Name: Un método simplificado y eficiente para aislar Keratinocytes humanos primarios de tejido adulto de la piel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Aprenda a aislar queratinocitos humanos primarios de piel adulta mediante un protocolo simplificado con inhibidor ROCK. Este método eficiente mejora el rendimiento celular para aplicaciones en biología celular y medicina regenerativa.

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Este trabajo fue apoyado por el nacional clave de investigación y desarrollo programa de China (2017YFA0104604), el Programa General de la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (NSFC, 81772093), la ciencia y la tecnología desarrollo programa de Suzhou (ZXL2015128), la Fundación Ciencias naturales de la provincia de Jiangsu (BK20161241) y un Shandong Taishan Scholar Award (tshw201502065).

Tejidos humanos utilizados en este protocolo se han manejado según las directrices del Comité de ética de investigación de la institución (NO.2015120401, fecha: 12 de mayo de 2015).
1. preparaciones
<ol><li>Tejidos de la piel abdominal adulto fresco recoger descartados de cirugía plástica en el hospital en un tubo de 50 mL con 10 mL de Dulbecco helada de modificado medio de Eagle (DMEM). La muestra puede conservarse a 4 ° C hasta 72 h sin afectar significativamente la viabilidad de las células.</li>
	<li>Preparar los reactivos y el medio de cultivo como se describe a continuación.<ol>
<li>Añadir 1 mL de la penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (100 mg/L) a 50 mL de solución tampón fosfato (PBS) para preparar la solución de lavado.</li>
		<li>Preparar dos series de soluciones de digestión enzimática: (1) preparar 50 mL de dispase (2,5 mg/mL de DMEM) y 50 mL de tipo I colagenasa (2,5 mg/mL de DMEM) por separado por el método convencional; y (2) preparar 50 mL de una mezcla de dispase y colagenasa de tipo I (disolver 125 mg de polvo dispase y 125 mg de tipo I polvo de colagenasa en 50 mL de DMEM) para el nuevo método. Nota: Todas las soluciones de enzima deben ser filtradas con un filtro de 0,22 μm y debe mantenerse at4 ° C.</li>
		<li>Preparar soluciones de digestión para ambos métodos: tripsina 0,05% y 0,25% de tripsina fueron comprados comercialmente. Preparar un 10 mg/mL DNasa I solución disolviendo 50 mg de la ADNsa polvo en 5 mL de PBS, filtrar con un filtro de 0,22 μm y almacenar a-20 ° C.</li>
		<li>Preparar 500 mL de medio para neutralizar la digestión enzimática: medio DMEM suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina.</li>
		<li>Preparar 500 mL de medio de inoculación (que contienen factor de crecimiento medio, llamado G-medio): DMEM/F12 (3:1) medio que contiene 1% de penicilina/estreptomicina, 40 μg/mL fungizone, 40 ng/mL factor de crecimiento fibroblástico 2 (FGF2), ng/mL 20 factor de crecimiento epidérmico (EGF), y Suplemento del 2% B27.</li>
		<li>Trate de cultivo celular de 100 mm platos con 2 mL de la matriz de la capa que contiene tipo y colágeno durante 30 min a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. convencional método
<ol><li>
Pretratamiento del tejido de la piel
	<ol>
<li>Tomar 1,5 cm2 de tejido de la piel y lavarlo 1 x con 10 mL de PBS; Luego, lo enjuague con 10 mL de etanol al 70% durante 30 s e incubarlo 2 x con 10 mL de solución (PBS conteniendo 2% penicilina y estreptomicina), de lavado de 5 minutos cada uno. Nota: Todos los lavados se realizan en platos de cultivo celular de 100 mm dentro de una campana de flujo laminar.</li>
		<li>Corte el tejido con tijeras estériles en eliminar la capa de grasa subcutánea en una placa de cultivo celular de 100 mm y, luego, pesan el tejido de la piel (el peso es 1 g en este protocolo). Nota: Recorte suficiente es esencial para la eficiente separación de la epidermis de la dermis. La capa de grasa amarillenta se puede fácilmente distinguir visualmente.</li>
		<li>Transferir el tejido a otro recipiente estéril de 100 mm con la parte de la dermis hacia abajo y, a continuación, cortar el tejido de la piel en tiras de 3 a 4 mm de ancho con una hoja de bisturí. Nota: La parte de la dermis con la capa de grasa es fácilmente reconocible visualmente.</li>
		<li>Añadir 10 mL de solución de dispase 2,5 mg/mL a los tejidos de la piel en una placa de cultivo de 100 mm y, a continuación, incubar el plato durante la noche a 4 ° C (no más de 20 h). Nota: La cantidad de solución dispase puede calcularse utilizando 10 mL de solución dispase para la digestión de cada gramo de tejido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Separación de la epidermis de los tejidos de la piel
	<ol>
<li>En el segundo día, desprenda la epidermis de la dermis con unas pinzas finas. Nota: Si es difícil despegarse de la epidermis, la digestión del dispase no era suficiente, que suele ser debido al ajuste insuficiente del tejido. En este caso, el tejido necesita más tiempo de incubación.</li>
		<li>Pique la epidermis pelada con 500 μl de medio de cultivo celular en una mezcla de tejido usando cuchillas de bisturí; Luego, suspender con 10 mL de tripsina 0,25% en un tubo de 50 mL y lo Incube 20 min en un baño de agua a 37 ° C, con agitación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recolección y cultivo de células primarias
	<ol>
<li>Neutralizar la actividad de tripsina agregando un volumen igual de solución de neutralización (10 mL en este protocolo).</li>
		<li>Disociar las células epidérmicas por la solución de arriba y abajo 20 x el pipeteo con una pipeta serológica de 10 mL y pasar la solución de células a través de un colador de celda de 100 μm para eliminar cualquier residuo de tejido residual.</li>
		<li>Centrifugue la solución celular a 200 x g durante 5 minutos después de la filtración; Resuspender el precipitado de células en medio de neutralización para el lavado y, a continuación, centrifugar nuevamente a 200 x g para obtener el precipitado de células.</li>
		<li>Resuspender el precipitado de células en 10 mL de medio de keratinocyte baja en calcio, libre de suero (SFM). Tomar 10 μl de esta solución de contar el número total de células y, luego, la placa de aproximadamente 2 x 106 células con 10 mL de la OFS en 100 mm de la célula cultura platos pretratados con la matriz de la capa (que contiene colágeno tipo I). Nota: La capa es un paso necesario para el método convencional.</li>
		<li>Cambiar el medio de cultivo cada 2 d. Nota: Verifique la adhesión celular al microscopio antes y después de cambiar el medio de cultivo.</li>
		<li>Las células de paso al llegar a cerca de 80% confluencia. Nota: Todos los platos de cultura son pretratados con la matriz de la capa.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. el nuevo método
<ol><li>
Pretratamiento del tejido de la piel
	<ol>
<li>Recoger el tejido tal como se describe arriba (paso 2.1) para el método convencional.</li>
		<li>Lavar el tejido de la piel 1 x con 10 mL de PBS y, a continuación, pesar en un recipiente de plástico estéril por una balanza electrónica (el peso es alrededor de 1 g en este protocolo). Nota: El peso mínimo del tejido necesario para este protocolo es 0.1 g, ya que es difícil obtener un número suficiente de células si la muestra de tejido que se utiliza es muy pequeña. No hay ningún peso máximo del tejido de este protocolo, que en última instancia depende de la capacidad de manejo del operador.</li>
		<li>Utilice pinzas para enjuagar el tejido de la piel con 10 mL de etanol al 70% durante 30 s.</li>
		<li>Incubar el tejido 2 x con 10 mL de solución (preparado en el paso 2.1.1), durante 5 minutos de lavado cada vez. Nota: Todos los pasos de lavado señalados se realizan en platos de cultivo celular de 100 mm dentro de una campana de flujo laminar (una campana de cultivo de tejidos).</li>
		<li>Transferir el tejido a otro recipiente estéril de 100 mm de la célula cultura.</li>
		<li>Usando las hojas de bisturí, pique bien el tejido en una mezcla de tejido.</li>
		<li>Añadir 200 μL de PBS a cada 5 min para mantener los tejidos húmedos. Nota: Tomar alrededor de 15 minutos para los pasos 3.1.5 - 3.1.7. Todos los pasos anteriores se realizan a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Digestión de los tejidos de la piel
	<ol>
<li>Transferir la solución del tejido homogeneizado en un tubo de 50 mL. Añadir 10 mL de mezcla de enzimas para cada 1 g de tejido de la piel. Homogeneizar las enzimas de los tejidos homogeneizados.</li>
		<li>Incubar la mezcla con agitación en un baño de agua a 37 ° C durante 1 h.</li>
		<li>Añadir un volumen de 1/5 de tripsina 0,25% (2,5 mL en este protocolo) a la mezcla de digestión por otro 30 min en un baño de agua a 37 ° C.</li>
		<li>Agregar ADNasa solución a la mezcla de enzima en una proporción de 1: 100 (v/v) (250 μl de este protocolo) e incubar por 5 min a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recolección y cultivo de células primarias
	<ol>
<li>Detener el proceso de digestión mediante la adición de 12,5 mL de medio de neutralización en una proporción 1:1. Pipetear la solución hacia arriba y hacia abajo para cerca de 20 x, utilizando una pipeta serológica de 10 mL para disociar las células.</li>
		<li>Filtrar las células disociadas a través de un colador de celular 100 μm para eliminar los desechos de tejido. Centrifugar el sobrenadante a 200 x g durante 5 min observar el sedimento en el fondo del tubo.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante y lavar el sedimento celular con 10 mL de medio de neutralización y centrifugar nuevamente a 200 x g durante 5 minutos recoger las células.</li>
		<li>Resuspender el precipitado de células en 10 mL de medio de inoculación (G-medio de paso 1.2.5) con 10 μm de Y-27632.</li>
		<li>Tomar 10 μl de la solución para contar el número total de células y, entonces, la placa de unos 2 x 106 células con 10 mL de medio G en una placa de cultivo de 100 mm de la célula. Nota: El paso de diatomeas no es necesario para el nuevo método, y no retiro de la capa dérmica se requiere ya sea.</li>
		<li>Después de 3 d, sustituir el medio de inoculación con medio de SFM baja en calcio. Cambiar el medio de cultivo cada 2 d. Nota: Verifique la adhesión celular antes y después de cambiar el medio.</li>
		<li>Las células de paso al llegar a cerca de 80% confluencia. Nota: Si es necesario, use las células con tripsina 0,05% por 2 min y lavar las células con PBS para eliminar contaminantes de las células cutáneas antes de trypsinizing las células epidérmicas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. célula pases
<ol><li>Quitarlo del medio, lavan las células con PBS y, luego, añadir 2 mL de tripsina 0,05% (por cada plato 100 mm).</li>
	<li>Incubar las células en una incubadora (37 ° C con 5% CO2) durante 5 minutos.</li>
	<li>Compruebe las células utilizando un microscopio para asegurarse de que todas las células han separado de la placa de cultivo.</li>
	<li>Añada 8 mL de DMEM con 10% FBS para neutralizar la reacción enzimática y, luego, recoger las células en un tubo de 15 mL.</li>
	<li>Centrifugue a 200 x g durante 5 min obtener el precipitado de células.</li>
	<li>Quite el sobrenadante lentamente y, luego, Resuspender el pellet celular con 10 mL de medio SFM y contar el número de células.</li>
	<li>Placa de 1 x 106 células con 10 mL de la OFS en cada plato de 100 mm de la célula.</li>
	<li>Cambiar el medio cada 2 días.</li>
</ol>

<ol><li>Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cells+in+Skin+Regeneration%2C+Wound+Healing%2C+and+Their+Clinical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).</li>
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<li>Kamstrup, M., Faurschou, A., Gniadecki, R., Wulf, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+stem+cells+-+role+in+normal%2C+wounded+and+pathological+psoriatic+and+cancer+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Epidermal stem cells - role in normal, wounded and pathological psoriatic and cancer skin.</a> Current Stem Cell Research & Therapy. 3 (2), 146-150 (2008).</li>
<li>Blanpain, C., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+stem+cells+of+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Epidermal stem cells of the skin.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (22), 339-373 (2006).</li>
<li>Guo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+microphysiological+skin+model+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research & Therapy. 4 (S1), S2(2013).</li>
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<li>Bayati, V., Abbaspour, M. R., Neisi, N., Hashemitabar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin-derived+precursors+possess+the+ability+of+differentiation+into+the+epidermal+progeny+and+accelerate+burn+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Skin-derived precursors possess the ability of differentiation into the epidermal progeny and accelerate burn wound healing.</a> Cell Biology International. 41 (2), 187-196 (2017).</li>
<li>Hirsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+the+entire+human+epidermis+using+transgenic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regeneration of the entire human epidermis using transgenic stem cells.</a> Nature. 551 (7680), 327-332 (2017).</li>
<li>Hentzer, B., Kobayasi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+human+epidermal+cells+from+fibroblasts+in+primary+skin+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Archiv+f%C3%BCr+dermatologische+Forschung%22%5BJournal%5D)">Separation of human epidermal cells from fibroblasts in primary skin culture.</a> Archiv für dermatologische Forschung. 252 (1), 39-46 (1975).</li>
<li>Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+procurement+of+epithelial+stem+cells+from+human+tissue+specimens+using+a+Rho-associated+protein+kinase+inhibitor+Y-27632%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632.</a> Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).</li>
<li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibitor+Y-27632+increases+the+cloning+efficiency+of+limbal+stem%2Fprogenitor+cells+by+improving+their+adherence+and+ROS-scavenging+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (7), 531-537 (2013).</li>
<li>Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Rho-associated+protein+kinase+%28ROCK%29+inhibitor+to+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 114 (6), 577-581 (2012).</li>
<li>Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Y-27632+simplifies+the+isolation+procedure+of+human+primary+epidermal+cells+by+selectively+blocking+focal+adhesion+of+dermal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), e1251-e1255 (2018).</li>
<li>Zou, D., Pan, J., Zhang, P., Wu, X. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/306307941_A_new_method_to_isolate_human_epidermal_keratinocytes">A new method to isolate human epidermal keratinocytes.</a> Journal of Clinical Dermatology (in Chinese). 6, 424-429 (2016).</li>
<li>Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfollicular+epidermal+stem+cells%3A+boosting+and+rescuing+from+adult+skin%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin).</a> Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).</li>
<li>Candi, E., Schmidt, R., Melino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cornified+envelope%3A+a+model+of+cell+death+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The cornified envelope: a model of cell death in the skin.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (4), 328-340 (2005).</li>
<li>Breyer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Rho+kinases+increases+directional+motility+of+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Rho kinases increases directional motility of microvascular endothelial cells.</a> Biochemical Pharmacology. 83 (5), 616-626 (2012).</li>
<li>Wozniak, M. A., Modzelewska, K., Kwong, L., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+adhesion+regulation+of+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Focal adhesion regulation of cell behavior.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1692 (2-3), 103-119 (2004).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

HKCs primarias cultivadas han sido ampliamente utilizados para tratar heridas en clínicas durante más de tres décadas y, desde entonces, ha sido siempre importante obtener eficientemente un número suficiente de células para aplicaciones clínicas en tiempo y forma. Por lo tanto, en la práctica, el método de aislamiento convencional, que requiere la separación de la epidermis de la dermis, es difícil satisfacer estas demandas, debido al bajo rendimiento de las células y la baja capacidad de las células adultas de paso. Aqu...

El objetivo era desarrollar un protocolo sencillo y eficaz para aislar queratinocitos humanos primaria (HKCs) de tejidos adultos, especialmente para aplicaciones clínicas. La piel las células madre epidérmicas, localizadas en la capa basal de la piel, poseen un alto potencial para proliferar y diferenciarse y queratinocitos para mantener las funciones de la piel1,2,3, 4. HKCs aislados de la piel, los tejidos son ampliamente utilizados con fines piel tejido ingeniería y regeneración, especialmente en la reparación de la piel dañada y en terapia génica para aplicaciones clínicas5,6. La cuestión clave para aplicaciones basadas en HKC es aislar y ampliar el gran número de HKCs con alto potencial en vitro7,8. Aunque varios grupos de investigación han desarrollado métodos para producir cultivos de tallo-como HKCs, estos métodos son a veces lentos y complicados para realizar y tener otras limitaciones, tales como rendimientos bajos de células y está limitado por el tipo de espécimen de la piel usa9. Por ejemplo, el método tradicional para aislar HKCs de tejidos de la piel implica una digestión enzimática de dos etapas con una separación de la epidermis de la dermis6. Este método generalmente funciona bien para los tejidos neonatales, pero se hace muy difícil cuando se utiliza para aislar células de tejidos adultos.
Y-27632, un inhibidor de la cinasa de la proteína Rho (roca), se ha divulgado para mejorar significativamente la eficiencia de la célula de vástago epidérmicas aislamiento y Colonia de crecimiento10,11,12. En un estudio anterior, descubrimos que Y-27632 facilita el crecimiento clonal de las células epidérmicas, pero reduce el rendimiento de las células cutáneas controlando diferencialmente a la expresión de moléculas de adhesión13. También establecimos un nuevo medio de inoculación acondicionado, llamado G-medio, que apoya el crecimiento y rendimiento de las células epidérmicas primarias. Mediante la combinación de G-medio con Y-27632, este novedoso método espontáneamente puede separar las células epidérmicas y dérmicas después de la digestión de la enzima, eliminando así el paso de epidermis dermis separación13,14. Basado en informes anteriores, ahora Describimos el procedimiento detallado de este nuevo método para aislar HKCs del tejido de la piel adulta.

<table><tbody><tr><td>Contador de células automatizado Countess</td><td>Invitrogen Inc.&nbsp;</td><td>C10227</td><td>Conteo automático de células&nbsp;</td></tr><tr><td>Incubadora de CO2</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026333</td><td>para incubación celular</td></tr><tr><td>Centrífuga Sorvall ST 16R Centrífuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004380</td><td>Cell</td></tr><tr><td>Agitador de temperatura constante</td><td>Shanghai Boxun</td><td>150036</td><td>para baño de agua</td></tr><tr><td>Báscula electrónica</td><td>Harbin Zhonghui</td><td>1171193</td><td>Para el pesaje de tejidos</td></tr><tr><td>Plato de cultivo celular</td><td>Eppendorf</td><td>30702115</td><td>Para cultivo celular</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 50 ml</td><td>KIRGEN</td><td>171003</td><td>Para centrífuga celular</td></tr><tr><td>Filtro de células</td><td>Corning incorporado</td><td>431792</td><td>Filtración celular</td></tr><tr><td>Solución tamponada de fosfato</td><td>Solarbio Life Science&nbsp;</td><td>P1020-500</td><td>Solución de lavado</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Scientific</td><td>C11995500</td><td>Componente del medio de neutralización</td></tr><tr><td>Defined K-SFM</td><td>Life Technologies</td><td>10785-012 Medio de cultivo de</td><td>células epidérmicas</td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140-122</td><td>Antibióticos</td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino</td><td>Industrias Biológicas 04-001-1AC5</td><td></td><td>Componente del medio de neutralización</td></tr><tr><td>0.05% Tripsina</td><td>Life Technologies</td><td>25300-062</td><td>Para disociación de HKC</td></tr><tr><td>0.25% Trypsin&nbsp;</td><td>Beijing Solarbio Ciencia & Tecnología</td><td>T1350-100</td><td>Para la disociación de HKC</td></tr><tr><td>Kit de matriz de recubrimiento</td><td>Life Technologies</td><td>R-011-K</td><td>Para matriz de recubrimiento</td></tr><tr><td>Dispasa</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td>Para aislamiento de HKC</td></tr><tr><td>Colagenasa tipo I</td><td>Life Technologies</td><td>17100-017</td><td>Para aislamiento de HKC</td></tr><tr><td>Desoxirribonucleasa I</td><td>Sigma</td><td>9003-98-9</td><td>Para aislamiento de HKC</td></tr><tr><td>F12 Mezcla de nutrientes, Hams</td><td>Life Technologies</td><td>31765035</td><td>componente del medio G</td></tr><tr><td>B27 Suplemento</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>Factor de crecimiento en el medio</td></tr><tr><td>G FGF-2 Millipore Merck</td><td>Biosciences</td><td>341595</td><td>Factor de crecimiento en medio G</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td>Inhibidor de rocas</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Gibco</td><td>15290026</td><td>Preparación para</td></tr> el <tr><td>EGF en medio G Proteína humana recombinante</td><td>Gibco</td><td>PHG0311</td><td>factor de crecimiento en medio G</td></tr><tr><td>Kit de recuento de células-8</td><td>Ensayos de proliferación celular y citotoxicidad</td><td>NC9864731</td><td>Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Citoqueratina antihumana de ratón5</td><td>Hewlett-Packard Development Company</td><td>MA-20142</td><td>Para la tinción de inmunofluorescencia para verificar el marcador de diferenciación de HKC</td></tr><tr><td>Conejo anti-humano Loricrin</td><td>Covance</td><td>PRB-145p</td><td>Para la tinción de inmunofluorescencia para verificar el marcador de diferenciación de HKC Tecnología de</td></tr><tr><td>señalización celular</td><td>Vimentin anti-humano para ratones</td><td>3390</td><td>Para la tinción de inmunofluorescencia de fibroblastos dérmicos</td></tr><tr><td>Integrina y alfa; 6(GOH3)</td><td>Santa Cruz&nbsp;</td><td>SC-19622</td><td>análisis de citometría de flujo de HKCs</td></tr><tr><td>Rat IgG2a FITC Santa</td><td>Cruz &nbsp;</td><td>SC-2831</td><td>anticuerpo de control negativo de &alfa; 6-integrina&nbsp; en análisis de citometría de flujo&nbsp;</td></tr></tbody></table>

un método simplificado y eficiente para aislar keratinocytes humanos primarios de tejido adulto de la piel

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Keratinocytes humanos primarios aislados de los tejidos de la piel fresca y su expansión en vitro han sido ampliamente utilizados para la investigación de laboratorio y para usos clínicos. El método de aislamiento convencionales de keratinocytes humanos implica un procedimiento de digestión enzimática secuencial de dos etapas, que ha demostrado ser ineficiente en la generación de primario de células de tejidos adultos debido a la tasa de recuperación celular baja y reducida de la célula viabilidad. Recientemente nos informó un método avanzado para aislar las células progenitoras epidérmico primario humano de tejidos de la piel que utiliza el inhibidor de la cinasa Rho Y-27632 en el medio. En comparación con el protocolo tradicional, este nuevo método es más simple, más fácil y menos desperdiciadora de tiempo y aumenta la producción de células madre epiteliales y realza sus características de la célula de vástago. Además, la nueva metodología no requiere la separación de la epidermis de la dermis y por lo tanto, es conveniente para aislar células de diferentes tipos de tejidos adultos. Este nuevo método de aislamiento supera las principales deficiencias de los métodos convencionales y es más conveniente para producir gran número de células epidérmicas con alta potencia para laboratorio y aplicaciones clínicas. Aquí, describimos el nuevo método en detalle.

Diagramas esquemáticos del nuevo método (figura 1A) y el método convencional (figura 1B) se presentan en la figura 1. El método convencional es una digestión de dos etapas, que requiere un procedimiento de 2 días. Por el contrario, el nuevo método es una digestión de un solo paso, que toma alrededor de 3 horas para llevar a cabo. Lo importante, el nuevo método de un solo paso puede obtener dos poblac...

Aquí presentamos un protocolo para aislar eficientemente keratinocytes humanos primarios de tejidos de la piel adulta. Este método simplifica el procedimiento convencional mediante el uso de la Y-27632 del inhibidor de la roca en el medio de inoculación separar espontáneamente las células epidérmicas de las células cutáneas.

Un método simplificado y eficiente para aislar Keratinocytes humanos primarios de tejido adulto de la piel

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

El objetivo general de este video es presentar un nuevo método simple para aislar y cultivar células epidérmicas humanas primarias a partir de un tejido cutáneo adulto. Este método avanzado es más adecuado para producir un gran número de células epidérmicas de alto potencial tanto para aplicaciones de laboratorio como clínicas. Lave el pañuelo con PBS antes de pesar.Pesar el tejido de la piel con una báscula electrónica. Enjuague el tejido cutáneo con etanol al 70% durante 30 segundos. Incubar el tejido en PBS con antibióticos dos veces durante cinco minutos cada vez.Transfiera el tejido a otra placa estéril y homogeneice a fondo con hojas de bisturí. Agregue 200 microlitros de PBS cada cinco minutos para mantener el pañuelo húmedo. Transfiera el tejido homogeneizado a un tubo de 50 mililitros.Agregue 10 mililitros de mezcla de enzimas por cada gramo de tejido cutáneo. Mezclar bien las enzimas con los tejidos homogeneizados. Incubar la mezcla en un baño de agua a 37 grados centígrados con agitación.Después de eso, agregue 1/5 del volumen de 0.25% de tripsina. Continúe la incubación durante 30 minutos en un baño de agua a 37 grados centígrados. Agregue la solución de Dnase I a la mezcla en una proporción de uno a 100.Luego incube durante otros cinco minutos. Detenga el proceso de digestión agregando el mismo volumen de medio de neutralización. Pipetea la solución hacia arriba y hacia abajo unas 20 veces.Filtre las células disociadas a través de un filtro de células de 100 micrómetros para eliminar los restos de tejido. Centrifugar a 200 g durante cinco minutos. Observe el pellet en el fondo del tubo.Retire los sobrenadantes y lave el pellet celular con 10 mililitros de medio neutralizante. A continuación, centrifugar a 200 g durante cinco minutos. Vuelva a suspender el pellet celular en el medio de inoculación con un inhibidor de ROCK de 10 micromolares.Placa dos veces 10 a la sexta celdas en una placa de cultivo de 100 milímetros. Después de tres días, reemplace el medio de inoculación por un medio de queratinocitos sin suero. Cambie el medio cada dos días.Cuando las células hayan alcanzado aproximadamente el 80% de la densidad, pase las células. Lave las células con PBS. Si es necesario, tripsinar durante dos minutos y lavar las células con PBS para eliminar las células dérmicas contaminadas.Agregue el mismo volumen de medio de neutralización. Centrifugar a 200 g durante cinco minutos. Finalmente, retire los sobrenadantes y vuelva a suspender el pellet de celda.Los queratinocitos aislados de tejidos de piel humana se incubaron por separado mediante dos métodos. El método convencional es una digestión de dos pasos que implica un procedimiento de dos días. Por el contrario, el nuevo método es una digestión de un solo paso que tarda unas tres horas en realizarse.En el tercer día, podemos encontrar fácilmente muchos grupos de células cultivadas por el nuevo método, mientras que este fenómeno no ocurre cuando se usa el método convencional. Al quinto día, se observó que el nuevo método producía una mayor cantidad de células primarias. Para probar el estado de diferenciación de los queratinocitos cultivados, analizamos el marcador de células basales K5 y el marcador de diferenciación terminal Loricrina.Encontramos que el 90% del total de células eran K5 positivas, pero menos del 10% de las células expresaban loricrina en el pasaje tres, lo que indica que son queratinocitos indiferenciados. Verificamos la expresión de vimentina, que se expresa en el fibroblasto dérmico, para examinar la contaminación de las células dérmicas durante el aislamiento. Encontramos que alrededor del 3% de las células dérmicas aparecieron en el pasaje inicial, pero solo alrededor del 0,02% de las células dérmicas se detectaron en el pasaje tres, lo que indica una alta pureza de las células epidérmicas después del paso.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Una forma rápida y robusta de aislar células viables de adultos epiteliales madre de la piel humana se describe. El método utiliza la digestión enzimática de la matriz de colágeno la piel, seguido por el punteo de los folículos pilosos y el aislamiento de las suspensiones de células individuales o fragmentos de tejido para el cultivo celular.

Aislamiento y cultivo de células madre adultas epiteliales de la piel humana

Este video describe el aislamiento de queratinocitos, las células más prominentes de la capa epidérmica de la piel humana, mediante el empleo de una combinación de métodos de digestión enzimática y disrupción mecánica. Este método ayuda en el crecimiento preferencial de los queratinocitos sobre otros tipos de células de la piel utilizando un medio de crecimiento selectivo.

Aislamiento de queratinocitos de piel humana: un método para cultivar queratinocitos primarios a partir de muestras de piel

Se presenta un método para aislar precursoras derivadas de la piel (SKP) células multipotentes ingenuos de cultivos de fibroblastos humanos primarios. Se demuestra que estos SKPs derivados de cultivos de fibroblastos comparten propiedades de células madre similares a los obtenidos directamente a partir de biopsias de piel humana. Estas células expresan el marcador de la cresta neural, nestina, además de los marcadores multipotentes, tales como Oct4 y Nanog.

Naïve Adult Stem Cells Aislamiento de Primaria cultivos de fibroblastos humanos

Este manuscrito proporciona un procedimiento paso a paso para la derivación y el mantenimiento de queratinocitos humanos a partir de pelo arrancado y la posterior generación de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) libres de integración por vectores episomales.

Generación de células madre Integración de libre Humanos pluripotentes inducidas Usando derivada de pelo queratinocitos

Los queratinocitos epidérmicos forman una barrera cutánea funcional y se sitúan en la línea de frente de la defensa del huésped contra insultos ambientales externos. Aquí se describen métodos de aislamiento y cultivo primario de queratinocitos epidérmicos de piel de ratón neonatal y adulto, e inducción de diferenciación terminal y respuesta inflamatoria desencadenada por UVB a partir de queratinocitos.

Aislamiento y cultivo de queratinocitos de ratón primario de piel de ratón neonatal y adulto

La piel humana actúa como primera línea de defensa contra el medio ambiente externo. Presentamos un método para aislar queratinocitos humano primario de piel adulto. Estos queratinocitos aislados son útiles en numerosas configuraciones experimentales y son un modelo muy adecuado para el estudio de mecanismos moleculares en biología cutánea en vitro.

Generación y cultivo de Keratinocytes humanos primarios de piel adulto

El objetivo de este protocolo es aislar los queratinocitos epidérmicos de la piel dorsal de ratones adultos para una variedad de aplicaciones aguas abajo, como biología molecular, bioquímica, clasificación celular activada por fluorescencia y usos primarios in vitro (por ejemplo, clonogénicos queratinocitos).

Aislamiento de los queratinocitos epidérmicos de ratón y su cultivo clonogénico In Vitro

Aquí describimos un protocolo para el cultivo sistemático de esferoides epidérmicos en cultivo de suspensión 3D. Este protocolo tiene una amplia gama de aplicaciones para su uso en una variedad de tipos de tejidos epiteliales y para el modelado de varias enfermedades y afecciones humanas.

Establecimiento de un sistema de cultivo de esferoides epidérmicos de alto rendimiento para modelar la plasticidad de las células madre de queratinocitos

El presente protocolo describe el aislamiento y cultivo de queratinocitos orales derivados del paladar del ratón adulto. También se informa de un método de evaluación mediante inmunotinción.

Aislamiento y cultivo de queratinocitos orales primarios del paladar del ratón adulto

El estudio de la cicatrización de heridas asociada con la lesión musculoesquelética a menudo requiere la evaluación de las interacciones in vitro entre las células de Schwann (SC), los queratinocitos y los fibroblastos. Este protocolo describe el aislamiento, cultivo y caracterización de estas células primarias del prepucio humano.

Aislamiento, cultivo y caracterización de células primarias de Schwann, queratinocitos y fibroblastos del prepucio humano

Este protocolo describe el cultivo de queratinocitos recién obtenidos (pasaje 0) para su uso en la obtención de imágenes de células vivas.

Generación de cultivos primarios para la obtención de imágenes de células vivas de queratinocitos

Aprenda a aislar queratinocitos humanos primarios de piel adulta mediante un protocolo simplificado con inhibidor ROCK. Este método eficiente mejora el rendimiento celular para aplicaciones en biología celular y medicina regenerativa.

Un método simplificado y eficiente para aislar Keratinocytes humanos primarios de tejido adulto de la piel

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