Detección semicuantitativa de la actividad de la ARN polimerasa ARN-dependiente de proteína transcriptasa reversa de Telomerasa humana

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del ARN, como ¿cuál es la importancia biológica de RdRP o TERT en las células humanas? La principal ventaja de esta técnica es que este ensayo se establece como el primer método sensible para detectar la actividad humana de RdRP expresada en las células. Comience este procedimiento con la preparación de las células HeLa como se describe en el protocolo de texto.

Lave las células una vez con 10 mililitros de PBS. A continuación, centrifugar la muestra a 1.450 veces la gravedad durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante. Utilice un mililitro de tampón de lisis A helado por cada 10 millones de células para lisar las células mediante un pipeteo suave.

Sonicar la muestra en un tubo de 1,5 mililitros a una amplificación del sonicador del 25% durante 10 segundos. Tras la sonicación, centrifugar la muestra a 20.400 veces la gravedad durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Recoja el sobrenadante y transfiera un mililitro de cada uno de los sobrenadantes a tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Limpie previamente el lisado añadiendo 40 microlitros de perlas de proteína A-agarosa prelavadas por cada mililitro de lisado. Mezclar bien invirtiendo el tubo varias veces. Luego, gire la muestra durante 30 minutos a cuatro grados centígrados.

Centrifugar la muestra a 13.000 veces la gravedad durante un minuto a cuatro grados centígrados y recuperar el sobrenadante. A continuación, agregue 40 microlitros de perlas de proteína A-agarosa prelavadas y 10 microgramos de anticuerpo anti-TERT humano en el lisado previamente aclarado. Mezcle bien invirtiendo el tubo varias veces y gire la muestra a cuatro grados centígrados durante la noche.

Después de la centrifugación a 3.300 veces la gravedad durante 30 segundos a cuatro grados centígrados, elimine el sobrenadante. A continuación, lava las cuentas con Wash Buffer One. Agregue un mililitro de Wash Buffer One a las perlas y mezcle bien invirtiendo el tubo.

Luego, gire la muestra durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Centrifugar la muestra a 3.300 veces la gravedad durante 30 segundos a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante y repita este paso tres veces más.

Después del lavado de la solución de AGC como se describe en el protocolo de texto, trate las perlas con nucleasa microcócica resuspendiéndolas en 60 microlitros de la mezcla de reacción de nucleasa microcócica mediante un pipeteo suave. A continuación, agite suavemente la muestra sobre un plato giratorio de un agitador colocado en una incubadora de tipo Peltier durante 15 minutos a 25 grados centígrados. Después de centrifugar la muestra a 3.300 veces la gravedad durante 30 segundos a cuatro grados centígrados, retire el sobrenadante.

Por último, lave las perlas dos veces con una solución de AGC que contenga tres milimolares de EGTA, y lave las perlas una vez con Wash Buffer Two como se describe en el protocolo de texto. Prepare la mezcla de reacción de RdRP en un tubo nuevo como se describe en el protocolo de texto. Agregue seis microlitros de trifosfato de uridina etiquetado en el grupo alfa fosfato con P dash 32 a la mezcla de reacción y mezcle bien pipeteando.

A continuación, añade un microlitro de ARN molde a la mezcla y mezcla bien. Vuelva a suspender las perlas con 20 microlitros de la mezcla de reacción RdRP resultante. A continuación, agite suavemente la muestra sobre una plataforma giratoria de un agitador colocado en una incubadora tipo Peltier durante dos horas a 32 grados centígrados.

Después de la incubación, agregue 5,4 microlitros de 20 miligramos por mililitro de proteinasa K y 45,4 microlitros de tampón 2X Proteinasa K a la mezcla de reacción. Mezclar por pipeteo, y agitar la muestra en una incubadora tipo Peltier durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Después de añadir 109,2 microlitros de agua libre de RNasa a la muestra, añadir 200 microlitros de fenol-cloroformo ácido.

Mezclar bien por vórtice antes de centrifugar la muestra a 21, 100 veces la gravedad durante cinco minutos a temperatura ambiente. Transfiera la fase acuosa a un nuevo tubo. Repita este paso una vez.

Luego, agregue 20 microlitros de acetato de sodio de tres molares, pH 5.2, cuatro microlitros de portador de precipitación y 250 microlitros de etanol a la fase acuosa. Agite bien el tubo para mezclar. Centrifugar la muestra a 21,100 veces la gravedad durante 20 minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante.

A continuación, lave el pellet con 300 microlitros de etanol frío al 70% por volumen almacenado a menos 20 grados centígrados. Centrifugar la muestra a 21,100 veces la gravedad durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y seque al aire el pellet.

Vuelva a suspender el pellet en 20 microlitros de agua libre de RNasa. Prepare la mezcla de reacción de ARNasa en un tubo nuevo como se describe en el protocolo de texto. Agregue 180 microlitros de la mezcla de reacción de ARNasa a la muestra.

Luego, incuba el tubo durante dos horas a 37 grados centígrados. Añadir 2,3 microlitros de 10%volumen por volumen SDS a la muestra, e incubar durante 15 minutos a 37 grados centígrados. A continuación, se añaden dos microlitros de 20 miligramos por mililitro de proteinasa K a la muestra, y se incuba durante otros 15 minutos a 37 grados centígrados.

Ahora, agregue 205 microlitros de fenol-cloroformo ácido a la muestra. Después de mezclar y centrifugar como antes, transfiera la fase acuosa a un nuevo tubo. Agregue acetato de sodio tres molares, portador de precipitación y etanol a la fase acuosa, seguido de mezclar, centrifugar y lavar el pellet como se realizó anteriormente.

A continuación se muestran tres resultados representativos del ensayo IP-RdRP en células HeLa tratadas con nocodazol o DMSO para células no manipuladas. Se utilizó un ARN de 34 nucleótidos sintetizado químicamente como plantilla. Después de la exposición durante la noche, los productos de RdRP se pueden ver entre 20 y 30 nucleótidos, específicamente en las células HeLa dentro de la fase mitótica.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo detectar la actividad RdRP de TERT humano.