Un análisis óptico para el reciclaje de la vesícula sináptica en neuronas cultivadas Overexpressing proteínas presinápticas
June 26th, 2018
Describimos un análisis óptico para la vesícula sináptica (SV) reciclado en neuronas cultivadas. Combinar este protocolo con doble transfección para expresar un marcador presináptico y la proteína de interés nos permite localizar sitios presinápticos, su vesícula sináptica capacidad de reciclaje y determinar el papel de la proteína de interés.
La principal ventaja de esta técnica es que es muy sencilla, requiere solo un equipo estándar y se beneficia de la principal ventaja de los anticuerpos, que es su especificidad. El protocolo fue introducido originalmente por Michela Matteoli y sus colegas, y ha demostrado ser muy eficaz. Lo he usado para probar si una determinada proteína cordocti está localizada en sinapsis activas.
Comience este procedimiento cultivando células primarias del hipocampo en cubreobjetos en una placa de 24 pocillos durante tres días, como se describe en el protocolo de texto. Precaliente el medio de suero reducido, el medio de cultivo celular y el agua destilada a 37 grados centígrados en el baño de agua. Trabajando bajo la campana de flujo laminar para garantizar condiciones de trabajo estériles, prepare la mezcla de transfección en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
En primer lugar, mezcle 7,5 microlitros de cloruro de calcio de dos molares con cuatro microgramos de cada ADN libre de endotoxinas. Agregue agua para alcanzar un volumen total de 60 microlitros en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Ahora, agregue 60 microlitros de tampón de transfección a la mezcla.
Para obtener los mejores resultados, agregue el tampón de transfección gota a gota mientras agita suavemente la mezcla de ADN en el vórtice. Incubar la mezcla de transfección resultante a temperatura ambiente durante 20 minutos. Evite agitar el tubo durante el tiempo de incubación.
Bajo la campana de flujo laminar, retire el medio de cultivo celular de los pocillos con una pipeta de 1.000 microlitros, guárdelo en un recipiente separado y agregue inmediatamente 500 microlitros de medio de suero reducido a cada pocillo. Guarde el medio acondicionado en la incubadora. Incubar las células a 37 grados centígrados y 5% de CO2 hasta que finalice el período de incubación de 20 minutos para la mezcla de transfección.
A continuación, añada 30 microlitros de mezcla de transfección a cada pocillo pipeteando varias gotas. Deseche el residuo en el fondo del tubo. Después de que todos los pocillos hayan sido suministrados con la mezcla de transfección, agite suavemente la placa de 24 pocillos para asegurar la distribución de la mezcla de transfección en el medio.
Ahora incube los pocillos durante 60 minutos a 37 grados centígrados y 5% de CO2. Después de la incubación, retire y deseche la mezcla de transfección y lave las células tres veces con medio de cultivo celular. El paso de lavado es crítico.
Minimice el tiempo que cada pozo no tiene medio retirando y reemplazando pozo por pozo. Además, asegúrese de agregar el medio suavemente. Para lavar las células, agregue un mililitro de medio de cultivo celular a cada pocillo e incube durante 30 segundos a temperatura ambiente.
Luego, retire 750 microlitros de medio y agregue la misma cantidad de medio fresco. Después de repetir este proceso tres veces, retire y deseche el medio de cultivo celular y agregue 450 microlitros del medio acondicionado pocillo por pocillo. Ahora deje que las neuronas maduren en la incubadora a 37 grados centígrados y 5%CO2 a DIV 10.
Precaliente 600 microlitros de tampón de despolarización 1X y 10 mililitros de medio de cultivo celular a 37 grados centígrados en el baño de agua. Agregue un microlitro de anticuerpo Anti-Syt1 de ratón al tampón de despolarización 1X y vórtice durante 10 segundos. Después de eliminar y desechar el medio de cultivo celular de las células, agregue 200 microlitros de la mezcla de anticuerpos de despolarización a cada pocillo.
Incubar la placa durante cinco minutos a 37 grados centígrados y 5%CO2 en la incubadora. Retire y deseche la mezcla de anticuerpos de despolarización y lave las células tres veces con medio de cultivo celular. Agregue un mililitro de medio de cultivo celular a cada pocillo e incube durante 30 segundos a temperatura ambiente.
Luego, retire 750 microlitros de medio y agregue la misma cantidad de medio fresco. Repite este proceso tres veces. A continuación, retire y deseche el medio de cultivo celular y agregue 300 microlitros de PFA al 4% en 1X PBS.
Finalmente, incube durante 20 minutos a cuatro grados centígrados antes de lavar tres veces durante cinco minutos cada una con 1X PBS. Diluir el anticuerpo secundario acoplado a fluoróforos en 200 microlitros de tampón de bloqueo para cada pocillo en una dilución de uno a 1.000. Retire y deseche el PBS 1X de cada pocillo que contenga cubreobjetos con las neuronas cultivadas.
Agregue 200 microlitros de mezcla de anticuerpos tampón bloqueante a cada pocillo e incube durante 60 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, lave las células tres veces durante cinco minutos con un mililitro de 1X PBS. A continuación, añada una gota de siete microlitros de medio de inclusión en el portaobjetos del microscopio.
Retire el cubreobjetos de la placa de 24 pocillos levantándola con una cánula y agarrándola con pinzas. Sumerja el cubreobjetos en agua destilada para eliminar el PBS y séquelo cuidadosamente tocando un pañuelo blando con un borde. Voltee el cubreobjetos sobre la gota del medio de inclusión de modo que la superficie que transporta las células quede frente al portaobjetos del microscopio, incrustando así las células en el medio de inclusión.
Deje que los portaobjetos se sequen bajo el capó durante una o dos horas, cubriéndolos para evitar la exposición a la luz. Guarde los portaobjetos secos en una caja de portaobjetos de microscopio a cuatro grados centígrados. Después de inmunomarcar el anticuerpo Syt1 con un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia, el grado de absorción de Syt1 se cuantifica finalmente mediante la inmunoseñal.
La inmunofluorescencia punteada indica los sitios de absorción de Syt1 en el campo de visión. Por lo tanto, estos sitios contienen vesículas sinápticas que se reciclaron durante el experimento. La fluorescencia de Synaptophysin-mOrange indica acumulaciones de vesículas sinápticas en el axón de una neurona transfectada.
La fluorescencia de GFP-Rogdi indica acumulaciones de Rogdi en el axón de la neurona transfectada. Esta parte del experimento revela una amplia colocalización de GFP-Rogdi y sinaptofisina-mOrange, lo que sugiere que GFP-Rogdi se acumula en sitios presinápticos dentro del axón. La superposición revela cuáles de las coacumulaciones de GFP-Rogdi y Synaptophysin-mOrange se colocalizan con los sitios de absorción del anticuerpo Syt1.
Los sitios marcados con flechas representan acumulaciones de Rogdi recombinante y sinaptofisina recombinante en sinapsis funcionales. El protocolo describe una forma técnicamente sencilla de determinar el alcance del reciclaje de residuos sinápticos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la ciencia molecular y celular, como dónde se asignan las terminales nerviosas presinápticas en un axón de una determinada neurona y si una proteína recombinante o endógena de interés se acumula en estas terminales.
Después de su desarrollo, esta técnica se ha utilizado de muchas maneras para monitorear el reciclaje de vesículas sinápticas en terminales presinápticas. Por ejemplo, se puede utilizar para determinar el reciclaje de vesículas sinápticas en neuronas después de la sobreexpresión en proteínas adaptativas, así como en neuronas obtenidas de animales o de neuronas derivadas de células madre.
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Visión general
Este estudio presenta un ensayo óptico simple para analizar el reciclaje de vesículas sinápticas (SV) en neuronas cultivadas, utilizando una combinación de transfección para expresar un marcador presináptico y una proteína de interés. A través de este método, los investigadores pueden identificar ubicaciones presinápticas y evaluar la capacidad de reciclaje de las vesículas sinápticas influenciadas por proteínas específicas.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Fisiopatología sináptica
Antecedentes
- El reciclaje de las vesículas sinápticas es crucial para la neurotransmisión.
- Entender los mecanismos puede revelar conocimientos sobre la comunicación neuronal.
- Estudios previos han utilizado la especificidad de los anticuerpos para rastrear componentes sinápticos.
- Este protocolo se basa en métodos establecidos para estudiar la dinámica sináptica.
Propósito del estudio
- Desarrollar una técnica confiable para evaluar el reciclaje de las vesículas sinápticas.
- Investigar la localización y función de las proteínas en sitios presinápticos.
- Mejorar la comprensión de la resiliencia y plasticidad sináptica.
Métodos utilizados
- El estudio empleó un modelo de cultivo celular usando células hipocampales primarias.
- Las neuronas se cultivaron sobre cubreobjetos y se sometieron a técnicas de inmunomarcado.
- No se mencionaron flujos de trabajo multiómicos en el texto.
- Los pasos clave incluyen la preparación de mezclas de transfección, la incubación de neuronas y la realización de inmunofluorescencia.
- El método evalúa cuantitativamente el reciclaje de las vesículas sinápticas mediante la visualización de la captación del anticuerpo Syt1.
Resultados principales
- Los resultados muestran la colocalización de GFP-Rogdi y Synaptophysin-mOrange en sitios presinápticos, indicando componentes sinápticos funcionales.
- La inmunofluorescencia punteada correlacionada con sitios de sinapsis activas respalda la efectividad del método.
- Los hallazgos demuestran un enfoque sencillo para evaluar el recambio de las vesículas sinápticas.
- La metodología revela conocimientos críticos sobre la interacción de proteínas específicas dentro de la maquinaria sináptica.
Conclusiones
- Este estudio establece un protocolo claro para estudiar la dinámica de las vesículas sinápticas utilizando imágenes ópticas simples.
- Entender el mecanismo de reciclaje contribuye al campo más amplio de la fisiología sináptica y posibles vías terapéuticas.
- Los hallazgos pueden tener implicaciones para comprender la función sináptica y los trastornos que afectan la neurotransmisión.
