Un método simplificado y eficiente para aislar Keratinocytes humanos primarios de tejido adulto de la piel
25 de agosto de 2018
Aquí presentamos un protocolo para aislar eficientemente keratinocytes humanos primarios de tejidos de la piel adulta. Este método simplifica el procedimiento convencional mediante el uso de la Y-27632 del inhibidor de la roca en el medio de inoculación separar espontáneamente las células epidérmicas de las células cutáneas.
El objetivo general de este video es presentar un nuevo método simple para aislar y cultivar células epidérmicas humanas primarias a partir de un tejido cutáneo adulto. Este método avanzado es más adecuado para producir un gran número de células epidérmicas de alto potencial tanto para aplicaciones de laboratorio como clínicas. Lave el pañuelo con PBS antes de pesar.
Pesar el tejido de la piel con una báscula electrónica. Enjuague el tejido cutáneo con etanol al 70% durante 30 segundos. Incubar el tejido en PBS con antibióticos dos veces durante cinco minutos cada vez.
Transfiera el tejido a otra placa estéril y homogeneice a fondo con hojas de bisturí. Agregue 200 microlitros de PBS cada cinco minutos para mantener el pañuelo húmedo. Transfiera el tejido homogeneizado a un tubo de 50 mililitros.
Agregue 10 mililitros de mezcla de enzimas por cada gramo de tejido cutáneo. Mezclar bien las enzimas con los tejidos homogeneizados. Incubar la mezcla en un baño de agua a 37 grados centígrados con agitación.
Después de eso, agregue 1/5 del volumen de 0.25% de tripsina. Continúe la incubación durante 30 minutos en un baño de agua a 37 grados centígrados. Agregue la solución de Dnase I a la mezcla en una proporción de uno a 100.
Luego incube durante otros cinco minutos. Detenga el proceso de digestión agregando el mismo volumen de medio de neutralización. Pipetea la solución hacia arriba y hacia abajo unas 20 veces.
Filtre las células disociadas a través de un filtro de células de 100 micrómetros para eliminar los restos de tejido. Centrifugar a 200 g durante cinco minutos. Observe el pellet en el fondo del tubo.
Retire los sobrenadantes y lave el pellet celular con 10 mililitros de medio neutralizante. A continuación, centrifugar a 200 g durante cinco minutos. Vuelva a suspender el pellet celular en el medio de inoculación con un inhibidor de ROCK de 10 micromolares.
Placa dos veces 10 a la sexta celdas en una placa de cultivo de 100 milímetros. Después de tres días, reemplace el medio de inoculación por un medio de queratinocitos sin suero. Cambie el medio cada dos días.
Cuando las células hayan alcanzado aproximadamente el 80% de la densidad, pase las células. Lave las células con PBS. Si es necesario, tripsinar durante dos minutos y lavar las células con PBS para eliminar las células dérmicas contaminadas.
Agregue el mismo volumen de medio de neutralización. Centrifugar a 200 g durante cinco minutos. Finalmente, retire los sobrenadantes y vuelva a suspender el pellet de celda.
Los queratinocitos aislados de tejidos de piel humana se incubaron por separado mediante dos métodos. El método convencional es una digestión de dos pasos que implica un procedimiento de dos días. Por el contrario, el nuevo método es una digestión de un solo paso que tarda unas tres horas en realizarse.
En el tercer día, podemos encontrar fácilmente muchos grupos de células cultivadas por el nuevo método, mientras que este fenómeno no ocurre cuando se usa el método convencional. Al quinto día, se observó que el nuevo método producía una mayor cantidad de células primarias. Para probar el estado de diferenciación de los queratinocitos cultivados, analizamos el marcador de células basales K5 y el marcador de diferenciación terminal Loricrina.
Encontramos que el 90% del total de células eran K5 positivas, pero menos del 10% de las células expresaban loricrina en el pasaje tres, lo que indica que son queratinocitos indiferenciados. Verificamos la expresión de vimentina, que se expresa en el fibroblasto dérmico, para examinar la contaminación de las células dérmicas durante el aislamiento. Encontramos que alrededor del 3% de las células dérmicas aparecieron en el pasaje inicial, pero solo alrededor del 0,02% de las células dérmicas se detectaron en el pasaje tres, lo que indica una alta pureza de las células epidérmicas después del paso.
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Visión general
Este artículo presenta un protocolo simplificado para aislar queratinocitos humanos primarios de tejidos de piel adulta. El método utiliza el Inhibidor ROCK Y-27632 para facilitar la separación de células epidérmicas de las células dérmicas.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Biología celular
- Dermatología
- Medicina regenerativa
Antecedentes
- Los queratinocitos humanos primarios son esenciales para varias aplicaciones de investigación.
- Los métodos de aislamiento convencionales pueden ser complejos y consumir mucho tiempo.
- El uso del Inhibidor ROCK Y-27632 ofrece un enfoque más eficiente.
- Los queratinocitos aislados pueden utilizarse tanto en entornos de laboratorio como clínicos.
Propósito del estudio
- Desarrollar un método más eficiente para aislar células epidérmicas.
- Mejorar el rendimiento de células epidérmicas de alto potencial.
- Facilitar la investigación y las aplicaciones clínicas que involucran células de la piel.
Métodos utilizados
- Lavar el tejido de la piel con PBS antes de pesarlo.
- Pesar el tejido de la piel usando una báscula electrónica.
- Enjuagar el tejido con etanol al 70% durante 30 segundos.
- Incubar el tejido en PBS con antibióticos dos veces durante cinco minutos cada vez.
Resultados principales
- El protocolo aísla exitosamente queratinocitos primarios.
- Se obtuvieron altos rendimientos de células epidérmicas viables.
- El método es reproducible y eficiente.
- Las células aisladas pueden utilizarse para varias aplicaciones.
Conclusiones
- Este método simplifica el aislamiento de queratinocitos primarios.
- Proporciona un enfoque confiable para los investigadores en el campo.
- El uso del Inhibidor ROCK mejora el rendimiento y la viabilidad celular.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Isolating high-purity primary human keratinocytes from adult skin remains a bottleneck in dermatology and regenerative medicine R&D due to low yield and contamination risks. This simplified one-step enzymatic method with ROCK inhibitor Y-27632 improves epidermal cell recovery and stemness, enabling scalable production for target validation and preclinical modeling. The approach reduces procedural complexity and time, supporting reproducible assay development and translational continuity from discovery to lead optimization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of epidermal signaling pathways and target engagement in a physiologically relevant human cell system.
- Operational Value: Provides a renewable source of primary keratinocytes with high K5+/Loricrin- purity for consistent target de-risking.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by maintaining stem cell characteristics and low fibroblast contamination (<0.02% at P3) for reliable phenotype screening.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates large numbers of viable epidermal cells suitable for high-throughput compound screening and cytotoxicity testing.
- Standardization: The one-step digestion protocol (~3 hours) improves reproducibility across batches and laboratories.
- Scalability: Eliminates epidermis-dermis separation, allowing application to diverse adult tissues and increasing throughput for lead identification campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Produces keratinocytes with stem cell properties that model human epidermal homeostasis and barrier function.
- Translational Continuity: Maintains phenotypic stability through passaging, supporting preclinical efficacy and safety testing.
- Risk-Adjusted Advancement: High purity and yield reduce biological variability, improving confidence in go/no-go decisions for topical or regenerative candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum by supplying validated primary human keratinocytes for early target validation, enabling assay development for screening campaigns, and supporting preclinical evaluation of dermatological therapeutics.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on epidermal targets using a purified, stem-cell-enriched human cell system.
- Screening: Delivers standardized, quantitative cell preparations for dose-response and biomarker readouts in compound evaluation.
- Analytics: Enables measurement of differentiation markers (K5, Loricrin) and contamination levels (vimentin) to assess cellular phenotype and purity.
- Translational Research: Supports continuity from isolated primary cells to preclinical models by preserving epidermal stemness and functionality.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation platform applicable across multiple projects requiring human epidermal cells.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through high-purity, stem-cell-enriched keratinocyte production.
- Operational Value: Reduces isolation time from two days to ~3 hours, improving laboratory throughput and resource efficiency.
- Strategic Value: Enhances predictive confidence in early-stage programs by minimizing biological noise from dermal contamination.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on reliable epidermal cell-based assays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell culture and enzymatic tissue dissociation techniques.
- Necessitates access to ROCK inhibitor Y-27632, enzyme mixtures (e.g., dispase, trypsin), and DNase I for digestion.
- Demands standardized centrifugation, filtration, and sterile technique to maintain cell viability and purity.
- Requires adaptation of inoculation and keratinocyte media formulations for optimal expansion and passaging.
- Practical limitations include donor variability in skin tissue quality and the need for aseptic handling to prevent microbial contamination.
