Medición de interacciones transcelulares a través de la agregación de proteínas en un sistema celular heterologoso

El ensayo basado en células permite la observación y cuantificación de las interacciones de transadhesión sin necesidad de largas purificaciones de proteínas ni equipos especializados. Aunque las interacciones de proteínas probadas aquí son relevantes para la neurobiología, este método puede aplicarse a cualquier área de investigación en la que la adhesión de proteínas se produzca intercelularmente. 48 horas después de transfectar las células HEK-293T, recoja las células de la placa de seis pocillos para su agregación.

Primero, lave cada pocillo dos veces con PBS. A continuación, para disociar suavemente las células, agregue un mililitro de EDTA 10 milimolar a cada pocillo, luego incube la placa a 37 grados centígrados. Después de cinco minutos de incubación, golpee suavemente la placa para separar las células y coseche cada pocillo en un tubo cónico separado de 15 mililitros.

Centrifugar los tubos a 500 x g a temperatura ambiente durante cinco minutos. Mientras se granulan las células, prepare seis tubos de incubación etiquetando la parte superior de los tubos de microcentrífuga con las condiciones experimentales. Se deben utilizar todas las permutaciones de GFP y mCherry.

Retire el sobrenadante de los tubos cónicos de 15 mililitros y vuelva a suspender las células en 500 microlitros de medio. Con un hemocitómetro, cuente las células de cada tubo cónico. A continuación, alícuota 200.000 células de cada condición en el tubo de incubación adecuado para una mezcla uno a uno en un volumen total de 500 microlitros.

Después de evaluar la agregación basal descrita en la siguiente sección, coloque los tubos de incubación en un rotador lento de tubos a temperatura ambiente. Para evaluar la agregación, al inicio y de nuevo después de 60 minutos, pipetear 40 microlitros del tubo de incubación en un portaobjetos de microscopio cargado. La adquisición de la línea de base debe realizarse lo más rápido posible después de la adición de células al tubo de microcentrífuga.

Imagine el portaobjetos bajo fluorescencia en los canales verde y rojo. Para cada diapositiva, capture imágenes de tres campos de visión diferentes en un plano focal. Las células HEK-293T se transfectaron con una proteína de interés, una proteína mutada de interés o un ligando de interés y se transfectaron conjuntamente con una proteína fluorescente.

Las poblaciones celulares que expresaban la proteína de interés se mezclaron con las poblaciones celulares que expresaban el ligando de interés y se evaluó la agregación después de 60 minutos. En las superposiciones de imágenes capturadas en los canales verde y rojo, la agregación aparece como puntos amarillos. Las condiciones en las que las células no expresaban ningún ligando sináptico mostraron una agregación mínima.

Además, se exhibió una agregación mínima cuando solo una de las dos poblaciones expresaba ligandos sinápticos. No se exhibió agregación cuando las dos poblaciones de células expresaron moléculas de adhesión incompatibles. Las condiciones con moléculas de adhesión compatibles mostraron una agregación significativa después de una incubación de 60 minutos.

Sorprendentemente, la proteína mutada de interés exhibió significativamente más agregación que su contraparte de tipo salvaje, lo que sugiere que la mutación puntual mejora las capacidades de unión de las proteínas. Las mutaciones en muchas moléculas de adhesión se relacionan comúnmente con trastornos del neurodesarrollo, neuropsiquiátricos y de adicción. Con esta técnica, se pueden examinar los efectos de las mutaciones puntuales relevantes de la enfermedad en las interacciones trans.