Name: Medición de interacciones transcelulares a través de la agregación de proteínas en un sistema celular heterologoso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-22T14:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 47 s
Description: Aprende a medir interacciones transcelulares mediante agregación de proteínas en células HEK-293T usando microscopía de fluorescencia. Este método permite cuantificar adhesión proteica relevante para neurobiología.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional de Salud Mental (R00MH103531 y R01MH116901 a J.A.), una beca de capacitación predoctoral del Instituto Nacional de Medicina General (T32GM007635 a S.R.), y una Beca Lyda Hill Gilliam de Estudio Avanzado (GT11021 a S.R.). Agradecemos al Dr. Kevin Woolfrey la ayuda con el microscopio, el Dr. K Ulrich Bayer por el uso de su microscopio epifluorescente, y Thomas Südhof (Universidad de Stanford) por el plásmido LRRTM2.

1. Cultivo celular y transfección
<ol><li>Hacer medios celulares HEK con DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) complementado con glucosa de 4,5 g/L, piruvato de L-glutamina y sodio y 10% FBS. Filtro estéril.</li>
	<li>Predeterminar ligandos y receptores adecuados para el ensayo de agregación. NOTA: Neurexin3α SS4+/- y uno de sus ligandos conocidos, LRRTM2, fueron utilizados en este estudio. Ligandos y receptores de interés se expresaron a partir de CDNAs en pcDNA3.1. Se utilizó un conjunto Gibson para insertar Neurexin3α en pcDNA3.112. Neurexin3α F/R: TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGAGCTTTACCCTCCACTCTC/ GAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATATCTGCAGAATTCTTACACATAATACTCCTTGTCCTT.</li>
	<li>Prepare las células HEK293T.<ol>
<li>Cultivar células HEK293T a la confluencia en un matraz T-75.</li>
		<li>Una vez confluente, utilice 2 ml de trypsin y colóquelo en una incubadora de 37 °C durante 2 min. Agregue 6 ml de soporte HEK al matraz para volver a usar las células y transferir los 8 ml a un tubo cónico de 15 ml.</li>
		<li>Pellet a 500 x g durante 5 min y resuspend en medios celulares HEK para un total de 8 mL.</li>
		<li>Contar células y añadir 735.000 células en cada pozo de una placa de 6 pozos. Ajuste el volumen final a 2 ml para cada pozo utilizando medios de celda HEK.</li>
		<li>Colocar en incubadora de 37 °C y permitir que las células crezcan durante la noche o hasta que alcancen el 50-60% de confluencia.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfectar células HEK293T utilizando el método de fosfato de calcio13.<ol>
<li>Transfectar bien-1 con 3 μg de la proteína de interés y co-transfecto con 1 μg de proteína fluorescente (3 μg de pcDNA3.1-Neurexin3αWT SS4- y 1 μg de mCherry).</li>
		<li>Transfecto bien-2 como en el paso 1.4.1. pero con la proteína mutada de interés (pcDNA3.1-Neurexin3αA687T SS4-).</li>
		<li>Transfectar bien-3 con 3 μg del ligando de interés y co-transfecto con 1 μg de otra proteína fluorescente (3 μg de pcDNA3.1 LRRTM2 y 1 μg de GFP).</li>
		<li>Transfecto bien-4 y bien-5 para servir como controles negativos: bueno-4 con 1 μg de GFP y bien-5 con 1 μg de mCherry.</li>
		<li>Preparar otra placa (como en el paso 1.4.1-1.4.4) si requiere condiciones o controles adicionales (Neurexin3αWT/A687T SS4+). NOTA: La eficiencia de transfección se analiza 24 h después de la transfección bajo un microscopio de epifluorescencia y cuantificada como el número de células que expresan la proteína fluorescente con la que fueron transfectadas. Un enfoque más simplificado incluiría la transfección de células HEK con una codificación vectorial bicistrónica para una proteína fluorescente y el ligando de interés y es muy recomendable por encima de la co-transfección. En el caso de este estudio, las neurexinas alfa son ~4.3 kb y se observó baja intensidad de fluorescencia utilizando un sistema bicistrónico que requiere co-transfección.</li>
	</ol></li>
	<li>48 horas después de la transfección, cosechar células para la agregación.<ol>
<li>Lave cada pozo dos veces con PBS.</li>
		<li>Agregue 1 ml de EDTA de 10 mM en PBS en cada pozo para disociar suavemente las interacciones de célula a célula e incubar la placa a 37 °C durante 5 minutos. NOTA: Trypsin no se recomienda para el paso 1.5.2 debido a un posible escote proteolítico de moléculas de adhesión en estudio. Además, después de la adición de EDTA, es posible que el protocolo no se detenga hasta su finalización, ya que las celdas ahora estarán expuestas a condiciones ambientales.</li>
		<li>Toque suavemente la placa para separar las células y cosechar cada pozo en tubos cónicos separados de 15 ml.</li>
		<li>Centrífuga tubos cónicos a 500 x g y temperatura ambiente durante 5 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Mientras las células están peletizando, prepare 6 tubos de incubación etiquetando la parte superior de cada tubo de microcentrífuga con cada condición. NOTA: Cada permutación de las condiciones GFP y mCherry debe utilizarse para abarcar todas las condiciones experimentales y controles adecuados. Por ejemplo: 1. GFP/mCherry, 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3αWT SS4-—mCherry, 4. GFP/Neurexin3αA687T SS4- –mCherry, 5. Neurexin3αWT SS4-—mCherry/LRRTM2—GFP, 6. Neurexin3αA687T SS4- –mCherry/LRRTM2—GFP. Haga tubos adicionales para adaptarse a otras condiciones y controles.</li>
	<li>Retire las células sobrenadantes y resuspend en 500 μL de medios HEK con 10 mM CaCl2 y 10 mM MgCl2 calentado a 37 °C. NOTA: La adición de CaCl2 y MgCl2 permite que las moléculas de adhesión restablezcan la unión y sólo es necesaria si los socios de interacción transcelular en cuestión requieren cationes divalentes para la adhesión.</li>
	<li>Cuente las células de cada tubo cónico de 15 ml utilizando un hemociclo y aliquot 200.000 células de cada condición en el tubo apropiado desde el paso 1.6.1 para una mezcla de 1:1 en un volumen total de 500 μL. NOTA: Solo se debe tomar 5 minutos por condición para contar y alicuar cantidades.</li>
	<li>Incubar tubos a temperatura ambiente en un rotador de tubo lento.</li>
</ol>2. Adquisición de imágenes
<ol><li>Optimice los parámetros de adquisición de microscopios para muestras específicas. En este ejemplo, las imágenes se tomaron en un microscopio de campo ancho. Utilice un objetivo de aire 5x (NA: 0.15; WD: 20000 μm) para obtener un campo lo suficientemente grande para su análisis.</li>
	<li>Evalúe la agregación basal inmediatamente después de mezclar las dos condiciones de las células HEK en el paso 1.8. Estas son ahora las imágenes de "tiempo cero".<ol>
<li>Pipeta 40 μL de cada mezcla de muestra en una diapositiva de microscopio cargada e imagen bajo fluorescencia en los canales 488 y 561.</li>
		<li>Adquiera tres campos de visión diferentes en un plano de enfoque por caída de muestra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adquiere imágenes finales a 60 min como la imagen de 'time 60'.<ol>
<li>Para obtener la imagen de "tiempo 60" de la mezcla después de una incubación de 60 minutos, tome otra muestra de 40 μL de cada condición de tubos giratorios y pipeta cada muestra en una diapositiva cargada. Imagen como en el paso 2.2.2. NOTA: La agregación celular debe comprobarse cada 15 minutos hasta que se produzca la saturación. El momento de la agregación dependerá de las proteínas que se prueben.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Análisis de ImageJ/Fiji
<ol><li>Para cuantificar el alcance de la agregación mediante Fiji/ImageJ, guarde los archivos de análisis.<ol>
<li>Guarde los archivos de codificación suplementarios proporcionados en la carpeta de macros imageJ del equipo.</li>
		<li>Instale la macro de agregación proporcionada (plugins, macros, install y seleccione el archivo "AggregationAssay.txt").</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determinar umbrales.<ol>
<li>Cargue un archivo de .tif 'time zero' en imageJ y divida los canales(Image | Color | Canales divididos). NOTA: La imagen 'time zero' se utiliza para determinar el umbral y el tamaño de puncta más pequeño para todo el experimento.</li>
		<li>Enmascarar cada canal(Plugins | Macros | AggregationAssay_MakeMask). Aparecerá la ventana Crear máscara desde imagen. Marque las casillas situadas junto a Determinar umbral para la imagen y determinar parámetros de clúster a partir de histograma y haga clic en Aceptar.</li>
		<li>Determine el umbral de la imagen mediante la barra de diapositivas, registre el número a la derecha de la barra de diapositivas y haga clic en Aceptar.</li>
		<li>Aparecerá un histograma de tamaño de clúster. Seleccione un tamaño de clúster en el histograma que se adapte al experimento, escriba este número en el cuadro Tamaño mínimo del clúster: y haga clic en Aceptar. Los clústeres por debajo de este tamaño no se analizarán.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ejecute el análisis.<ol>
<li>Abra la imagen 'time 60' de la condición 1 en imageJ y divida los canales como en el paso 3.2.1.</li>
		<li>Enmascara cada canal (Plugins, Macros, AggregationAssay_MakeMask). Utilice el mismo umbral y tamaño determinados en los pasos 3.2.3 y 3.2.4. Anule la selección de los cuadros situados junto a Determinar umbral para imagen y Determinar parámetros de clúster a partir de Histograma y escriba manualmente el tamaño y los umbrales en los campos adecuados y, a continuación, haga clic en Aceptar.</li>
		<li>Calcular el índice de agregación (Plugins | Macros | AggregationAssay_CalculateOverlap). Seleccione los canales enmascarados que desea comparar y el directorio en el que se guardarán los archivos resultantes.</li>
		<li>Repita los pasos 3.3.1–3.3.3 por cada imagen de "tiempo 60" en cada condición. NOTA: El índice de agregación se define como el área de superposición total dividida por la suma de las dos áreas de canal menos el área de superposición multiplicada por 100 (Índice de agregación = área de superposición/[área del canal 1 + área del canal 2 – área de superposición] x 100). Esta normalización es una operación 'OR' entre los dos canales enmascarados que representan el total de píxeles de cualquiera de las máscaras.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroligins+and+neurexins+link+synaptic+function+to+cognitive+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease.</a> Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).</li>
<li>Lakey, J. H., Raggett, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring protein-protein interactions.</a> Current Opinion in Structural Biology. 8 (1), 119-123 (1998).</li>
<li>Aoto, J., Martinelli, D. C., Malenka, R. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+neurexin-3+alternative+splicing+trans-synaptically+controls+postsynaptic+AMPA+receptor+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Presynaptic neurexin-3 alternative splicing trans-synaptically controls postsynaptic AMPA receptor trafficking.</a> Cell. 154 (1), 75-88 (2013).</li>
<li>Aoto, J., Földy, C., Ilcus, S. M. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+circuit-dependent+functions+of+presynaptic+neurexin-3+at+GABAergic+and+glutamatergic+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Distinct circuit-dependent functions of presynaptic neurexin-3 at GABAergic and glutamatergic synapses.</a> Nature Neuroscience. 18 (7), 997-1007 (2015).</li>
<li>Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+Neurexin+Complexes%3A+A+Molecular+Code+for+the+Logic+of+Neural+Circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Synaptic Neurexin Complexes: A Molecular Code for the Logic of Neural Circuits.</a> Cell. 171 (4), 745-769 (2017).</li>
<li>Dai, J., Aoto, J., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+Splicing+of+Presynaptic+Neurexins+Differentially+Controls+Postsynaptic+NMDA+and+AMPA+Receptor+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Alternative Splicing of Presynaptic Neurexins Differentially Controls Postsynaptic NMDA and AMPA Receptor Responses.</a> Neuron. 102 (5), 993-1008 (2019).</li>
<li>Restrepo, S., Langer, N. J., Nelson, K. A., Aoto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+a+Neurexin-3%CE%B1+Human+Mutation+in+Mouse+Neurons+Identifies+a+Novel+Role+in+the+Regulation+of+Transsynaptic+Signaling+and+Neurotransmitter+Release+at+Excitatory+Synapses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modeling a Neurexin-3α Human Mutation in Mouse Neurons Identifies a Novel Role in the Regulation of Transsynaptic Signaling and Neurotransmitter Release at Excitatory Synapses.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (46), 9065-9082 (2019).</li>
<li>Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRTM2+Functions+as+a+Neurexin+Ligand+in+Promoting+Excitatory+Synapse+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).</li>
<li>de Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRTM2+Interacts+with+Neurexin1+and+Regulates+Excitatory+Synapse+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).</li>
<li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Unbiased+Expression+Screen+for+Synaptogenic+Proteins+Identifies+the+LRRTM+Protein+Family+as+Synaptic+Organizers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers.</a> Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).</li>
<li>Siddiqui, T. J., Pancaroglu, R., Kang, Y., Rooyakkers, A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRTMs+and+Neuroligins+Bind+Neurexins+with+a+Differential+Code+to+Cooperate+in+Glutamate+Synapse+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">LRRTMs and Neuroligins Bind Neurexins with a Differential Code to Cooperate in Glutamate Synapse Development.</a> Journal of Neuroscience. 30 (22), 7495-7506 (2010).</li>
<li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Bacchetti, S., Graham, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+the+gene+for+thymidine+kinase+to+thymidine+kinase-deficient+human+cells+by+purified+herpes+simplex+viral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (4), 1590-1594 (1977).</li>
<li>Cerchiari, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strategy+for+tissue+self-organization+that+is+robust+to+cellular+heterogeneity+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A strategy for tissue self-organization that is robust to cellular heterogeneity and plasticity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), 2287-2292 (2015).</li>
<li>Burdick, M. M., McCarty, O. J. T., Jadhav, S., Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+interactions+in+inflammation+and+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Magazine%22%5BJournal%5D)">Cell-cell interactions in inflammation and cancer metastasis.</a> IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 20 (3), 86-91 (2001).</li>
<li>Fox, D. A., Gizinski, A., Morgan, R., Lundy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+interactions+in+rheumatoid+arthritis+synovium%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatic+Diseases+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Cell-cell interactions in rheumatoid arthritis synovium.</a> Rheumatic Diseases Clinics of North America. 36 (2), 311-323 (2010).</li>
<li>Yamagata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+modulation+and+selectivity+of+transsynaptic+neurexin-LRRTM+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structural insights into modulation and selectivity of transsynaptic neurexin-LRRTM interaction.</a> Nature Communications. 9 (1), 3964(2018).</li>
<li>Nguyen, T., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+properties+of+neuroligin+1+and+neurexin+1beta+reveal+function+as+heterophilic+cell+adhesion+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Binding properties of neuroligin 1 and neurexin 1beta reveal function as heterophilic cell adhesion molecules.</a> The Journal of Biological Chemistry. 272 (41), 26032-26039 (1997).</li>
<li>Boucard, A. A., Ko, J., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Affinity+Neurexin+Binding+to+Cell+Adhesion+G-protein-coupled+Receptor+CIRL1%2FLatrophilin-1+Produces+an+Intercellular+Adhesion+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High Affinity Neurexin Binding to Cell Adhesion G-protein-coupled Receptor CIRL1/Latrophilin-1 Produces an Intercellular Adhesion Complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (12), 9399-9413 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La disección de las interacciones proteína-proteínas que se producen en trans durante la adhesión celular puede conducir a una mejor comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes a los procesos celulares básicos, incluyendo la formación, función y mantenimiento de sinapsis durante la maduración y remodelación. Las implicaciones de las interacciones de célula a célula se expanden más allá de la neurobiología y tienen un papel más amplio en la transducción de la señal, la migración celular y el desarrollo de tejido...

Las interacciones sinápticas facilitadas por moléculas de adhesión sináptica son fundamentales para el desarrollo, la organización, la especificación, el mantenimiento y la función de las sinapsis y la generación de redes neuronales. La identificación de estas moléculas de adhesión celular transsináptica está aumentando rápidamente; por lo tanto, es fundamental identificar socios de unión y entender cómo estas nuevas moléculas de adhesión interactúan entre sí. Además, la secuenciación del genoma ha identificado mutaciones en muchas de estas moléculas de adhesión que comúnmente están relacionadas con una multitud de trastornos neurodesarrollo, neuropsiquiátrico y de adicción1. Las mutaciones en genes que codifican para moléculas sinápticas de adhesión celular pueden alterar perjudicialmente las interacciones trans y pueden contribuir a alteraciones fisiológicas en la formación y el mantenimiento de sinapsis.
Existen múltiples ensayos para evaluar cuantitativamente las interacciones proteína-proteínas como calorimetría isotérmica, dichroismo circular, resonancia de plasmón superficial2 y aunque de naturaleza cuantitativa, tienen varias limitaciones. En primer lugar, requieren proteínas recombinantes, a veces exigiendo pasos de purificación largos y tediosos. En segundo lugar, requieren sofisticados equipos especializados y conocimientos técnicos. En tercer lugar, pueden sobreestimar el grado de unión, ya que permiten interacciones cis y trans entre proteínas que están naturalmente atadas a una membrana in vivo. Aquí proponemos un ensayo simple y relativamente rápido que prueba exclusivamente las interacciones trans.
Para eludir muchas de las complicaciones asociadas con los ensayos de proteínas purificadas, hemos optimizado un ensayo de interacción proteica basado en células que recapitula las interacciones trans en un sistema celular heterologoso reducido. Este ensayo se ha utilizado previamente en varias formas para estudiar interacciones transcelulares. En este enfoque, las moléculas de adhesión celular candidatas se transfectan en células HEK293T. En condiciones fisiológicas, las células HEK293T no exhiben autoagregación, por lo que son modelos ejemplares para este ensayo. Sin embargo, cuando se combinan poblaciones individuales de células HEK que expresan receptor y ligando, la unión del receptor y el ligando obliga a que se produzca la agregación de células HEK. Esta agregación se media exclusivamente mediante interacciones trans y suele ser observable en decenas de minutos. No se requieren pasos de purificación de proteínas en este método, y la eficiencia del método se basa en el paradigma de que las poblaciones de células HEK que expresan moléculas de adherencia de cognato se están combinando y luego se tienen imágenes sólo decenas de minutos más tarde. Además, este método es relativamente barato, ya que no se requieren anticuerpos ni equipos costosos. El único equipo necesario para la adquisición de datos es un microscopio fluorescente estándar. Una ventaja adicional a este ensayo basado en células es la capacidad de examinar rápidamente el efecto de las mutaciones puntuales relevantes de la enfermedad en las interacciones trans. Esto se puede realizar mediante la transfectación de células HEK con CDNAs de las variantes mutantes de la proteína de interés.
En este protocolo, presentamos un ejemplo en el que investigamos si una mutación de missense en Neurexin3α (Neurexin3αA687T),identificada en un paciente diagnosticado con profunda discapacidad intelectual y epilepsia, altera las interacciones en trans con la proteína transmembrana repetida rica en leucina 2 (LRRTM2). Neurexin3α es miembro de la familia evolutivamente conservada de moléculas presintáticas de adhesión celular y aunque el trabajo reciente ha identificado múltiples roles en la sinapsis3,4,5,6,7,nuestra comprensión sináptica de esta molécula y todos los miembros de la familia de la neurexina sigue incompleta. LRRTM2 es una proteína de adherencia de células postsinápticas excitatorias que participa en la formación y mantenimiento de sinapsis8,9,10. Es importante destacar que LRRTM2 interactúa exclusivamente con isoformes de neurexina que carecen del sitio de empalme 4 exones alternativos (SS4-) pero no con isoformes de neurexina que contienen el sitio de empalme 4 exones alternativos (SS4+). La mutación de missense humano (A687T) identificada en Neurexin3α se encuentra en una región extracelular no auditada que se conserva evolutivamente y se conserva entre todas las neurexinas alfa7. Como la interacción entre estas dos moléculas se ha establecido8,9,11, planteamos la pregunta: ¿la capacidad de unión de Neurexin3α SS4- a LRRTM2 alterada por una mutación de punto A687T? Este ensayo reveló que la mutación del punto A687T mejoró inesperadamente la agregación de Neurexin3α a LRRTM2, lo que sugiere que la región extracelular en la que se encuentra la mutación de puntos desempeña un papel en la mediación de las interacciones transsintápticas.

<table><tbody><tr><td>Microtubos desechables de 1,5 mL con tapones a presión</td><td>VWR</td><td>89000-028</td><td>Incubación de población mixta de células HEK</td></tr><tr><td>1000 mL Rapid&mdash; Unidad de filtro de flujo, membrana aPES de 0,2 mmm</td><td>Thermo Fisher</td><td>567-0020</td><td>Esterilización de medios HEK</td></tr><tr><td>15 mL Tubos de centrífuga SpectraTube</td><td>Ward' s Science</td><td>470224-998</td><td>Recolección de células HEK</td></tr> 6 <tr><td>placas de cultivo de tejidos estériles</td><td>VWR</td><td>100062-892</td> cultivo de <td>células HEK</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma</td><td>223506-500G</td><td>Transfección de fosfato de calcio, centrífuga de resuspensión de células HEK</td></tr><tr><td>- Sorvall Legend RT</td><td>Kendro Productos de laboratorio</td><td>75004377</td><td>Recolección de células HEK Incubadora</td></tr> <tr><td></td><td>de células de CO2Thermo Scientific</td><td>HERACELL 150i</td><td>Incubación de células HEK durante el crecimiento</td></tr><tr><td>DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) con 4,5 g/L de glucosa, L-glutamina y piruvato de sodio</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>Mantenimiento de células HEK</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato PBS (1X)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Paso/cosecha de células HEK</td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético</td><td>Sigma</td><td>ED-500G</td><td>Recolección de células HEK</td></tr><tr><td>Falcon Matraces de cultivo ventilados, 75cm2 área de crecimiento</td><td>Corning</td><td>9381M26</td><td>Cultivo de células HEK</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Sigma</td><td>17L184</td><td>Mantenimiento</td></tr> <tr>de células HEK<td>HEK293T celdas</td><td>ATCC</td><td></td><td>Sistema de modelos</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>V: 2.0.0-rc-69/1.52p</td><td>Análisis</td></tr><tr><td>de imágenes Cloruro de magnesio hexahidratado</td><td>Sigma</td><td>M9272-500G</td><td>Resuspensión celular HEK</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico anhidro</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP332-500</td><td>Transfección de fosfato de calcio Tripsina</td></tr><tr><td>0,25% (1X) Solución</td><td>GE Healthcare Life Ciencias</td><td>SH30042.01</td><td>Paso de células HEK</td></tr><tr><td>Rotador</td><td></td><td></td><td>de tubo Incubación de población mixta de células HEK</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio UltraClear. Blanco esmerilado, cargado positivo</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>M1021</td><td>Adquisición</td></tr><tr><td>de imágenes Microscopio de campo amplio</td><td>Zeiss</td><td>Axio Vert 200M</td><td>Adquisición de imágenes</td></tr></tbody></table>

medición de interacciones transcelulares a través de la agregación de proteínas en un sistema celular heterologoso

Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System

Las interacciones proteicas en las interfaces celulares dictan una multitud de resultados biológicos que van desde el desarrollo de tejidos y la progresión del cáncer hasta la formación y mantenimiento de sinapsis. Muchas de estas interacciones fundamentales ocurren en trans y suelen ser inducidas por interacciones heterofílicas u homofílicas entre células que expresan pares de unión anclados por membrana. Dilucidar cómo las mutaciones relevantes para la enfermedad interrumpen estas interacciones proteicas fundamentales puede proporcionar una visión de una miríada de campos de biología celular. Muchos ensayos de interacción proteína-proteína no suelen desambiguar entre las interacciones cis y trans, lo que potencialmente conduce a una sobreestimación del grado de unión que se está produciendo in vivo e implican la purificación intensiva de proteínas y/o equipos de monitoreo especializados. Aquí, presentamos un protocolo simple optimizado que permite la observación y cuantificación de sólo interacciones trans sin necesidad de largas purificaciones de proteínas o equipos especializados. El ensayo de agregación celular HEK implica la mezcla de dos poblaciones independientes de células HEK, cada una expresando ligandos de cognato unidos a membrana. Después de un breve período de incubación, las muestras se muestran en imágenes y se cuantifican los agregados resultantes.

La mutación A687T aumenta la unión de Neurexin3α SS4 a LRRTM27 Para investigar cómo las interacciones intercelulares de dos proteínas sinápticas conocidas se ven afectadas por la introducción de una mutación puntual encontrada en un paciente con discapacidad intelectual y epilepsia, utilizamos el ensayo de agregación celular HEK anterior (Figura 1). Las células fueron transfectadas de acuerdo con la sección 1 y preparadas para la toma de imágenes de acuerdo con...

Aquí, presentamos un protocolo optimizado para medir rápida y semicuantitativamente las interacciones ligando-receptor en trans en un sistema celular heterologoso utilizando microscopía de fluorescencia.

Medición de interacciones transcelulares a través de la agregación de proteínas en un sistema celular heterologoso

Protein interactions at cellular interfaces dictate a multitude of biological outcomes ranging from tissue development and cancer progression to synapse ...

El ensayo basado en células permite la observación y cuantificación de las interacciones de transadhesión sin necesidad de largas purificaciones de proteínas ni equipos especializados. Aunque las interacciones de proteínas probadas aquí son relevantes para la neurobiología, este método puede aplicarse a cualquier área de investigación en la que la adhesión de proteínas se produzca intercelularmente. 48 horas después de transfectar las células HEK-293T, recoja las células de la placa de seis pocillos para su agregación.Primero, lave cada pocillo dos veces con PBS. A continuación, para disociar suavemente las células, agregue un mililitro de EDTA 10 milimolar a cada pocillo, luego incube la placa a 37 grados centígrados. Después de cinco minutos de incubación, golpee suavemente la placa para separar las células y coseche cada pocillo en un tubo cónico separado de 15 mililitros.Centrifugar los tubos a 500 x g a temperatura ambiente durante cinco minutos. Mientras se granulan las células, prepare seis tubos de incubación etiquetando la parte superior de los tubos de microcentrífuga con las condiciones experimentales. Se deben utilizar todas las permutaciones de GFP y mCherry.Retire el sobrenadante de los tubos cónicos de 15 mililitros y vuelva a suspender las células en 500 microlitros de medio. Con un hemocitómetro, cuente las células de cada tubo cónico. A continuación, alícuota 200.000 células de cada condición en el tubo de incubación adecuado para una mezcla uno a uno en un volumen total de 500 microlitros.Después de evaluar la agregación basal descrita en la siguiente sección, coloque los tubos de incubación en un rotador lento de tubos a temperatura ambiente. Para evaluar la agregación, al inicio y de nuevo después de 60 minutos, pipetear 40 microlitros del tubo de incubación en un portaobjetos de microscopio cargado. La adquisición de la línea de base debe realizarse lo más rápido posible después de la adición de células al tubo de microcentrífuga.Imagine el portaobjetos bajo fluorescencia en los canales verde y rojo. Para cada diapositiva, capture imágenes de tres campos de visión diferentes en un plano focal. Las células HEK-293T se transfectaron con una proteína de interés, una proteína mutada de interés o un ligando de interés y se transfectaron conjuntamente con una proteína fluorescente.Las poblaciones celulares que expresaban la proteína de interés se mezclaron con las poblaciones celulares que expresaban el ligando de interés y se evaluó la agregación después de 60 minutos. En las superposiciones de imágenes capturadas en los canales verde y rojo, la agregación aparece como puntos amarillos. Las condiciones en las que las células no expresaban ningún ligando sináptico mostraron una agregación mínima.Además, se exhibió una agregación mínima cuando solo una de las dos poblaciones expresaba ligandos sinápticos. No se exhibió agregación cuando las dos poblaciones de células expresaron moléculas de adhesión incompatibles. Las condiciones con moléculas de adhesión compatibles mostraron una agregación significativa después de una incubación de 60 minutos.Sorprendentemente, la proteína mutada de interés exhibió significativamente más agregación que su contraparte de tipo salvaje, lo que sugiere que la mutación puntual mejora las capacidades de unión de las proteínas. Las mutaciones en muchas moléculas de adhesión se relacionan comúnmente con trastornos del neurodesarrollo, neuropsiquiátricos y de adicción. Con esta técnica, se pueden examinar los efectos de las mutaciones puntuales relevantes de la enfermedad en las interacciones trans.

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Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

En este video, demostramos un ensayo de agregación de proteínas basado en células utilizando inhibidores del proteasoma, que bloquean la actividad del proteasoma, evitando que las proteínas mutantes mal plegadas, fusionadas a una etiqueta fluorescente, sufran una degradación proteasómica dependiente de ubiquitina, lo que lleva a su acumulación dentro del citoplasma celular. A continuación, los agregados de proteínas se visualizan y cuantifican mediante microscopía de fluorescencia.

Ensayo de formación de agregados de proteínas: un método para detectar y cuantificar la agregación de proteínas en células cultivadas tras la inducción por inhibidor del proteasoma

En este video, demostramos la técnica para medir las interacciones transcelulares entre las moléculas de adhesión de células sinápticas a través del ensayo de agregación celular HEK. En este ensayo, un número igual de células HEK que expresan una molécula de adhesión celular presináptica deseada y una proteína fluorescente se mezclan con células HEK que expresan una molécula de adhesión celular postsináptica y otra proteína fluorescente. La interacción entre las moléculas de adhesión celular...

Ensayo de agregación celular para detectar interacciones trans entre moléculas de adhesión celular

En este video, demostramos la técnica de espectroscopia de resonancia magnética nuclear en célula para estudiar las interacciones proteína-ligando entre proteínas sobreexpresadas no marcadas y moléculas pequeñas. El éxito de la interacción ligando-proteína se confirma visualmente por la aparición de un conjunto adicional de picos en la región espectral de interés que sustituye gradualmente a los picos originales.

Espectroscopía cuantitativa de RMN de hidrógeno en célula para monitorizar las interacciones proteína-ligando

La viabilidad celular depende de una gestión oportuna y eficiente de mal plegamiento de proteínas. Aquí se describe un método para visualizar los diferentes destinos posibles de una proteína mal plegada: replegamiento, la degradación, o el secuestro de inclusiones. Se demuestra el uso de un sensor de plegado,...

4D de imágenes de la agregación de proteínas en células vivas

Aquí presentamos un método simple y rápido para caracterizar las propiedades adhesivas intrínsecas de las moléculas de adhesión celular putativas.  El ectodominio secretado y marcado con epítopos de una molécula de adhesión celular se captura del medio de cultivo en perlas funcionalizadas pequeñas y uniformes.  Estas perlas se pueden utilizar inmediatamente en ensayos simples de agregación de perlas.

Grano de agregación Los ensayos para la caracterización de Putativos Moléculas de Adhesión Celular

La oligomerización del receptor de rianodina, un canal iónico homotetrámero que media la liberación de Ca2+ de las reservas intracelulares, es fundamental para la contracción del músculo esquelético y cardíaco. Aquí, presentamos métodos complementarios in vivo e in vitro para detectar la autoasociación de proteínas y determinar la estequiometría de homooligómeros.

Los enfoques genéticos y bioquímicos para<em&gt; En Vivo</em&gt; y<em&gt; In Vitro</em&gt; Evaluación de la oligomerización de proteínas el receptor de rianodina Estudio de caso

Este protocolo describe un enfoque basado en la espectroscopia de la fluorescencia fluctuación para investigar las interacciones entre las proteínas median las interacciones célula-célula, es decir, proteínas localizadas en las ensambladuras de la célula, directamente en las células vivas. Ofrecemos directrices detalladas sobre la calibración del instrumento, adquisición de datos y análisis, incluyendo las correcciones a las fuentes de posible artefacto.

Un análisis de espectroscopia de fluorescencia fluctuación de interacciones de proteínas en los contactos célula-célula

Las proteínas de dominio J de Cognate cooperan con el acompañante Hsp70 para ayudar en una miríada de procesos biológicos que van desde el plegado de proteínas hasta la degradación. Aquí, describimos un ensayo de ligadura de proximidad in situ, que permite el seguimiento de estas máquinas de chaperone formadas transitoriamente en células bacterianas, levaduras y humanas.

Monitoreo in situ de conjuntos de chaperona molecular formadas transitoriamente en bacterias, levaduras y células humanas

Aquí, se presenta un método para el análisis de la cinética de agregación de proteínas en el nematodo Caenorhabditis elegans. Los animales de una población sincronizada por edad se visualizan en diferentes puntos de tiempo, seguidos de un recuento de inclusión semiautomatizado en CellProfiler y se ajustan a un modelo matemático en AmyloFit.

Monitoreo de la cinética de agregación de proteínas in vivo mediante el conteo automatizado de inclusión en Caenorhabditis elegans

Aquí, describimos un método para la coexpresión bacteriana de proteínas marcadas diferencialmente utilizando un conjunto de vectores compatibles, seguido de las técnicas convencionales de pulldown para estudiar complejos de proteínas que no pueden ensamblarse in vitro.

Ensayo pulldown junto con coexpresión en células bacterianas como una herramienta eficiente en el tiempo para probar interacciones desafiantes proteína-proteína

Se ha demostrado que muchas proteínas intrínsecamente desordenadas participan en la formación de condensados biomoleculares altamente dinámicos, un comportamiento importante para numerosos procesos celulares. Aquí, presentamos un método basado en imágenes de una sola molécula para cuantificar la dinámica por la cual las proteínas interactúan entre sí en condensados biomoleculares en células vivas.

Medición de una sola molécula de la dinámica de interacción de proteínas dentro de condensados biomoleculares

Aprende a medir interacciones transcelulares mediante agregación de proteínas en células HEK-293T usando microscopía de fluorescencia. Este método permite cuantificar adhesión proteica relevante para neurobiología.

Medición de interacciones transcelulares a través de la agregación de proteínas en un sistema celular heterologoso

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