Medición de interacciones transcelulares a través de la agregación de proteínas en un sistema celular heterologoso
22 de mayo de 2020
Aquí, presentamos un protocolo optimizado para medir rápida y semicuantitativamente las interacciones ligando-receptor en trans en un sistema celular heterologoso utilizando microscopía de fluorescencia.
El ensayo basado en células permite la observación y cuantificación de las interacciones de transadhesión sin necesidad de largas purificaciones de proteínas ni equipos especializados. Aunque las interacciones de proteínas probadas aquí son relevantes para la neurobiología, este método puede aplicarse a cualquier área de investigación en la que la adhesión de proteínas se produzca intercelularmente. 48 horas después de transfectar las células HEK-293T, recoja las células de la placa de seis pocillos para su agregación.
Primero, lave cada pocillo dos veces con PBS. A continuación, para disociar suavemente las células, agregue un mililitro de EDTA 10 milimolar a cada pocillo, luego incube la placa a 37 grados centígrados. Después de cinco minutos de incubación, golpee suavemente la placa para separar las células y coseche cada pocillo en un tubo cónico separado de 15 mililitros.
Centrifugar los tubos a 500 x g a temperatura ambiente durante cinco minutos. Mientras se granulan las células, prepare seis tubos de incubación etiquetando la parte superior de los tubos de microcentrífuga con las condiciones experimentales. Se deben utilizar todas las permutaciones de GFP y mCherry.
Retire el sobrenadante de los tubos cónicos de 15 mililitros y vuelva a suspender las células en 500 microlitros de medio. Con un hemocitómetro, cuente las células de cada tubo cónico. A continuación, alícuota 200.000 células de cada condición en el tubo de incubación adecuado para una mezcla uno a uno en un volumen total de 500 microlitros.
Después de evaluar la agregación basal descrita en la siguiente sección, coloque los tubos de incubación en un rotador lento de tubos a temperatura ambiente. Para evaluar la agregación, al inicio y de nuevo después de 60 minutos, pipetear 40 microlitros del tubo de incubación en un portaobjetos de microscopio cargado. La adquisición de la línea de base debe realizarse lo más rápido posible después de la adición de células al tubo de microcentrífuga.
Imagine el portaobjetos bajo fluorescencia en los canales verde y rojo. Para cada diapositiva, capture imágenes de tres campos de visión diferentes en un plano focal. Las células HEK-293T se transfectaron con una proteína de interés, una proteína mutada de interés o un ligando de interés y se transfectaron conjuntamente con una proteína fluorescente.
Las poblaciones celulares que expresaban la proteína de interés se mezclaron con las poblaciones celulares que expresaban el ligando de interés y se evaluó la agregación después de 60 minutos. En las superposiciones de imágenes capturadas en los canales verde y rojo, la agregación aparece como puntos amarillos. Las condiciones en las que las células no expresaban ningún ligando sináptico mostraron una agregación mínima.
Además, se exhibió una agregación mínima cuando solo una de las dos poblaciones expresaba ligandos sinápticos. No se exhibió agregación cuando las dos poblaciones de células expresaron moléculas de adhesión incompatibles. Las condiciones con moléculas de adhesión compatibles mostraron una agregación significativa después de una incubación de 60 minutos.
Sorprendentemente, la proteína mutada de interés exhibió significativamente más agregación que su contraparte de tipo salvaje, lo que sugiere que la mutación puntual mejora las capacidades de unión de las proteínas. Las mutaciones en muchas moléculas de adhesión se relacionan comúnmente con trastornos del neurodesarrollo, neuropsiquiátricos y de adicción. Con esta técnica, se pueden examinar los efectos de las mutaciones puntuales relevantes de la enfermedad en las interacciones trans.
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Visión general
Este estudio presenta un protocolo optimizado para medir rápida y semicuantitativamente las interacciones ligando-receptor en trans, utilizando un enfoque de microscopía de fluorescencia en células HEK-293T. El método permite la cuantificación de interacciones de adhesión proteica relevantes para la neurobiología y potencialmente otras áreas de investigación.
Componentes clave del estudio
Área de ciencia
- Neurobiología
- Adhesión celular
- Interacciones proteicas
Antecedentes
- Las interacciones ligando-receptor son críticas para la comunicación celular.
- Entender estas interacciones ayuda a dilucidar los mecanismos de los trastornos del neurodesarrollo y neuropsiquiátricos.
- Los métodos tradicionales pueden requerir una extensa purificación de proteínas o equipos especializados.
- Este estudio propone un enfoque más eficiente utilizando microscopía de fluorescencia.
Propósito del estudio
- Desarrollar un protocolo rápido y efectivo para estudiar la adhesión proteica en un ensayo basado en células.
- Evaluar cómo las mutaciones puntuales en proteínas influyen en las interacciones en trans.
- Aplicar este método ampliamente en estudios de adhesión proteica fuera de la neurobiología.
Métodos utilizados
- Se empleó microscopía de fluorescencia para imagen de interacciones celulares.
- Se utilizaron células HEK-293T como modelo biológico, enfocándose en proteínas transfectadas y ligandos.
- El cronograma experimental involucró la evaluación de agregación celular después de 60 minutos post-transfección.
- El conteo celular se realizó usando un hemocitómetro, seguido de la resuspendida y mezcla de células para la imagen.
Resultados principales
- La agregación de células que expresan moléculas de adhesión compatibles se mejoró significativamente después de 60 minutos.
- Las proteínas mutadas mostraron mayor agregación en comparación con sus contrapartes de tipo salvaje, indicando capacidades de unión mejoradas.
- Se observó una agregación mínima cuando ninguna o solo una población expresaba ligandos sinápticos.
Conclusiones
- Este estudio demuestra un método simplificado para evaluar interacciones adhesivas intercelulares.
- Los hallazgos resaltan el potencial de esta técnica para explorar los efectos de las mutaciones en las interacciones proteicas.
- Las perspectivas de este método son valiosas para entender los mecanismos subyacentes a varios trastornos neurodesarrollados y psicológicos.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This assay enables direct measurement of trans protein-protein interactions in a cellular context, addressing a key limitation of biochemical assays that cannot distinguish cis from trans binding. By quantifying only physiologically relevant intercellular adhesion, the method improves target validation confidence and reduces false positives in early discovery. It supports mechanistic de-risking of adhesion targets implicated in neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring functional trans adhesion between ligand and receptor pairs expressed on separate cells.
- Operational Value: Eliminates need for protein purification, enabling rapid screening of mutants or variants directly in a cellular system.
- Predictive Value: Enhanced aggregation with a disease-linked mutation demonstrates how the assay can identify gain-of-function variants for prioritization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Uses fluorescently tagged HEK cells to generate quantifiable imaging readouts (e.g., yellow puncta in overlays) for high-content screening adaptation.
- Reproducibility: Standardized cell mixing and incubation conditions allow consistent aggregation measurements across experiments.
- Scalability: Protocol supports testing multiple conditions (e.g., wild-type vs. mutant, ligand combinations) in parallel using simple mixing and imaging steps.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly tests how point mutations in adhesion molecules—common in neurodevelopmental, neuropsychiatric, and addiction disorders—affect trans interactions.
- Translational Continuity: Bridges in vitro binding assays to cellular phenotypes, supporting go/no-go decisions based on functional adhesion data.
- Mechanistic De-risking: Identifies whether mutations enhance or disrupt intercellular binding, informing target mechanism and safety profiling.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits between target engagement screening and functional validation, providing adhesion-specific data to inform lead optimization and preclinical candidate selection.
- Discovery Biology: Tests whether genetic variants alter intercellular adhesion, supporting pathway clarification and target hypothesis validation.
- Analytics: Generates quantitative imaging-based readouts (aggregate formation over time) to compare conditions and assess interaction strength.
- Translational Research: Links molecular changes to cellular phenotypes relevant to synapse formation and neuronal connectivity.
- Enterprise Reuse: Adaptable to any intercellular protein adhesion system, making it a reusable platform across therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Measures only trans interactions, reducing overestimation of binding seen in lysate-based assays and improving target specificity.
- Operational Value: Uses standard cell culture and fluorescence microscopy, requiring no specialized equipment or complex reagents.
- Strategic Value: Enables rapid assessment of mutation effects on target function, supporting better go/no-go decisions in lead identification.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying variants with altered adhesion that may influence efficacy or toxicity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell transfection, fluorescent protein tagging, and flow cytometry or hemocytometer-based cell counting.
- Dependent on fluorescence microscopy with dual-channel imaging capability (e.g., GFP and mCherry) and image analysis tools for aggregate quantification.
- Needs standardization of cell expression levels and mixing ratios to ensure reproducible aggregation readouts across teams.
- Adaptation to non-HEK systems may require optimization of transfection efficiency and adhesion molecule surface expression.
- Limited to assessing adhesion; does not report on downstream signaling or internalization events following binding.
