Name: Un análisis óptico para el reciclaje de la vesícula sináptica en neuronas cultivadas Overexpressing proteínas presinápticas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Aprende un ensayo óptico para analizar el reciclaje de vesículas sinápticas en neuronas de hipocampo cultivadas usando transfección y marcadores presinápticos. Este método permite evaluar la localización de proteínas en terminales activos.

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Agradecemos a Irmgard Weiss experta asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por DFG el Cluster de excelencia para la microscopia en la gama del nanómetro y fisiología molecular del cerebro (CNMPB, B1-7, a T.D.).

No se llevaron a cabo ningún estudio con animales vivos. T10/30 el número de experimentos con animales sacrificaron para obtener culturas fueron aprobadas por las autoridades locales de protección animal (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) bajo la aprobación de la célula. Los experimentos se realizaron con los protocolos aprobados.
1. primario de la célula hipocampal cultura
<ol><li>Preparar el cultivo de células disociadas del hipocampo de rata en el día embrionario 1916,17. Las células sobre cubreobjetos de 12 mm recubierto con polietilamina (PEI) en platos de 24 pozos a una densidad de 50.000-60.000 células/pocillo de la placa. Comprobar la densidad usando una celda óptica de contraste de fase y cámara de conteo.</li>
	<li>Las neuronas de la cultura durante 3 días (día en vitro (DIV) 3) en un plato 24-well en la incubadora a 37 ° C con 5% CO2.</li>
	<li>Evaluar el cubreobjetos para indicadores de salud de la célula mediante microscopía de luz transmitida (por ejemplo, fase contraste la óptica en un aumento de 10-20 X). Busque los siguientes indicadores de buena salud: un halo de contraste de fase clara, neuritas sin estructuras de cuentas y no soma clustering o neurita liar.</li>
</ol>2. transfección
Nota: El siguiente protocolo se refiere a una doble transfección para pozos de 3. Sin embargo, el protocolo funciona mejor cuando se preparan cantidades suficientes para pozos de 4.
<ol><li>Preparar 500 mL de tampón de transfección (274 mM NaCl, 10 mM de KCl, 1,4 Na2HPO4, glucosa de 15 mM, 42 mM HEPES) en un matraz Erlenmeyer.<ol>
<li>Disolver 8,0 g de NaCl, 0,37 g de KCl, 0,095 g de Na2HPO4, 1,35 g de glucosa y 5,0 g de HEPES en 400 mL de agua destilada en un matraz Erlenmeyer.</li>
		<li>Ajustar el pH a 6.95 con 1 NaOH M usando un medidor de pH.</li>
		<li>Ajuste el volumen con agua destilada a 500 mL y verificar el pH con un medidor de pH.</li>
		<li>Tomar alícuotas de 20-30 mL de tampón de la transfección con los siguientes valores de pH por pipeteo 1 M NaOH al buffer de transfección: 6,96 6.97 6.98, 6.99, 7.00, 7.01, 7.02, 7.03, 7.04, 7.05, 7.06, 7.07, 7.08, 7.09, 7.11. Nota: El pH del buffer de la transfección es crucial para la eficacia de transfección.</li>
		<li>Para probar que la transfección tampón conduce a la mayor cantidad de células transfected, prueba cada valor de pH de 6,96 a 7.11. Utilice el método de transfección descrito en 2.2 2.11 y un plásmido validado expresando GFP. Determinar el número de células transfected por cubreobjetos para cada valor de pH de buffer de transfección evaluar qué tampón funciona mejor.</li>
		<li>Alícuota del búfer con la más alta eficiencia de transfección en tubos de microcentrífuga de 2 mL congelar y almacenar los tubos a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Caliente previamente el suero reducido medio, medio de cultivo celular y agua destilada a 37 ° C en el baño de agua.</li>
	<li>Preparar la mezcla de transfección en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Trabajar bajo campana de flujo laminar para garantizar condiciones de trabajo estéril.<ol>
<li>Mezcla 7,5 μl de cloruro de calcio de 2 M con 4 μg de cada ADN libre de endotoxinas (Synaptophysin mOrange y mGFP/GFP-Rogdi). Añadir agua hasta alcanzar un volumen total de 60 mL en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
		<li>Añadir 60 mL de tampón de transfección a la mezcla. Para obtener los mejores resultados, añadir el tampón de transfección gota a gota agitando suavemente la mezcla de ADN en el vórtice.</li>
		<li>Incubar a temperatura ambiente (RT) por 20 minutos. Evitar la agitación del tubo de incubación durante el tiempo de incubación colocando el tubo al lado de la campana de flujo laminar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bajo la campana de flujo laminar, eliminar el medio de cultivo celular "(medio condicionado del) de los pozos utilizando una pipeta de 1000 mL y almacenar en un recipiente separado en la incubadora.</li>
	<li>Añadir 500 mL de medio de reducido suero a cada pozo. Incube las células a 37 ° C y 5% de CO2 hasta que termine el período de incubación de 20 minutos (paso 2.3.3).</li>
	<li>Añadir 30 mL de mezcla de transfección a cada pocillo mediante pipeteo varias gotas. Deseche los residuos en la parte inferior del tubo.</li>
	<li>Después de han sido suministrados todos los pozos con mezcla de transfección, agitar suavemente la placa de 24 pocillos para garantizar la distribución de la mezcla de la transfección en el medio.</li>
	<li>Incubar los pocillos durante 60 minutos a 37 ° C y 5% CO2.</li>
	<li>Retire y deseche la mezcla de transfección y lavar tres veces con medio de cultivo celular. Añadir 1 mL de medio de cultivo celular en cada pocillo e Incube por 30 segundos en RT. quitar 750 mL de medio y añadir la misma cantidad de medio fresco. Repita esta operación tres veces. Nota: El paso de lavado es fundamental. Mantener el tiempo que cada bien no tiene ningún medio como mínimo (es decir., quitar y reemplazar pozo por pozo) y añadir suavemente el medio de lavado.</li>
	<li>Retire y deseche el medio de cultivo celular y añadir 450 mL de acondicionado medio bien-por-pozo.</li>
	<li>Que las neuronas maduras en la incubadora a 37 ° C y 5% de CO2 a 10 DIV.</li>
</ol>3. estimulación y captación de Syt1
Nota: El siguiente protocolo aplica la absorción a 3 pozos. Por despolarización de cualquier otro número de pozos, ajuste las cantidades según corresponda.
<ol><li>Preparar 50 mL de tampón de despolarización 10 x (640 mM NaCl, 700 mM KCl, 10 mM de MgCl2, 20 mM CaCl2, glucosa de 300 mM, 200 mM HEPES, pH 7,4) en un matraz Erlenmeyer. Nota: El buffer de despolarización puede conservarse a 4 ° C durante varias semanas. Si una solución no despolarizantes también se utiliza, preparar un 10 solución de x Tyrode de 1290 mM NaCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM CaCl2, 300 mM de glucosa, pH de 200 mM HEPES 7.4 con el fin de comparar la estimulación inducida por reciclaje con espontánea reciclaje. Después de la dilución a 1 x, agregue 1 μm del Tetrodotoxin antes de usar para bloquear la generación del potencial de acción.<ol>
<li>1,87 g de NaCl, 2,61 g de KCl, 0.1 g de MgCl2-6 H20, 0.15 g de CaCl2-2 H2O y 3,0 g de glucosa 1 H2O y 2,38 g de HEPES en 50 mL de agua destilada en un matraz Erlenmeyer se disuelven. Ajustar el pH con NaOH y filtro estéril la solución. Diluir el buffer 1:10 en agua destilada hasta alcanzar una concentración de 1 x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar 4% paraformaldehido (PFA) de 1 x PBS (pH 7.4) para la fijación después de la estimulación.<ol>
<li>Para 500 mL 4% PFA en PBS 1 x, disolver 20 g de paraformaldehído en 450 mL de agua destilada H2O. Nota: La solución de la calefacción puede acelerar la disolución, pero no caliente la solución sobre 70 ° C, como las PDA pueden desintegrarse. PRECAUCIÓN: El PFA es tóxico, potencialmente carcinogénico y teratogénico. Use guantes cuando trabaje con PFA, trabajar bajo campana extractora y evitar la ingestión.</li>
		<li>Deje que la solución se enfríe a RT y añadir 50 mL de solución stock de 10 x PBS. Ajustar el pH a 7.4 con NaOH/HCl con un medidor de pH.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Caliente previamente 600 mL de 1 x de buffer de despolarización y 10 mL de medio de cultivo celular a 37 ° C en el baño de agua.</li>
	<li>Añadir 1 mL de anticuerpo de ratón anti-Syt1 (clon 604.2) a la 1 x buffer de despolarización y de vortex durante 10 segundos.</li>
	<li>Retire y deseche el medio de cultivo celular de las células. Añadir 200 mL de la mezcla de despolarización-anticuerpo cada pozo e incubar durante 5 minutos a 37 ° C y 5% de CO2 en la incubadora.</li>
	<li>Retire y deseche la mezcla de despolarización-anticuerpo y lavar tres veces con medio de cultivo celular. Añadir 1 mL de medio de cultivo celular en cada pocillo e incube durante 30 segundos en RT. quitar 750 mL de medio y añadir la misma cantidad de medio fresco. Repetir tres veces.</li>
	<li>Retire y deseche el medio de cultivo celular y agregar 300 mL de 4% PFA en PBS 1 x. Incubar 20 minutos a 4 ° C.</li>
	<li>Lavado tres veces 5 minutos cada uno con PBS 1 x. Nota: El protocolo se puede detener aquí.</li>
</ol>4. inmunocitoquímica
<ol><li>Preparar 50 mL de solución amortiguadora de bloqueo. Nota: Bloqueo de búfer puede conservarse a-20 ° C durante varios meses.<ol>
<li>Disolver 2,5 g de sacarosa y 1 g de albúmina de suero bovino (BSA) en 5 mL de solución stock de 10 x PBS. Añadir 1,5 mL de solución detergente 10%. Agitar la solución hasta que todos los componentes se disuelvan bien y añadir agua destilada H2O hasta un volumen final de 50 mL. Alícuota de la solución y la congelación de las alícuotas para el almacenamiento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diluir el anticuerpo secundario, fluoróforo acoplado (dirigido contra la especie de Syt1-anticuerpo primaria) en 200 mL de solución amortiguadora de bloqueo en cada pozo, a una dilución de 1: 1000.</li>
	<li>Retire y deseche el PBS 1 x de cada uno bueno con un cubreobjetos.</li>
	<li>Añadir 200 mL de mezcla de tampón-anticuerpo para cada pozo de bloqueo e incubar 60 minutos a TA. PRECAUCIÓN: Debido a los anticuerpos secundarios son sensibles a la luz, todos los pasos de avance deben realizarse en la oscuridad.</li>
	<li>Después de la incubación, lavar las células 3 veces durante 5 minutos con 1 mL de PBS 1 x.</li>
	<li>Incrustar el cubreobjetos sobre el portaobjetos con el medio de inclusión.<ol>
<li>Añada una gota de 7 mL de incrustación medio sobre el portaobjetos. Quite el cubreobjetos de la placa de 24 pocillos levantando con una jeringa y agarrar con pinzas. PRECAUCIÓN: Las células en la superficie del cubreobjetos se dañan fácilmente, para que fórceps deben manejarse con cuidado.</li>
		<li>El cubreobjetos de la inmersión en agua destilada para eliminar el PBS y secar cuidadosamente por tocar un borde a un tejido suave.</li>
		<li>Voltear el cubreobjetos sobre la gota media incrustación, por lo que la superficie que las células enfrenta el portaobjetos, incorporación de tal modo las células en el medio de inclusión.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deja los portaobjetos se seca bajo el capó para 1-2 h (cubierta para evitar la exposición a la luz) y guardarlos en una caja de portaobjetos de microscopio a 4 ° C. Nota: El protocolo se puede detener aquí.</li>
</ol>5. microscópico análisis
<ol><li>Después de secan el cubreobjetos, colocarlos bajo el microscopio con el objetivo y la cámara.</li>
	<li>Ajuste el tiempo de exposición para cada canal de modo que algunos píxeles sobreexpuestas para una máxima distribución de valores de gris. Nota: Mientras que el tiempo de exposición puede variar entre los canales, debe ser constante para un canal asegurar la comparabilidad entre el cubreobjetos.</li>
	<li>Adquisición de imágenes de varios canales para 10 regiones de interés (ROIs) por cubreobjetos. Compruebe que el ROI contiene procesos axonales de una neurona transfected comprobando que la fluorescencia de GFP, que debe ser punteada.</li>
</ol>6. estadístico análisis
<ol><li>Exportar las imágenes como archivos de .tif. Cargar las imágenes en OpenView18 haciendo clic en archivo | Cargar archivo de imagen.</li>
	<li>Elegir la imagen de Synaptophysin mOrange como canal 1, la imagen de Rogdi-GFP/mGFP como canal 2 y la imagen de fluorescencia Alexa647 como canal 3.</li>
	<li>Umbral de los ROIs.<ol>
<li>Haga clic en análisis | Área de lugar sobre el orificio. Elija valores umbral e intensidad del Delta que en la inspección visual, se excluye la fluorescencia difusa, dejando sólo punteada las señales en la imagen del canal 1 (representación Synaptophysin mOrange fluorescencia). Mantener el umbral mismo de todas las imágenes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transferir estos ROIs en el correspondiente canal 2 (fluorescencia de GFP-Rogdi/mGFP) y 3 (Syt1-fluorescencia) de cada área del cubreobjetos haciendo clic en Ejecutar ahora. Nota: El ROI sólo debe considerar si la celda está transfected doble. En este método, mOrange y GFP fluorescencia debe ser claramente visible.</li>
	<li>Guardar los datos en el editor de registro de análisis haciendo clic en los datos de registro.</li>
	<li>Abra el editor de registro de análisis en la pestaña de Windows y copiar los valores para cada canal. Pegar los valores de los canales separados en una hoja de cálculo.</li>
	<li>Determinar la intensidad de fluorescencia media del canal Syt1 en ROIs en ambas condiciones de transfección (GFP-Rogdi y mGFP).</li>
	<li>Aplicar las pruebas estadísticas apropiadas como Student t-test para determinar diferencias significativas.</li>
</ol>

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<li>Afuwape, O. A. T., Wasser, C. R., Schikorski, T., Kavalali, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+pool-specific+modification+of+neurotransmitter+release+by+intravesicular+free+radical+generation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle pool-specific modification of neurotransmitter release by intravesicular free radical generation.</a> The Journal of Physiology. 595, 1223-1238 (2017).</li>
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<li>Piccoli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+Controls+Synaptic+Vesicle+Storage+and+Mobilization+within+the+Recycling+Pool%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">LRRK2 Controls Synaptic Vesicle Storage and Mobilization within the Recycling Pool.</a> Journal of Neuroscience. 31, 2225-2237 (2011).</li>
<li>Tracy, T. E., Yan, J. J., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+knockdown+of+AMPA+receptors+reveals+a+trans-synaptic+signal+for+presynaptic+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Acute knockdown of AMPA receptors reveals a trans-synaptic signal for presynaptic maturation.</a> The EMBO Journal. 30, 1577-1592 (2011).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hay tres ensayos utilizados habitualmente para el estudio de vesícula sináptica (SV) reciclaje. Los dos primeros incluyen el uso de un) styryl fluorescente tintes como el FM1-43 (que incorporan en las membranas, se toman en orgánulos durante la endocitosis y se liberan después de exocitosis); y b) con la etiqueta fluorescente proteínas recombinantes de SV (que, a la sobreexpresión, incorporan a la maquinaria proteica de reciclaje). Si los fluoróforos acoplados cambian su fluorescencia dependiendo del pH, puede usarse par...

Estudio de vesícula sináptica reciclaje es importante para determinar cómo cambian propiedades presinápticos, en plasticidad sináptica o en respuesta a la perturbación de la función sináptica. Estudio de Synaptotagmin-1 (Syt1) anticuerpos absorción proporciona un método para medir la cantidad de reciclaje de SV. Syt1 es una SV-proteína que actúa como un sensor de Ca2 + y es necesario exocitóticas liberación del neurotransmisor1,2. Es una proteína transmembrana con un dominio citoplásmico c-terminal fuera de la SV y un dominio luminal del N-terminal dentro del SV3. Durante la exocitosis, el dominio luminal de Syt1 queda expuesto al medio externo. A este medio externo, añadimos anticuerpos dirigidos contra el dominio citoplásmico, que se convierte en interiorizado durante la endocitosis. Estos anticuerpos pueden ser que ya sea previamente conjugado con fluoróforos o immunostained con anticuerpos secundarios4,5,6,7. La intensidad de fluorescencia de la immunosignal resultante es proporcional a la cantidad de reciclaje de SV. Este enfoque puede utilizarse para determinar SV constitutiva e inducidas por despolarización reciclaje6,8.
Ensayos de absorción de Syt1 pueden realizarse después de transferencia génica mediada por virus a prácticamente todas las células en el plato o escasa de la transfección de un pequeño número de células. Nuestro método combina el ensayo con escasa doble transfección de neuronas hippocampal primarias utilizando fosfato de calcio9. Utilizamos una proteína recombinante marcador sabida que se acumulan en presynapses, fluorescencia etiquetada Synaptophysin, localizar los terminales presinápticos y sobreexpresan la proteína de interés, Rogdi. Esto nos permite probar si o no Rogdi objetivos funcionales sinapsis y afecta a SV de reciclaje. La codificación Rogdi del gene fue identificado originalmente en una pantalla para mutantes de Drosophila caracterizados por alteración de la memoria10. En los seres humanos, mutaciones en el gene de Rogdi causan una enfermedad devastadora y rara llamada síndrome de Kohlschütter Tönz. Los pacientes sufren de malformaciones de esmalte dental, epilepsia farmacorresistente y retraso psicomotor; sin embargo, la localización subcelular del producto del gen seguía siendo evasiva11. Así, el ensayo de absorción de Syt1 proporcionó evidencia clave para la localización de GFP con la etiqueta Rogdi en sinapsis funcional9.
Esta técnica de absorción tiene varios beneficios. En primer lugar, SV reciclaje puede observarse tanto en tiempo real realizando en proyección de imagen de7,12y después de fijación6,9 midiendo la intensidad de fluorescencia de la etiqueta de Syt1 fluorescencia. Además, se han desarrollado diversas variantes de anticuerpos Syt1. Hay variantes sin etiquetar que pueden ser etiquetadas con un anticuerpo secundario siguiendo un protocolo estándar immunostaining después de la fijación y variantes previamente conjugadas con una etiqueta de fluorescencia ya fijada. Finalmente, basados en anticuerpos de fluorescencia es ventajosa debido a la gran variedad de tintes secundarios o conjugados comercialmente disponibles que se pueden utilizar.
Cuando la fijación y el immunostaining las neuronas, también es posible teñir proteínas adicionales y realizar análisis de colocalización. Esto puede ayudar a determinar dónde se ubican en lo referente a reciclaje SVs. La intensidad de la etiqueta de la fluorescencia es la medida directa de la cantidad de SV de reciclaje. Además, los anticuerpos selectivamente etiqueta de Syt1 que contiene estructuras, dando por resultado alta especificidad y poca fluorescencia de fondo4. Diferentes protocolos de estimulación pueden usarse, como buffers de despolarización o estimulación eléctrica protocolos9,12,13,14. Sin embargo, el reciclaje de SV básico puede medirse sin estimular los cultivos neuronales15.
Nuestro método dirige específicamente Syt1 absorción de anticuerpo en las neuronas transfectadas doble con inmunomarcación de anticuerpo secundario después de la fijación. Sin embargo, nos referimos a todas las variantes usadas rutinariamente el ensayo en nuestra discusión para dar a los espectadores una oportunidad para adaptar el protocolo a necesidades específicas.

<table><tbody><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7030-50g</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306-100g</td><td></td></tr><tr><td>CoolSNAP HQ2</td><td>Fotometría</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dH2O</td><td>Invitrogen</td><td>15230</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Merck</td><td>8.03456.0100</td><td></td></tr><tr><td>anti ratón burro Alexa 647</td><td>Jackson-Immunoresearch</td><td>715605151</td><td>anticuerpo</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>41966</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>multipocillo 24 pocillos</td><td>Fisher Scientific</td><td>087721H</td><td></td></tr><tr><td>tubo (50 mL)</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td>227261</tr><tr><td>FBS superior</td><td>BiochromAG</td><td>S0615</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Merck</td><td>1.083.421.000</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14170</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034-500g</td><td></td></tr><tr><td>Hera Cell 150 (Inkubator)</td><td>ThermoElectron Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-500g</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Honeywell</td><td>M0250-500g</td><td></td></tr><tr><td>portaobjetos de microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>10144633CF</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mowiol4-88</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioFroxx</td><td>1394KG001</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>BioFroxx</td><td>5155KG001</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>OpenView Experiment Analysis Application Software</td><td>libre, ver comentarios</td><td></td><td>escritos por Noam E. Ziv, Technion &ndash; Instituto de Tecnología de Israel, Haifa, Israel</td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>Roche</td><td>11666789001</td><td></td></tr><tr><td>Optimem</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Penstrep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>P6148-1kg</td><td></td>capucha de</tr><tr><td>seguridad</td><td>ThermoElectron</td><td></td><td>Nº de serie 40649111</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>neoFroxx</td><td>1104kg001</td><td></td></tr><tr><td>Synaptotagmin1</td><td>Synaptictic Systems</td><td>105311</td><td>ratón monoclonal; clon 604.2</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>1.086.031.000</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genius 3&nbsp;</td><td>Baño</td> de agua IKA <td>3340001</td><td></td></tr><tr><td></td><td>GFL</td><td>1004</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Observer. Z1&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un análisis óptico para el reciclaje de la vesícula sináptica en neuronas cultivadas overexpressing proteínas presinápticas

An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

En las terminales nerviosas presinápticas activo vesículas sinápticas se someten a ciclos de exo y endocitosis. Durante el reciclaje, el luminales dominios de proteínas transmembranales SV verse expuestos en la superficie celular. Una de estas proteínas es Synaptotagmin-1 (Syt1). Un anticuerpo dirigido contra el dominio luminal de Syt1, una vez añadido al medio de cultivo, se toma durante el ciclo exo-endocytotic. Esta absorción es proporcional a la cantidad de SV reciclaje y puede cuantificarse a través de inmunofluorescencia. Aquí combinamos Syt1 absorción de anticuerpos con doble transfección de neuronas hippocampal cultivadas. Esto nos permite (1) localizar sitios presinápticos en la expresión de marcadores presinápticos recombinante Synaptophysin, (2) determinar su funcionalidad mediante absorción de Syt1 y (3) caracterizar la focalización y efectos de una proteína de interés, GFP-Rogdi.

Un resultado previsto de este enfoque es localizar aproximadamente 50 doble-transfected las neuronas por cubreobjetos en densidades de 50.000 neuronas por pozo. El axón de cada neurona se espera para mostrar múltiples zonas interactivas de acumulación Synaptophysin fluorescencia etiquetada, indicando grupos ofSVs. En los sitios presinápticos funcionales, la señal de Synaptophysin recombinante colocalizes con fluorescencia Syt1 punteada. Doble transfección, GFP-Rogdi como la proteína de in...

Describimos un análisis óptico para la vesícula sináptica (SV) reciclado en neuronas cultivadas. Combinar este protocolo con doble transfección para expresar un marcador presináptico y la proteína de interés nos permite localizar sitios presinápticos, su vesícula sináptica capacidad de reciclaje y determinar el papel de la proteína de interés.

Un análisis óptico para el reciclaje de la vesícula sináptica en neuronas cultivadas Overexpressing proteínas presinápticas

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...

La principal ventaja de esta técnica es que es muy sencilla, requiere solo un equipo estándar y se beneficia de la principal ventaja de los anticuerpos, que es su especificidad. El protocolo fue introducido originalmente por Michela Matteoli y sus colegas, y ha demostrado ser muy eficaz. Lo he usado para probar si una determinada proteína cordocti está localizada en sinapsis activas.Comience este procedimiento cultivando células primarias del hipocampo en cubreobjetos en una placa de 24 pocillos durante tres días, como se describe en el protocolo de texto. Precaliente el medio de suero reducido, el medio de cultivo celular y el agua destilada a 37 grados centígrados en el baño de agua. Trabajando bajo la campana de flujo laminar para garantizar condiciones de trabajo estériles, prepare la mezcla de transfección en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.En primer lugar, mezcle 7,5 microlitros de cloruro de calcio de dos molares con cuatro microgramos de cada ADN libre de endotoxinas. Agregue agua para alcanzar un volumen total de 60 microlitros en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Ahora, agregue 60 microlitros de tampón de transfección a la mezcla.Para obtener los mejores resultados, agregue el tampón de transfección gota a gota mientras agita suavemente la mezcla de ADN en el vórtice. Incubar la mezcla de transfección resultante a temperatura ambiente durante 20 minutos. Evite agitar el tubo durante el tiempo de incubación.Bajo la campana de flujo laminar, retire el medio de cultivo celular de los pocillos con una pipeta de 1.000 microlitros, guárdelo en un recipiente separado y agregue inmediatamente 500 microlitros de medio de suero reducido a cada pocillo. Guarde el medio acondicionado en la incubadora. Incubar las células a 37 grados centígrados y 5% de CO2 hasta que finalice el período de incubación de 20 minutos para la mezcla de transfección.A continuación, añada 30 microlitros de mezcla de transfección a cada pocillo pipeteando varias gotas. Deseche el residuo en el fondo del tubo. Después de que todos los pocillos hayan sido suministrados con la mezcla de transfección, agite suavemente la placa de 24 pocillos para asegurar la distribución de la mezcla de transfección en el medio.Ahora incube los pocillos durante 60 minutos a 37 grados centígrados y 5% de CO2. Después de la incubación, retire y deseche la mezcla de transfección y lave las células tres veces con medio de cultivo celular. El paso de lavado es crítico.Minimice el tiempo que cada pozo no tiene medio retirando y reemplazando pozo por pozo. Además, asegúrese de agregar el medio suavemente. Para lavar las células, agregue un mililitro de medio de cultivo celular a cada pocillo e incube durante 30 segundos a temperatura ambiente.Luego, retire 750 microlitros de medio y agregue la misma cantidad de medio fresco. Después de repetir este proceso tres veces, retire y deseche el medio de cultivo celular y agregue 450 microlitros del medio acondicionado pocillo por pocillo. Ahora deje que las neuronas maduren en la incubadora a 37 grados centígrados y 5%CO2 a DIV 10.Precaliente 600 microlitros de tampón de despolarización 1X y 10 mililitros de medio de cultivo celular a 37 grados centígrados en el baño de agua. Agregue un microlitro de anticuerpo Anti-Syt1 de ratón al tampón de despolarización 1X y vórtice durante 10 segundos. Después de eliminar y desechar el medio de cultivo celular de las células, agregue 200 microlitros de la mezcla de anticuerpos de despolarización a cada pocillo.Incubar la placa durante cinco minutos a 37 grados centígrados y 5%CO2 en la incubadora. Retire y deseche la mezcla de anticuerpos de despolarización y lave las células tres veces con medio de cultivo celular. Agregue un mililitro de medio de cultivo celular a cada pocillo e incube durante 30 segundos a temperatura ambiente.Luego, retire 750 microlitros de medio y agregue la misma cantidad de medio fresco. Repite este proceso tres veces. A continuación, retire y deseche el medio de cultivo celular y agregue 300 microlitros de PFA al 4% en 1X PBS.Finalmente, incube durante 20 minutos a cuatro grados centígrados antes de lavar tres veces durante cinco minutos cada una con 1X PBS. Diluir el anticuerpo secundario acoplado a fluoróforos en 200 microlitros de tampón de bloqueo para cada pocillo en una dilución de uno a 1.000. Retire y deseche el PBS 1X de cada pocillo que contenga cubreobjetos con las neuronas cultivadas.Agregue 200 microlitros de mezcla de anticuerpos tampón bloqueante a cada pocillo e incube durante 60 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, lave las células tres veces durante cinco minutos con un mililitro de 1X PBS. A continuación, añada una gota de siete microlitros de medio de inclusión en el portaobjetos del microscopio.Retire el cubreobjetos de la placa de 24 pocillos levantándola con una cánula y agarrándola con pinzas. Sumerja el cubreobjetos en agua destilada para eliminar el PBS y séquelo cuidadosamente tocando un pañuelo blando con un borde. Voltee el cubreobjetos sobre la gota del medio de inclusión de modo que la superficie que transporta las células quede frente al portaobjetos del microscopio, incrustando así las células en el medio de inclusión.Deje que los portaobjetos se sequen bajo el capó durante una o dos horas, cubriéndolos para evitar la exposición a la luz. Guarde los portaobjetos secos en una caja de portaobjetos de microscopio a cuatro grados centígrados. Después de inmunomarcar el anticuerpo Syt1 con un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia, el grado de absorción de Syt1 se cuantifica finalmente mediante la inmunoseñal.La inmunofluorescencia punteada indica los sitios de absorción de Syt1 en el campo de visión. Por lo tanto, estos sitios contienen vesículas sinápticas que se reciclaron durante el experimento. La fluorescencia de Synaptophysin-mOrange indica acumulaciones de vesículas sinápticas en el axón de una neurona transfectada.La fluorescencia de GFP-Rogdi indica acumulaciones de Rogdi en el axón de la neurona transfectada. Esta parte del experimento revela una amplia colocalización de GFP-Rogdi y sinaptofisina-mOrange, lo que sugiere que GFP-Rogdi se acumula en sitios presinápticos dentro del axón. La superposición revela cuáles de las coacumulaciones de GFP-Rogdi y Synaptophysin-mOrange se colocalizan con los sitios de absorción del anticuerpo Syt1.Los sitios marcados con flechas representan acumulaciones de Rogdi recombinante y sinaptofisina recombinante en sinapsis funcionales. El protocolo describe una forma técnicamente sencilla de determinar el alcance del reciclaje de residuos sinápticos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la ciencia molecular y celular, como dónde se asignan las terminales nerviosas presinápticas en un axón de una determinada neurona y si una proteína recombinante o endógena de interés se acumula en estas terminales.Después de su desarrollo, esta técnica se ha utilizado de muchas maneras para monitorear el reciclaje de vesículas sinápticas en terminales presinápticas. Por ejemplo, se puede utilizar para determinar el reciclaje de vesículas sinápticas en neuronas después de la sobreexpresión en proteínas adaptativas, así como en neuronas obtenidas de animales o de neuronas derivadas de células madre.

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Investigación

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Neuroscience

Neurociencia

Este protocolo detalla la forma de cuantificar el número de sinapsis en cultivos neuronales disociadas y en las secciones del cerebro utilizando inmunocitoquímica. Utilizando anticuerpos específicos contra el compartimiento, que etiqueta los terminales presinápticos, así como los sitios de especialización post-sináptica. Se define como puntos de sinapsis de colocalización entre las señales generadas por estos marcadores.

Las sinapsis cuantificar: un ensayo basado en inmunocitoquímica para cuantificar número de sinapsis

Este informe demuestra una técnica para aislamiento mecánico de las neuronas individuales viable mantener unido boutons presináptica. Vibrodissociated neuronas tienen la ventaja de una rápida producción, el control farmacológico excelente y mejora del espacio-clamp sin la influencia de las células vecinas. Este método puede ser utilizado para obtener imágenes de los elementos sináptica y la grabación de patch-clamp.

Vibrodissociation de las neuronas del cerebro de roedores Rodajas para el Estudio de la transmisión sináptica y la imagen terminales presinápticos

Una técnica en vivo imágenes de fluorescencia para cuantificar la reposición y la movilización de las vesículas sinápticas específicas (SV) se estanca en los terminales nerviosos centrales se describe. Dos rondas de SV de reciclaje son monitoreados en las terminales nerviosas que se proporciona un control interno.

Análisis cuantitativo de Reposición Synaptic piscina vesículas en cultivos de neuronas granulares del cerebelo con tintes FM

Este video muestra el procedimiento para preparar neuronas cultivadas para el análisis óptico de vesículas sinápticas recicladas. El proceso implica el marcaje por fluorescencia de las proteínas de las vesículas sinápticas y la inmunotinción para etiquetar y visualizar las vesículas recicladas dentro de las neuronas.

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Se describe el uso de colorantes de estirilo FM a la imagen de reciclado de vesículas sinápticas en las terminales nerviosas funcionales. Este protocolo se puede aplicar no sólo a evocada, sino también espontánea y actividades sinápticas en miniatura. El protocolo se expande la variedad de eventos sinápticas que pueden ser evaluados de manera eficaz.

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Este artículo proporciona un método para investigar la dinámica de las vesículas de neurotransmisores en células de neuroblastoma, utilizando una construcción de sinaptobrevina2-pHluorin y Microscopía de Fluorescencia de Reflexión Interna Total. También se reporta la estrategia desarrollada para el procesamiento de imágenes y análisis de datos.

TIRFM y GFP-sondas sensibles al pH para Evaluar neurotransmisor Vesícula Dinámica en células SH-SY5Y neuroblastoma: imágenes de células y análisis de datos

Endocitosis de vesículas sinápticas se detectan por microscopia ligera de pHluorin fusionado con la proteína de la vesícula sináptica y por microscopia electrónica de la absorción de la vesícula.

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Puede modular la excitabilidad neuronal a través de un proceso dinámico de endo - y exocitosis de los receptores de glutamato ionotrópicos excitadores. Se describe aquí es un análisis accesible, de alto contenido para la cuantificación del receptor de superficie e interno población piscinas.

Un análisis de contenido de alta para seguimiento AMPA del Receptor de tráfico

La formación de presinapsis es un proceso dinámico que incluye la acumulación de proteínas sinápticas en el orden correcto. En este método, la formación de presináptica se desencadena por perlas conjugadas con una proteína organizadora de la presinapsis en láminas axonales del cultivo de "bola de neurona", por lo que la acumulación de proteínas sinápticas es fácil de analizar durante la formación de la presinapsis.

Ensayo de formación de presinapse utilizando cuentas organizadoras de presinapsiona y cultura de "Bola de neurona"

Se describen dos métodos relacionados para visualizar los eventos subcelulares necesarios para la transmisión sináptica. Estos protocolos permiten el monitoreo en tiempo real de la dinámica de la afluencia de calcio presináptico y la fusión de la membrana de vesícula sináptica utilizando imágenes de células vivas de neuronas cultivadas in vitro .

Medición fluorescente en tiempo real de las funciones sinápticas en modelos de esclerosis lateral amiotrófica

DetectSyn es un ensayo fluorescente rápido e imparcial que mide los cambios en el número relativo de sinapsis (compromiso pre y postsináptico) en todos los tratamientos o estados de enfermedad. Esta técnica utiliza una técnica de ligadura de proximidad que se puede utilizar tanto en neuronas cultivadas como en tejido fijo.

DetectSyn: un método fluorescente rápido e imparcial para detectar cambios en la densidad de la sinapsis

Aprende un ensayo óptico para analizar el reciclaje de vesículas sinápticas en neuronas de hipocampo cultivadas usando transfección y marcadores presinápticos. Este método permite evaluar la localización de proteínas en terminales activos.

Un análisis óptico para el reciclaje de la vesícula sináptica en neuronas cultivadas Overexpressing proteínas presinápticas

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