El examen de los fenotipos de acogida en Gambusia affinis Tratamiento antibiótico Siguiendo

El objetivo general de este sistema experimental es examinar los efectos secundarios negativos para un organismo huésped después del tratamiento con antibióticos. Por lo tanto, este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del microbioma, como los efectos secundarios asociados a enbac en la salud del huésped que están mediados por un microbioma alterado. Por lo tanto, las principales ventajas de esta técnica son que este sistema es sencillo, económico para examinar los fenotipos fisiológicos de los huéspedes vertebrados y permite la alteración no invasiva del microbioma de la mucosa.

Las implicaciones de esta técnica caracterizan cómo una alteración en el microbioma de un animal puede provocar efectos secundarios importantes. Para comenzar, escardar una cepa infecciosa previamente obtenida y congelada de Edwardsiella ictaluri en agar medio selectivo y diferencial E.Ictaluri. Incubar el cultivo a 27 grados centígrados durante dos días.

Transfiera una colonia aislada pura del cultivo e inocule un matraz de 150 mililitros que contenga 40 mililitros de caldo de nutrientes. Coloque el matraz en una incubadora agitadora a 27 grados centígrados y 150 RPM durante dos días. Después de la incubación, para calibrar el cultivo de E. Ictaluri para los volúmenes de dosis infecciosa deseados, utilice PBST para diluir una muestra del cultivo a una DO 650 de 0,2.

Después de recolectar Gambusia affinis y tratar a los peces con rifampicina en la columna de agua durante tres días, transfiera los grupos de peces de control tratados con antibióticos y no tratados a vasos de plástico individuales que contengan 130 mililitros de agua dulce de estanque artificial, o APW, durante aproximadamente 10 horas para la eliminación del medicamento de los tejidos de los peces. Luego, separe el pescado nuevamente en vasos de plástico individuales de ocho onzas que contengan 130 mililitros de APW limpio. Administrar una dosis letal de cultivo de E. Ictaluri a cada pez e incubar los peces a 27 grados centígrados durante 24 horas.

Después del baño de E.Ictaluri, transfiera cada pez a una nueva taza con 130 mililitros de APW. Sin alimentar a los peces, registre la mortalidad de los peces durante una semana. Reúna la materia fecal recolectada en una bolsa de plástico estéril antes de transferirla a un tubo cónico estéril de 15 mililitros, luego use PBST para crear una concentración de stock de materia fecal de 500 a 800 miligramos por mililitro, usando una pipeta de plástico de un mililitro o más grande con la punta cortada, prepare 130 mililitros por taza de 15 miligramos por mililitro o 10 miligramos por mililitro de materia fecal en APW.

Transfiera los peces tratados con antibióticos o no tratados a tazas individuales de la solución, y luego incube los peces a 25 grados Celsius durante dos días, observando de cerca y registrando la mortalidad durante este tiempo. Para tratar a los peces con tierra, recoja de uno a kilogramos de tierra vegetal orgánica rica, aproximadamente siete para 15 centímetros de profundidad, y transfiérala a un recipiente de plástico limpio. Prepare vasos de plástico individuales que contengan 18,2 gramos de tierra y 130 mililitros de APW, mezclando bien la tierra a mano, luego transfiera el pescado tratado con antibióticos o sin tratar a los vasos y déjelo a 25 grados centígrados durante tres días mientras se registra cualquier mortalidad.

Después de un período de descanso de 10 horas en APW después del tratamiento con antibióticos, transfiera los peces a tazas individuales que contengan 17,5 miligramos por mililitro de cloruro de sodio y APW, observe a los peces durante más de 36 horas para detectar la mortalidad, para llevar a cabo un desafío de toxicidad por nitratos, después de un período de descanso de 10 horas como antes, separe los peces en tazas individuales que contengan 10 o 17,5 miligramos por mililitro de nitrato de sodio y 130 mililitros de APW. Observe a los peces en el transcurso de un día para detectar la mortalidad con la dosis alta de nitrato de sodio, y cuatro días para los peces con la dosis baja. Después de completar tres días de exposición a antibióticos o control en grupos, para peces individuales, llene vasos de espuma de poliestireno de ocho onzas con 150 mililitros de APW, y después de pesar los vasos llenos, transfiera el pescado a los vasos, luego registre el peso corporal total para la evaluación inicial.

Alimente a los peces diariamente con dos pellets de comida por pez, controle el consumo registrando visualmente los pellets no consumidos. Al final de cada semana, en el transcurso de cuatro semanas, determine el peso del pez pesando primero una taza de APW fresco y registre el peso, luego vierta el pescado en una red de inmersión y transfiéralo a la nueva taza, antes de volver a pesar la taza. Para grupos de peces, coloque 150 mililitros de APW en una taza y tara la escala.

Mantenga los peces juntos en ambos grupos cuando los transfiera a nuevos contenedores de APW, luego registre el peso total del grupo. Repita el pesaje al final de cada semana en el transcurso de un mes. Para analizar el tiempo de tránsito intestinal, agregue 360 microlitros de agua desionizada estéril y 52 miligramos de gelatina en un tubo estéril de 1,7 mililitros y colóquelo en un bloque de calor a 60 grados Celsius hasta que la gelatina se derrita y se disuelva por completo.

Con un mortero, muela las hojuelas de comida de pez dorado hasta obtener un polvo fino y agrega 40 miligramos del polvo al tubo junto con 20 microlitros de aceite de pescado. Después de mezclar, agregue 1,6 miligramos de dextrano FitC. Dispense 20 gotas de microlitros del líquido caliente en el parafilm en la mesa de laboratorio y deje que se enfríen y solidifiquen rápidamente.

Coloque el parafilm en la mitad de una placa de Petri y hágalo flotar sobre agua estéril dentro de un recipiente de plástico sellado. Guarde las gotas solidificadas en el refrigerador hasta por cuatro días antes de que se vuelvan demasiado duras para que los peces las coman. Justo antes de alimentar, use una cuchilla de afeitar para cortar las gotas en cuartos de sección.

Aclimate a los peces a tazas individuales de espuma de poliestireno durante dos días sin alimentarse, coloque cuatro cuartos de la comida en la taza de pescado y observe a los peces durante 30 minutos para ver cuántas piezas de comida come cada uno. Para comenzar el monitoreo, transfiera los peces individuales a tazas con 80 mililitros de APW y, cada dos horas, tome una muestra de 1 mililitro. Guárdelo en un tubo etiquetado de 1,7 mililitros a cuatro grados centígrados.

Una vez finalizado el ensayo, coloque una muestra completa de un mililitro en una cubeta y utilice un espectrofotómetro de fluorescencia para registrar la fluorescencia a una excitación de 495 nanómetros y una emisión de 520 nanómetros para todas las muestras al mismo tiempo. como se muestra aquí, los peces con un microbioma alterado por antibióticos eran más susceptibles a una infección por E. Ictaluri que los peces de control. La diferencia en el tiempo medio hasta la muerte de los peces tratados frente a los peces control no fue significativa.

Es probable que esto se deba al pequeño tamaño del grupo. Este gráfico ilustra que los peces expuestos a la rifampicina fueron más susceptibles al estrés osmótico que los peces control, con este ensayo, los niveles de salinidad por encima de 18 miligramos por mililitro resultaron en una rápida muerte de los peces. Como se demuestra en esta tabla, cuando se expuso a la toxina nitrato en la columna de agua, la preexposición al tratamiento con antibióticos no afectó la supervivencia.

A 10 miligramos por mililitro, se observó una letalidad del 50% tanto en el grupo tratado con antibióticos como en el grupo control a las 90 horas. En este experimento con peces de control en un acuario, se alimentaron dos secciones de alimento marcado con dextrano FitC o una sección a los peces para examinar el tiempo de tránsito de los alimentos midiendo la fluorescencia en el agua circundante a lo largo del tiempo. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la medición de las reservas totales de grasa corporal y la cuantificación de la producción de moco en la piel, para comprender los mecanismos y reducir los factores de confusión que podrían contribuir a los efectos negativos del huésped.