cm a 2 x 107 células/placa, e incubar durante 1 h a 37 °C y 5% deCO2. Esto permite que los IM pulmonares se adhieran al plato5. Después de 1 h, aspirar el sobrenadante y las células flotantes, y añadir 10 ml de medio de cultivo completo fresco (DMEM que contiene 10% FBS, 100 U/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina). Incubar durante más de 8 h o durante la noche.</li>
	<li>Determinar la pureza de los IM obtenidos mediante citometría de flujo con tinción para los marcadores F4/80 y CD11c, como se describió anteriormente5 (ver Figura complementaria 1).</li>
</ol>3. Transferencia adoptiva de IMs a los alvéolos pulmonares
<ol><li>Sustituir el medio de cultivo de la placa que contiene los IM pulmonares aislados (paso 2.7) por un medio de cultivo completo que contenga 10 ng/ml de IL-33 para estimular los IM. Incubar durante 24 h a 37 °C y 5% deCO2. Utilice 1x PBS en lugar de IL-33 como control.</li>
	<li>Disociar los IM pulmonares tratándolos con 1 mL de tripsina al 0,25% durante 5 min. Luego, apague la digestión agregando 3 ml de medio completo de cultivo fresco y coseche los macrófagos pulmonares centrifugando la suspensión celular a 150 x g y 4 ° C durante 5 min. Contar las células con un hemocitómetro y resuspender las células en PBS hasta una concentración final de 5 x 105 células/50 μL.</li>
	<li>Anestesiar a los ratones receptores con gas isoflurano al 3%. Espere a que el ratón quede inconsciente (como en el paso 1.2) y luego fije las extremidades del ratón anestesiado en una placa vertical con cinta médica. Tire suavemente de la lengua del ratón hacia un lado con un hisopo de algodón.</li>
	<li>Encienda la lámpara de intubación y póngala en la garganta del ratón para que se pueda ver la tráquea. Verifique que la tráquea esté cerca de la base de la lengua, el esófago esté cerca de la parte posterior del cuello, pero la abertura del esófago no sea visible durante la operación.</li>
	<li>Utilice la lámpara de intubación (22 G) para ayudar a intubar el ratón. Guíe la cánula de la aguja permanente hacia la tráquea con un alambre guía (0,4 mm de diámetro). Retire el alambre guía y empuje la cánula en la tráquea del ratón para completar la intubación.</li>
	<li>Después de observar que la cánula entra en la tráquea, inyecte 50 μL de la suspensión celular (que contiene 5 x 105 IM) en el ratón receptor a través de la tráquea.</li>
	<li>Coloque los ratones en una almohadilla de calentamiento constante de 38 ° C para recalentarlos y acelerar la recuperación. Monitoree a los ratones hasta que se despierten. Después de que se recuperen bien y logren la decúbito esternal, transfiéralos a la jaula.</li>
	<li>Después de 24 h, administrar bleomicina (BLM) a través de la tráquea (utilizando el procedimiento en los pasos 3.3-3.5) a una dosis de 1,4 U/kg de peso corporal para inducir la FPI. Administrar un volumen igual de solución salina al grupo de control.</li>
	<li>Después de 21 días, determinar el grado de gravedad de la fibrosis pulmonar para los diferentes grupos de ratones que fueron transferidos adoptivamente con PBS o la suspensión IM estimulada por IL-33 evaluando la expresión de marcadores para fibrosis y las puntuaciones de Ashcroft10.<ol><li>Extraiga el ARN total del tejido pulmonar utilizando un reactivo de extracción de ARN (consulte la Tabla de materiales). NOTA: El análisis cuantitativo se realizó con un lector de microplacas. Si la relación OD260/OD280 es 1.8-2.0, la pureza del ARN es alta. Todas las muestras se almacenaron a -80 ° C.</li>
		<li>Realizar PCR cuantitativa de fluorescencia para evaluar la expresión de actina del músculo α liso (AME) y fibronectina utilizando cebadores específicos. NOTA: Los cebadores utilizados para α-SMA fueron 5'- GACGCTGAAGTATCCGATAGAACACG-3' hacia adelante y hacia atrás 5'-CACCATCTCCAGAGTCCAGCACAAT-3', y los cebadores utilizados para fibronectina fueron hacia adelante 5'-TCTGGGAAATGGAAAAGGGGAATGG-3' y hacia atrás 5'-CACTGAAGCAGGTTTCCTCGGTTGTGT-3'.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar inmunohistoquímica como se describe a continuación.<ol><li>Deshidratar el pulmón izquierdo, incrustarlo y cortarlo con una cortadora de parafina hasta un espesor de 4 μm.</li>
		<li>Coloque las secciones de tejido en portaobjetos y hornee los portaobjetos en un horno a 65-70 ° C durante 30 min a 1 h. Desparafinar los portaobjetos con un porcentaje decreciente de alcohol (es decir, 100%, 95%, 90%, 80% y 70% de alcohol) durante 5 min.</li>
		<li>Manchar los portaobjetos en solución de colorante de hematoxilina (analíticamente pura) durante 5 min. Luego, lave los toboganes con agua del grifo. Remoje los portaobjetos en alcohol de ácido clorhídrico al 1% durante 3 s, lave el color flotante y sumérjase en agua corriente durante 5 minutos. Las secciones se volverán azules.</li>
		<li>Sumérjase en una solución de eosina durante 10 s a 1 min (determine el tiempo de teñido según el color), lave con agua del grifo y coloque en alcohol al 70%, 80%, 95%, 100% y 100%, respectivamente, durante 5 min cada uno. Luego coloque las diapositivas en soluciones de xileno I y xileno II durante 3 min. Después del secado, observe y tome fotos bajo el microscopio vertical con una película de sellado adhesiva neutra.</li>
		<li>Realizar la puntuación de Ashcroft en las secciones para indicar la gravedad de la fibrosis pulmonar10. Realizar análisis estadísticos de los datos utilizando una prueba t de dos muestras independientes.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Heukels, P., Moor, C. C., vonder Thüsen, J. H., Wijsenbeek, M. S., Kool, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+immunity+in+IPF+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inflammation and immunity in IPF pathogenesis and treatment.</a> Respiratory Medicine. 147, 79-91 (2019).</li>
<li>Zhang, Y., Zhang, Y., Li, X., Zhang, M., Lv, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+of+circular+RNA+expression+patterns+in+polarized+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis of circular RNA expression patterns in polarized macrophages.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (2), 373-379 (2017).</li>
<li>Lee, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+macrophages+in+the+development+of+acute+and+chronic+inflammatory+lung+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The role of macrophages in the development of acute and chronic inflammatory lung diseases.</a> Cells. 10 (4), 897(2021).</li>
<li>Luzina, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-33+potentiates+bleomycin-induced+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-33 potentiates bleomycin-induced lung injury.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (6), 999-1008 (2013).</li>
<li>Nie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AKT2+regulates+pulmonary+inflammation+and+fibrosis+via+modulating+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">AKT2 regulates pulmonary inflammation and fibrosis via modulating macrophage activation.</a> Journal of Immunology. 198 (11), 4470-4480 (2017).</li>
<li>Qian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+PU.1+promotes+alternative+macrophage+polarization+and+asthmatic+airway+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The transcription factor PU.1 promotes alternative macrophage polarization and asthmatic airway inflammation.</a> Journal of Molecular Cell Biology. 7 (6), 557-567 (2015).</li>
<li>Shah, S., Dhawan, V., Holm, R., Nagarsenker, M. S., Perrie, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes%3A+Advancements+and+innovation+in+the+manufacturing+process%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Liposomes: Advancements and innovation in the manufacturing process.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 154 (155), 102-122 (2020).</li>
<li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+are+critical+for+broadly-reactive+antibody-mediated+protection+against+influenza+A+virus+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages are critical for broadly-reactive antibody-mediated protection against influenza A virus in mice.</a> Nature Communications. 8 (1), 846(2017).</li>
<li>Eyal, F. G., Hamm, C. R., Parker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+in+alveolar+macrophages+attenuates+acute+ventilator+induced+lung+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reduction in alveolar macrophages attenuates acute ventilator induced lung injury in rats.</a> Intensive Care Medicine. 33 (7), 1212-1218 (2007).</li>
<li>Hübner, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+quantification+of+pulmonary+fibrosis+in+histological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples.</a> Biotechniques. 44 (4), 507-517 (2008).</li>
<li>Tacke, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immature+monocytes+acquire+antigens+from+other+cells+in+the+bone+marrow+and+present+them+to+T+cells+after+maturing+in+the+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immature monocytes acquire antigens from other cells in the bone marrow and present them to T cells after maturing in the periphery.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 583-597 (2006).</li>
<li>Byrne, A. J., Maher, T. M., Lloyd, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+macrophages%3A+A+new+therapeutic+pathway+in+fibrosing+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pulmonary macrophages: A new therapeutic pathway in fibrosing lung disease.</a> Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 303-316 (2016).</li>
<li>Wendisch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+infection+triggers+profibrotic+macrophage+responses+and+lung+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 infection triggers profibrotic macrophage responses and lung fibrosis.</a> Cell. 184 (26), 6243-6261 (2021).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%3A+Friend+or+foe+in+idiopathic+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Research%22%5BJournal%5D)">Macrophages: Friend or foe in idiopathic pulmonary fibrosis.</a> Respiratory Research. 19 (1), 170(2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.

Este estudio proporciona un método eficaz para agotar, aislar, cultivar y transferir macrófagos, lo que puede ayudar a estudiar los mecanismos de la fibrosis pulmonar en ratones. Existen muchos métodos para el agotamiento de macrófagos en ratones, como la administración traqueal, la inyección de venas de la cola y la inhalación nasal11. Este estudio optimizó el método de inhalación nasal, que es fácil de operar y puede agotar eficazmente los macrófagos pulmonares 8,9</...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64742">Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo</a>. The Protocol section was updated.
Step 2.1 of the Protocol was updated from:
Anesthetize the host mouse with 3% isoflurane, and then euthanize it by cervical dislocation. Disinfect the skin of the euthanized mouse with 75% alcohol and iodine. Use scissors to cut through the skin and expose the cardiopulmonary tissue
to:
Anesthetize the host mouse&#160;with an intraperitoneal injection of Ketamine (120 mg/kg) and Xylazine (16 mg/kg). Confirm the depth of anesthesia via loss of the toe pinch reflex. Apply veterinary ointment to both eyes to prevent dryness under anesthesia. Then, disinfect the skin of the anesthetized mouse with 75% alcohol and iodine. Use scissors to cut through the skin and expose the cardiopulmonary tissue

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64742">Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo</a>. The Protocol section was updated.

Erratum: Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo

La fibrosis pulmonar idiopática (FPI) es una enfermedad inflamatoria pulmonar difusa causada por muchos factores1. En el microambiente de citoquinas de la respuesta inmune Th1 y Th2, los macrófagos pueden polarizarse en macrófagos activados clásicamente (M1) y macrófagos activados alternativamente (M2). Los lipopolisacáridos (LPS) o la citoquina IFN-γ inducen a los macrófagos M1 a polarizarse y producir citoquinas proinflamatorias, incluyendo iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α e IL-12. En contraste, las citoquinas tipo II IL-4 e IL-13 impulsan la polarización de los macrófagos M2, que pueden producir diferentes factores promotores del crecimiento de fibroblastos, como TGF-β y PDGF, que promueven la fibrosis pulmonar2. El proceso patológico de la FPI se acompaña de activación e infiltración de macrófagos. La FPI media la reparación de lesiones, la inflamación y la fibrosis a través de la liberación de citoquinas3. Como solo se dispone de opciones terapéuticas limitadas, explorar los mecanismos patológicos moleculares de la FPI tiene gran importancia para desarrollar nuevas estrategias para la prevención y el tratamiento de la FPI. Estudios previos realizados por nuestro grupo y otros investigadores 4,5 han confirmado el aumento de la liberación de IL-33 en pacientes con FPI y en modelos de ratón con FPI inducida por bleomicina (BLM). La IL-33 es liberada por las células epiteliales y endoteliales durante la fibrosis y está involucrada en la activación de macrófagos, lo que resulta en la proliferación anormal de fibroblastos, la infiltración de leucocitos y la eventual pérdida de la función pulmonar5. El protocolo actual describe la transferencia adoptiva de macrófagos intersticiales (IM) estimulados por IL-33 en los alvéolos como un medio para estudiar el desarrollo de FPI en modelos de ratón. Aquí, los IM se aislaron del tejido pulmonar de ratones huéspedes, se cultivaron in vitro, se estimularon con IL-33 durante 24 h y luego se transfirieron adoptivamente a los alvéolos de los ratones receptores mediante inyección traqueal. Se encontró que la recolección directa de macrófagos de ratón estimulados y su transferencia adoptiva a los alvéolos receptores agrava el grado de fibrosis pulmonar y puede ilustrar más claramente la influencia de los factores estimulantes en la fibrosis en comparación con los estudios previos6. La técnica descrita en este documento puede permitir a los investigadores explorar la función de los macrófagos estimulados por citoquinas potenciales en el desarrollo de la FPI.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; DMEM</td><td>Life technologies Biotechnology,EE. UU.</td><td>1508012</td><td></td></tr><tr><td>Aguja arterial permanente</td><td>B Braun Melsingen AG,Alemania</td><td>21G15G8393</td><td></td></tr><tr><td>BD&nbsp; Accuri&nbsp; C6 Plus</td><td>Becton Dickinson, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bleomicina</td><td>Biotang, EE. UU</td>. <td>Ab9465</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de dióxido de carbono</td><td>Thermo Forma, EE. UU.</td><td>Thermo Forma370</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>R& D Sistemas, EE. UU.</td><td>1124F</td><td></td></tr><tr><td>CD11c</td><td>R& D Systems, EE. UU.</td><td>N418</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular</td><td>Thermo Forma, EE. UU</td><td></td>. 174926 <td></td></tr><tr><td>Liposomas de clodronato&nbsp;</td><td>Liposomas de clodronato,Países Bajos</td><td>CI-150-150</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa A</td><td>Sigma-Aldrich, EE. UU.</td><td>10103578001</td><td></td></tr><tr><td>F4/80</td><td>R& D Systems, EE. UU.</td><td>521204</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células de halcón</td><td>Becton, Dickinson and Company, EE. UU</td>. <td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td> <td>Tecnologías de vida, EE. UU</td>. <td>1047571</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina eosina &nbsp;</td><td>Tecnología de Nanjing Jiancheng, China</td><td>06-570</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Sistema de detección de PCR</td><td>Roche, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Factor recombinante murino IL-33</td><td>Peprotech, EE. UU.</td><td>210-33</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Nikon</td><td>Nikon Corporation, Japón</td><td>941185</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina, estreptomicina</td><td>Tecnologías de la vida, EE. UU</td><td></td>. Fosfato 877113 <td></td></tr><tr><td> tampón (PBS)</td><td>Guangdong Huankai Tecnología microbiana, China</td><td>1535882</td><td></td></tr><tr><td>tampón de lisis RBC</td><td>Beyotime Biotechnology Company, China</td><td>C3702</td><td></td></tr><tr><td>ARN Isolater</td><td>Vazyme company, China</td><td>R401-01-AA</td><td>Reactivo de extracción de ARN total</td></tr><tr><td>RWD Máquina de anestesia por inhalación</td><td>Shenzhen Rayward Life Technology, China</td><td>R500</td><td></td></tr><tr><td>Parafina semiautomática cortadora</td><td>Leica, Alemania</td><td>LeicaRM2245</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Premix Ex Taq</td><td>Takara, Japón</td><td>410800</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina 0.25%</td><td>Life Technologies, Estados Unidos</td><td>1627172</td><td></td></tr></tbody></table>

transferencia adoptiva de macrófagos estimulados por il-33 en modelos de ratón inducidos por bleomicina para estudiar su efecto sobre la fibrosis pulmonar idiopática in vivo

Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo

La respuesta inflamatoria causada por la lesión pulmonar temprana es una de las causas importantes del desarrollo de la fibrosis pulmonar idiopática (FPI), que se acompaña de la activación de células inflamatorias como macrófagos y neutrófilos, así como la liberación de factores inflamatorios como TNF-α, IL-1β e IL-6. Se sabe que la inflamación temprana causada por macrófagos intersticiales pulmonares (IM) activados en respuesta a la estimulación de IL-33 desempeña un papel vital en el proceso patológico de la FPI. Este protocolo describe la transferencia adoptiva de IMs estimulados por IL-33 a los pulmones de ratones para estudiar el desarrollo de FPI. Implica el aislamiento y cultivo de MI primarios de pulmones de ratón huésped, seguido de la transferencia adoptiva de MI estimulados a los alvéolos de ratones receptores de FPI inducidos por bleomicina (BLM) (que han sido previamente agotados de macrófagos alveolares por tratamiento con liposomas clodronatos), y la evaluación patológica de esos ratones. Los resultados representativos muestran que la transferencia adoptiva de macrófagos estimulados por IL-33 agrava la fibrosis pulmonar en ratones, lo que sugiere que el establecimiento del experimento de transferencia adoptiva de macrófagos es un buen medio técnico para estudiar la patología de la FPI.

El protocolo utilizado aquí se resume en el diagrama de flujo de la Figura 1. La inhalación de liposomas de clodronato a través de la nariz (Figura 2) se utilizó para agotar los macrófagos pulmonares de ratones adultos C57BL / 6, y esto produjo un buen modelo de ratón receptor. Los IM pulmonares se aislaron de otro ratón no tratado (huésped) (Figura 3A, B) y se cultivaron in vitro. Los macrófagos aislados ...

Este protocolo describe el aislamiento de macrófagos intersticiales pulmonares (MI) y su transferencia adoptiva después de la estimulación de IL-33 de los alvéolos pulmonares en un modelo de ratón, lo que puede facilitar el estudio in vivo de la fibrosis pulmonar idiopática (FPI).

Transferencia adoptiva de macrófagos estimulados por IL-33 en modelos de ratón inducidos por bleomicina para estudiar su efecto sobre la fibrosis pulmonar idiopática in vivo

The inflammatory response caused by early lung injury is one of the important causes of the development of idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), which is ...

El protocolo describe el aislamiento del IMS pulmonar y la transferencia adoptiva después de la determinación de IL-33 en un modelo de ratón, lo que puede facilitar el estudio in vivo de la fibrosis pulmonar idiopática. La técnica permite a los investigadores explorar la función de los macrófagos, simulada por citoquinas tradicionales en el desarrollo de FPI. Para comenzar, saque el frasco de liposomas de clodronato del refrigerador.Deje que se caliente durante 30 minutos a temperatura ambiente e invierta varias veces para asegurar una mezcla uniforme. Aspirar 60 microlitros de liposomas de clodronato usando una pipeta con una punta de succión estéril. Administrar el control y el fármaco gota a gota en la cavidad nasal del ratón anestesiado.Después de cada gota, asegúrese de que el ratón inhale el medicamento por completo y respire uniformemente. Después del agotamiento de los macrófagos alveolares en el ratón receptor, comience desinfectando la piel del ratón huésped anestesiado con 75% de alcohol y yodo. Use tijeras para cortar a través de la piel y exponer el tejido cardiopulmonar.Aspire 10 mililitros de PBS en una jeringa equipada con una aguja de calibre 20 e inserte la punta de la aguja en la aurícula derecha del ratón. Luego corte la vena cava inferior del ratón con tijeras quirúrgicas y perfunda manualmente el ratón con PBS a una velocidad constante de 10 a 20 mililitros por minuto hasta que el tejido pulmonar se vuelva blanco. Además, extirpe el tejido pulmonar y transfiéralo a PBS helado en una placa de cultivo.Corte el tejido pulmonar en fragmentos y agregue 15 mililitros de medio DMEM que contenga 1% de colagenasa A para aislar los macrófagos, luego incube a 100 RPM durante 30 minutos en una mesa de agitación de 37 grados centígrados. Aspire la suspensión de tejido pulmonar aproximadamente 20 veces a través de una jeringa de 10 mililitros para que esté bien. Filtre la suspensión a través de un colador de células de 40 micrómetros.Centrifugar el filtrado a 400 G durante 10 minutos. Después de desechar el sobrenadante, lisar la sangre roja con tres mililitros de tampón de lisis celular en hielo durante dos o tres minutos. Centrifugar a 150 G durante cinco minutos y resuspender el pellet celular en 10 mililitros de DMEM.Luego cuente las células usando un hemocitómetro. Sembrar las células en una placa de cultivo celular adherente de 10 centímetros e incubar durante una hora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono para adherir los macrófagos intersticiales pulmonares a los platos. Después de una hora, aspire el sobrenadante y las células flotantes.Agregue 10 mililitros del medio de cultivo fresco y completo e incube durante más de ocho horas o durante la noche. Para estimular los macrófagos intersticiales aislados, sustituir el medio de cultivo gastado por un medio completo de interleucinas 33. También prepare una placa de control agregando PBS en lugar de interleucinas 33.Incubar las placas durante 24 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Para disociar los macrófagos intersticiales pulmonares, trátelos con un mililitro de tripsina al 0,25% durante cinco minutos. Luego agregue tres mililitros de medio completo de cultivo fresco para calmar la digestión y centrifugar la suspensión celular para cosechar los macrófagos pulmonares.Después de contar las células, resuspender las células en PBS a una concentración final de cinco veces 10 a la quinta célula por 50 microlitros. Para comenzar la transferencia de macrófagos intersticiales, fije las extremidades del ratón receptor anestesiado en una placa vertical con cinta médica y tire suavemente de la lengua del ratón hacia un lado, usando un hisopo de algodón. Después de encender la lámpara de intubación, póngala en la garganta del ratón para ver la tráquea, que debe estar cerca de la base de la lengua.Inserte la cánula de aguja permanente en la tráquea con la lámpara de intubación de calibre 22 y el alambre guía de 0,4 milímetros de diámetro. Para finalizar la intubación, retire el alambre guía y empuje la cánula en la tráquea del ratón. Ahora inyecte 50 microlitros de la suspensión celular en el ratón receptor a través de la tráquea cuando se vea que la cánula entra en la tráquea.Después de 24 horas, administrar bleomicina a través de la tráquea para inducir fibrosis pulmonar idiopática. También administrar un volumen igual de solución salina al grupo de control. Después de 21 días, determinar el grado de gravedad de la fibrosis pulmonar mediante la evaluación de la expresión de marcadores de fibrosis y las puntuaciones de Ashcroft.La tinción HE mostró que la transferencia adoptiva de macrófagos estimulados por interleucinas 33 exacerbó el grado de destrucción del tejido pulmonar y aumentó la agregación de fibroblastos en los ratones estimulados por bleomicina, en comparación con el control. El aumento en la puntuación de Ashcroft también ilustra el grado de fibrosis pulmonar. Los niveles de expresión de ARNm de alfa SMA y fibronectina en los tejidos pulmonares del ratón receptor que contenía macrófagos intersticiales estimulados con interleucinas 33 transferidas adoptivamente y tratados con bleomicina fueron más altos, en comparación con los de los ratones de tipo salvaje tratados con BLM.Se deben ingresar inmediatamente 500 microlitros de aire en los pulmones con una jeringa de un milímetro para garantizar que la suspensión celular en la cánula pueda ingresar completamente al tejido pulmonar.

adoptive-transfer-il-33-stimulated-macrophages-into-bleomycin-induced

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Describimos a un no-invasivo multimodal enfoque basado en la tomografía molecular Micro-CT y la fluorescencia para la evaluación longitudinal del modelo ratón pulmonar la fibrosis inducido por la instilación intratraqueal doble de bleomicina la proyección de imagen.

Un Multimodal enfoque de imagen basados en tomografía Molecular Micro-CT y la fluorescencia para la evaluación Longitudinal de la Fibrosis pulmonar inducida por bleomicina en ratones

Se describe un método para mejorar considerablemente orthotopic engraftment de células de cáncer de pulmón en los pulmones murinos por acondicionamiento previo de las vías respiratorias con lesiones. Este enfoque también puede aplicarse para estudiar las interacciones estromales dentro del microambiente de la pulmonar, diseminación metastásica, comorbilidades de cáncer de pulmón, y generar más eficientemente paciente derivados de xenoinjertos.

Acondicionamiento previo de las vías respiratorias de los ratones con bleomicina aumenta la eficacia del pulmón Orthotopic Engraftment de la célula de cáncer

Aquí presentamos un método eficaz para investigar la actividad antifibrotica de las células mesenquimales humanas infundidas por vía intravenosa obtenidas de todo el cordón umbilical tras la inducción de la lesión pulmonar mediante una inyección endotraqueal de bleomicina en C57BL /6 ratones. Este protocolo se puede extender fácilmente a las pruebas preclínicas de otras terapias.

Inducción de lesión pulmonar de ratón por inyección endotraqueal de bleomicina

Se han establecido varios modelos animales de fibrosis pulmonar utilizando bleomicina para aclarar la patogenia de la fibrosis pulmonar y encontrar nuevas dianas farmacológicas. Sin embargo, la mayoría de los modelos de fibrosis pulmonar dirigidos al tejido pulmonar tienen una administración desigual del fármaco. En este trabajo se propone un modelo de fibrosis pulmonar uniforme inducida por la nebulización nasal de bleomicina.

Un modelo murino de fibrosis pulmonar inducida por nebulización nasal de bleomicina

Aquí, presentamos un protocolo para utilizar la micro-tomografía computarizada (micro-CT) para cuantificar las regiones ventiladas en un modelo de fibrosis pulmonar inducida por bleomicina unilateral a través de la instilación intratraqueal en el lado lesional.

Análisis unilateral del volumen pulmonar mediante micro-TC para mejorar la evaluación de la fibrosis pulmonar en modelos preclínicos

Este protocolo demuestra la técnica de aspiración orofaríngea para su uso en el modelo murino de fibrosis pulmonar con bleomicina.

Administración orofaríngea de bleomicina en el modelo murino de fibrosis pulmonar

La terapia celular ofrece una intervención prometedora para la fibrosis pulmonar mediante el uso de células progenitoras para reparar el tejido dañado y mejorar la función pulmonar. Dado que las imágenes desempeñan un papel fundamental en el seguimiento de la integración celular, en este trabajo describimos el seguimiento in vivo guiado por imágenes magnéticas de la terapia celular para la fibrosis pulmonar en un modelo de ratón.

Seguimiento in vivo guiado por imágenes de células progenitoras epiteliales pulmonares distales trasplantadas para fibrosis pulmonar mediante imágenes de partículas magnéticas

Este protocolo describe un método para inducir fibrosis pulmonar en ratones a través de la administración orofaríngea repetida de bleomicina, produciendo características patológicas muy parecidas a las de la fibrosis pulmonar idiopática.

Modelo murino refinado de fibrosis pulmonar idiopática

Aquí presentamos un protocolo para modelar la fibrosis pulmonar en ratones utilizando bleomicina aerosolizada administrada a través de la tráquea. Este método optimizado permite una administración uniforme, cuantitativa y precisa sin incisión quirúrgica, mejorando la reproducibilidad y fiabilidad de la fibrosis inducida por bleomicina.

Un método refinado de administración intratraqueal de bleomicina basado en aerosoles para modelos reproducibles y mínimamente invasivos de fibrosis pulmonar en ratones

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La metástasis experimentales y CTL Modelo inmunoterapia adoptiva de transferencia de ratón

Aprende a aislar macrófagos intersticiales pulmonares y transferirlos adoptivamente tras estimulación con IL-33 en modelo murino. Este método permite estudiar in vivo la fibrosis pulmonar idiopática.

Transferencia adoptiva de macrófagos estimulados por IL-33 en modelos de ratón inducidos por bleomicina para estudiar su efecto sobre la fibrosis pulmonar idiopática in vivo (Video) | JoVE Journal

Transferencia adoptiva de macrófagos estimulados por IL-33 en modelos de ratón inducidos por bleomicina para estudiar su efecto sobre la fibrosis pulmonar idiopática in vivo

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