Cuantificación de lípidos abundancia y evaluación de la distribución de lípidos en Caenorhabditis elegans por Nilo rojo y aceite rojo O manchas

El objetivo general de estos métodos de tinción es cuantificar la abundancia de lípidos intracelulares y evaluar la distribución de lípidos entre diferentes tejidos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el metabolismo de los lípidos, como por ejemplo, cómo se regulan genética y bioquímicamente los lípidos y qué estados de enfermedad regulan la homeostasis de los lípidos. La principal ventaja de esta técnica es que es relativamente sencilla y económica de llevar a cabo.

Para llevar a cabo la tinción de lípidos rojos del Nilo, coloque lombrices en placas en un medio de crecimiento de nematodos o NGM sembrado con E. coli de registro tardío OP50 y cultive las lombrices a 20 grados Celsius hasta la etapa L4 temprana. Lave los gusanos con un milímetro de solución PBST y transfiera la suspensión del gusano a un tubo de microfuga de 1,5 mililitros. Centrifuga los gusanos a 560 veces la gravedad durante un minuto.

A continuación, retire el sobrenadante y repita el lavado con PBST hasta que la E. coli se elimine de la suspensión. A continuación, al gránulo de gusano, agregue 100 microlitros de 40% de isopropanol o 60% para tinción ORO e incube la muestra a temperatura ambiente durante tres minutos. La adición de isopropanol es crucial para la correcta permeabilización de los gusanos antes de la tinción.

Centrifugar los gusanos a 560 veces la gravedad durante un minuto y eliminar el sobrenadante sin alterar la pelletza del gusano. Es importante minimizar la exposición a la luz durante las etapas de centrifugación. Ahora, mientras está en la oscuridad, agregue 600 microlitros de solución de trabajo NR previamente preparada a cada muestra.

Invierta los tubos tres veces y mezcle completamente los gusanos y la solución. A continuación, incubar la muestra en la oscuridad a temperatura ambiente durante dos horas. Después de la incubación, centrifugar los gusanos y eliminar el sobrenadante.

A continuación, añada 600 microlitros de PBST e incube las muestras en la oscuridad durante 30 minutos para eliminar el exceso de tinción NR. Después de volver a centrifugar las muestras como antes, retire todo menos aproximadamente 50 microlitros de sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo de gusano en la solución restante. Para preparar los portaobjetos para la obtención de imágenes, pipetee cinco microlitros de suspensión de gusano en un portaobjetos de microscopio y aplique cuidadosamente un cubreobjetos para evitar atrapar burbujas de aire.

Utilizando el canal FITC GFP para obtener imágenes de gusanos teñidos con NR y probando diferentes tiempos de exposición, obtenga imágenes de los gusanos con un aumento de cinco veces para capturar varios animales por campo de visión. A continuación, cambie a un aumento de 10 veces para una mejor cuantificación de los gusanos individuales. Para cuantificar las imágenes, cargue las micrografías en ImageJ.

En el menú desplegable de la imagen, ajuste el brillo, el contraste de la presentación de imágenes y propague los cambios a todas las imágenes haciendo clic en aplicar. Utilice la herramienta de selección de polígonos para delinear cada gusano con imagen y, en el menú desplegable de análisis, utilice la función de medición para calificar la intensidad de fluorescencia emitida por NR. Para cada imagen, mida cinco ubicaciones de fondo y calcule la intensidad media de fluorescencia de fondo. Añadir 600 microlitros de solución de trabajo Oil Red O o ORO a cada muestra e invertir el tubo tres veces para mezclar bien los gusanos y el ORO.

Gire las muestras a 30 RPM y RT durante dos horas. Centrifugar las muestras a 560 veces la gravedad durante un minuto y aspirar todo el sobrenadante excepto 100 microlitros. A continuación, utilice 600 microlitros de PBST para volver a suspender las muestras y gire los tubos a 30 RPM durante 30 minutos para eliminar el exceso de tinción de ORO.

Para distinguir mejor la ubicación de la línea germinal de los animales en las células intestinales, tiña los núcleos añadiendo un microlitro de DAPI por cada mililitro de solución de trabajo de ORO. Luego, para preparar los portaobjetos para la toma de imágenes, vuelva a suspender los gusanos y el sobrenadante restante y mezcle bien la solución. Coloque cinco microlitros de suspensión de gusano en un portaobjetos de microscopio y aplique con cuidado un cubreobjetos asegurándose de que no se formen burbujas de aire.

Para obtener imágenes de los gusanos teñidos con ORO, utilice una cámara a color con un aumento quíntuple para obtener imágenes de varios gusanos en un campo de visión. A continuación, cambie a un aumento de 10 veces para un mejor examen de los gusanos individuales. Finalmente, después de subir las imágenes a ImageJ y crear una plataforma de imágenes de acuerdo con el protocolo de texto, clasifique las imágenes de acuerdo con la acumulación de lípidos en todo el cuerpo del animal o en tejidos específicos.

SKN-1 comparte homología con Nrf2 de mamíferos y se ha demostrado que media en la oxidación de ácidos grasos. Esta figura muestra animales con SKN-1 activados expuestos a condiciones que conducen a un aumento de los niveles de lípidos. Como se ve en estas imágenes, la fluorescencia NR capturada con el canal FITC GFP es prominente a lo largo del intestino, pero es más tenue en la cabeza, la cola y el lumen intestinal.

Si bien es fácil clasificar los gusanos de acuerdo con la presencia o ausencia de agotamiento somático de grasa dependiente de la edad o ASDF, puede ser difícil identificar animales con pérdida de grasa intermedia. En comparación con los animales sin ASDF, que muestran manchas de color rojo brillante en todo el cuerpo con pocas áreas translúcidas, los gusanos ASDF exhiben un notable agotamiento de grasa en las células intestinales. Los animales en proceso de desarrollo de ASDF a menudo muestran manchas translúcidas donde eventualmente ocurre la mayor parte de la pérdida de grasa.

Además, los gusanos ASDF aún pueden presentar tinciones de color rojo brillante en las regiones de la cabeza y la cola porque el fenotipo no se define por la pérdida completa de grasa somática, sino por el agotamiento extenso de la grasa en relación con los animales no envejecidos. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres horas más el tiempo de imagen si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar lavar y permeabilizar los gusanos no más de 30 minutos antes de teñirlos.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la microscopía CARS para comparar el tipo de especies lipídicas que identifica cada tecnología y determinar qué método es el más adecuado para tipos específicos de preguntas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cuantificar los lípidos y evaluar la distribución de lípidos en los gusanos utilizando la tinción de Nilo Red y Oil Red O, seguida de un análisis de micrografía ImageJ.