Un método simplificado y eficiente para aislar Keratinocytes humanos primarios de tejido adulto de la piel

El objetivo general de este video es presentar un nuevo método simple para aislar y cultivar células epidérmicas humanas primarias a partir de un tejido cutáneo adulto. Este método avanzado es más adecuado para producir un gran número de células epidérmicas de alto potencial tanto para aplicaciones de laboratorio como clínicas. Lave el pañuelo con PBS antes de pesar.

Pesar el tejido de la piel con una báscula electrónica. Enjuague el tejido cutáneo con etanol al 70% durante 30 segundos. Incubar el tejido en PBS con antibióticos dos veces durante cinco minutos cada vez.

Transfiera el tejido a otra placa estéril y homogeneice a fondo con hojas de bisturí. Agregue 200 microlitros de PBS cada cinco minutos para mantener el pañuelo húmedo. Transfiera el tejido homogeneizado a un tubo de 50 mililitros.

Agregue 10 mililitros de mezcla de enzimas por cada gramo de tejido cutáneo. Mezclar bien las enzimas con los tejidos homogeneizados. Incubar la mezcla en un baño de agua a 37 grados centígrados con agitación.

Después de eso, agregue 1/5 del volumen de 0.25% de tripsina. Continúe la incubación durante 30 minutos en un baño de agua a 37 grados centígrados. Agregue la solución de Dnase I a la mezcla en una proporción de uno a 100.

Luego incube durante otros cinco minutos. Detenga el proceso de digestión agregando el mismo volumen de medio de neutralización. Pipetea la solución hacia arriba y hacia abajo unas 20 veces.

Filtre las células disociadas a través de un filtro de células de 100 micrómetros para eliminar los restos de tejido. Centrifugar a 200 g durante cinco minutos. Observe el pellet en el fondo del tubo.

Retire los sobrenadantes y lave el pellet celular con 10 mililitros de medio neutralizante. A continuación, centrifugar a 200 g durante cinco minutos. Vuelva a suspender el pellet celular en el medio de inoculación con un inhibidor de ROCK de 10 micromolares.

Placa dos veces 10 a la sexta celdas en una placa de cultivo de 100 milímetros. Después de tres días, reemplace el medio de inoculación por un medio de queratinocitos sin suero. Cambie el medio cada dos días.

Cuando las células hayan alcanzado aproximadamente el 80% de la densidad, pase las células. Lave las células con PBS. Si es necesario, tripsinar durante dos minutos y lavar las células con PBS para eliminar las células dérmicas contaminadas.

Agregue el mismo volumen de medio de neutralización. Centrifugar a 200 g durante cinco minutos. Finalmente, retire los sobrenadantes y vuelva a suspender el pellet de celda.

Los queratinocitos aislados de tejidos de piel humana se incubaron por separado mediante dos métodos. El método convencional es una digestión de dos pasos que implica un procedimiento de dos días. Por el contrario, el nuevo método es una digestión de un solo paso que tarda unas tres horas en realizarse.

En el tercer día, podemos encontrar fácilmente muchos grupos de células cultivadas por el nuevo método, mientras que este fenómeno no ocurre cuando se usa el método convencional. Al quinto día, se observó que el nuevo método producía una mayor cantidad de células primarias. Para probar el estado de diferenciación de los queratinocitos cultivados, analizamos el marcador de células basales K5 y el marcador de diferenciación terminal Loricrina.

Encontramos que el 90% del total de células eran K5 positivas, pero menos del 10% de las células expresaban loricrina en el pasaje tres, lo que indica que son queratinocitos indiferenciados. Verificamos la expresión de vimentina, que se expresa en el fibroblasto dérmico, para examinar la contaminación de las células dérmicas durante el aislamiento. Encontramos que alrededor del 3% de las células dérmicas aparecieron en el pasaje inicial, pero solo alrededor del 0,02% de las células dérmicas se detectaron en el pasaje tres, lo que indica una alta pureza de las células epidérmicas después del paso.