Cuantitativa de polimerasa análisis reacción-basado cadena de la Microbiota Intestinal murino después del tratamiento antibiótico Oral

Este protocolo proporciona un método confiable para cuantificar los cambios es la microbiota intestinal de los ratones después de la administración oral de antibióticos. Esto puede ayudar a la investigación sobre las interacciones entre microbiotas proporcionando información sobre las patologías asociadas con la disbiosis microbiana como la enfermedad inflamatoria intestinal. La principal ventaja de estos regímenes de tratamiento con antibióticos es que previenen la pérdida de peso característica normalmente asociada con la administración de antibióticos orales a ratones.

Para preformar el tratamiento antibiótico a través del gavage oral preparar un cóctel de antibióticos mediante la mezcla de soluciones de stock que se han preparado como se describe en el protocolo tecnológico. Para un volumen de mililitro mezclar 50 microlitros de ampicilina, 50 microlitros de gentamicina, 50 microlitros de neomicina, 500 microlitros de metronidazol, 25 microlitros de vancomicina y 325 microlitros de agua. Cargue la mezcla de antibióticos en una jeringa de un mililitro mientras elimina cualquier burbuja y adjunte una aguja de gavage de medición adecuada.

Agarra la piel sobre el hombro del ratón firmemente y estira la cabeza y el cuello para enderezar el esófago. Dirija la punta de la bola de la aguja de alimentación a lo largo del techo de la boca y hacia la parte posterior de la faringe. A continuación, páselo suavemente hacia el esófago e inyecte las 200 microlitros de solución.

Administrar el cóctel antibiótico una vez al día durante el experimento. Alternativamente para administrar antibióticos a través del agua potable, preparar un cóctel de antibióticos como se describe en el protocolo técnico. Es importante incluir edulcorante en la mezcla de antibióticos, ya que este es un factor crucial para prevenir la deshidratación de ratones.

Llene el cóctel antibiótico en una botella de agua a aproximadamente 100 mililitros por botella. Proteja la botella de la luz y colóquela en una jaula del ratón. Sustituya el cóctel antibiótico por caldo fresco dos veces por semana durante el experimento.

El control cuidadoso del peso de los ratones y del estado de salud general debe preformarse diariamente durante la administración de antibióticos. Pese y etiquete dos tubos de autoclave de mililitro para la recolección de muestras. Para la recolección de muestras de heces frescas coloque cada ratón en un retén.

A continuación, recoger pellets fecales directamente del ano en un tubo de recogida. Después de realizar la eutanasia como se describe en el protocolo tecnológico poner una carcasa de ratón con el abdomen completamente expuesto y rociar la zona abdominal con 70%etanol. El uso de fórceps y tijeras esterilizadas hace una incisión transversal en el abdomen para exponer el peratenium sin dañar ningún tejido interno.

Levante el peratenio y haga una incisión para exponer los intestinos. Retire los intestinos con los fórceps y las tijeras y colóquelo en un plato de Petri esterilizado. Utilice cuidadosamente los fórceps para burlarse del intestino delgado lejos de las arterias mesentéricas y la grasa.

Extienda el intestino y colóquelo en una toallita de laboratorio limpia. Con una regla medir y cortar cuatro centímetros del íleon distal del intestino delgado. Cortar y desechar el centímetro del intestino proximal al cecum.

Quedará una porción de tres centímetros de íleon que se utilizará para recolectar bacterias intestinales. Sostenga la porción de íleon sobre un tubo estéril de dos mililitros. Recoger el contenido intestinal extruyendo directamente el intestino y recogiendo la muestra en el tubo.

Esta muestra tendrá bacterias del contenido de íleon. Prepare una jeringa de 20 mililitros con solución salina tamponada con fosfato frío y enjuague la porción de íleon desechando el flujo. Coloque la porción de íleon sobre un plato estéril de Petri y ábrala longitudinalmente con tijeras.

Raspa el interior de la pared del íleon con un bisturí. Recoger cualquier bacteria en el bisturí lavándolo con un mililitro de PBS sobre un tubo de centrífuga limpia. Girar a ocho mil veces G durante cinco minutos para peletizar la bacteria.

Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante. Esta muestra contendrá bacterias de la pared del íleon. Pesar los tubos que contienen las muestras de heces e íleon.

Restar el peso de los tubos vacíos para obtener el peso fecal en cada muestra. Extraiga ADN bacteriano de heces, contenido de íleon y muestras de pared de íleon utilizando kits disponibles comercialmente. Almacene las muestras de ADN a menos 20 grados centígrados hasta su uso.

Descongele el estándar qPCR, el ADN de muestra fecal y los reactivos qPCR de un kit disponible comercialmente sobre hielo. Diluir el estándar en agua libre de ADN estéril en un rango de 10 a los siete a 10 a las dos copias por microlitro. Diluir el ADN de la muestra fecal a una mitad, una quinta y una décima concentración.

A continuación, haga una reacción de mezcla maestra para el número total de reacciones más una. Mezclar 30 microlitros de la mezcla maestra y 5 microlitros de la plantilla, que es el estándar, la muestra o el agua para el control negativo. A continuación, agregue 10 microlitros de esta mezcla a cada pozo en una placa qPCR óptica de 384 pozos.

Realizar cada reacción en triplicado. Selle brevemente la placa qPCR y la centrífuga. A continuación, cargue la placa en la máquina qPCR que se programa como se indica en el protocolo técnico.

Por último, obtenga los valores de umbral de ciclo para el estándar y las muestras antes de calcular los números de copia de 16S rDNA para muestras fecales. Los resultados representativos muestran pérdida de peso en ratones después de la administración de antibióticos por gavage oral o a través del agua potable. No se detecta pérdida de peso notable en ratones que reciben antibióticos por gavage oral.

Cuando los ratones son tratados con antibióticos en el agua potable pierden alrededor del 10% de su peso corporal dentro de los primeros días de tratamiento, pero recuperan el aumento de peso normal a partir de entonces. La cuantificación de bacterias en muestras fecales requiere el uso de una curva estándar obtenida trazando el logaritmo del número de copia para el estándar frente a los valores C-T obtenidos en el qPCR. Dentro del rango lineal, la ecuación de análisis de regresión permite cuantificar la abundancia de ADNr 16S dentro de las muestras fecales.

Como se muestra aquí para las heces, el contenido del intestino delgado y las muestras de la pared del intestino delgado. Después de cinco o 10 días de administración oral de antibióticos hay una fuerte disminución en la densidad de bacterias en las muestras de heces de ratones tratados con antibióticos. Sin embargo, la densidad de bacterias en las heces se recuperó a niveles normales una semana después de la administración de antibióticos se detiene.

Tanto el gavage oral como la administración de antibióticos en el agua potable disminuyen brevemente la carga bacteriana fecal en ratones tratados. Investigadores que seleccionan el método individual que mejor se adapte a los requisitos experimentales teniendo en cuenta factores como la duración del tratamiento. El método qPCR para la cuantificación de bacterias se puede modificar para cuantificar taxones bacterianos individuales utilizando imprimaciones específicas.

Esto proporcionará información cuantitativa y cualificativa sobre el tamaño y la composición del microbioma.