Un sistema celular de triple cultivo que modela la barrera hematoencefálica humana

La administración de fármacos al cerebro siguió siendo un desafío. El desarrollo de grandes paneles de nuevos nanomateriales para mejorar la entrega al cerebro destaca la necesidad de un microsistema in vitro real para predecir la penetración cerebral en el marco de ensayos preclínicos. La principal ventaja de esta técnica es congelar los datos celulares libres de dolor de la barrera hematoencefálica dentro del mismo sistema, lo que permite las comunicaciones celulares necesarias para la inducción del fenotipo de la barrera hematoencefálica.

Además, cada tipo de célula se puede aislar por separado para un análisis molecular posterior. El modelo se puede utilizar para una amplia gama de experimentos en condiciones saludables y patológicas y representa una herramienta valiosa para las evaluaciones preclínicas de los transportes de moléculas y partículas, así como el tráfico inter e intracelular. Clemence Deligne y Eleonora Rizzi.

Comience codificando los pocillos con 500 microlitros de dos microgramos por centímetro cuadrado de solución de poli-L-lisina. Incubar durante la noche o durante un mínimo de una hora a 37 grados centígrados y retirar la solución de poli-L-lisina con cuidado con una pipeta de vidrio conectada a un sistema de aspiración. Luego enjuague dos veces con agua estéril.

Para recolectar los astrocitos, primero lave los astrocitos una vez con 10 mililitros de 1X PBS CMF tibio. Incubarlos durante tres minutos con 10 mililitros de solución tibia de tripsina EDTA al 20% a 37 grados centígrados bajo 5% de dióxido de carbono y 21% de oxígeno. Separar mecánicamente las células del matraz y transferir la suspensión a un tubo cónico que contenga cinco mililitros de FCS no diluido caliente.

Centrifugar la suspensión a 190 veces G durante cinco minutos a 20 grados centígrados. Vuelva a suspender el pellet celular en cinco mililitros de medio de astrocito caliente, luego diluya 20 microlitros de la suspensión celular con 80 microlitros de 1X PBS CMF. Cuente las células usando una cámara de conteo manual bajo un microscopio.

Placa alrededor de 40, 000 células por centímetro cuadrado en cada Poly-L-Lisina precodificada bien en un volumen de 1.5 mililitros de medio de astrocito caliente. Coloque los filtros de inserción invertidos en la periferia de un plato cubierto de 25 milímetros de altura y agregue 250 microlitros de solución de colágeno tipo uno a los filtros de inserto. Incubar a temperatura ambiente durante una hora.

Luego, retire con cuidado la solución de colágeno tipo uno con una pipeta de vidrio conectada a un sistema de aspiración. Lave dos veces con 250 microlitros de DMEM de glucosa alta a temperatura ambiente y retire cuidadosamente toda la solución de los filtros de inserto. Lave los pericitos dos veces con 10 mililitros de 1X PBS CMF tibio e incube las células con dos mililitros de tripsina tibia.

Observe las células bajo el microscopio para controlar la acción de la tripsina. Cuando las células comiencen a desprenderse, retire la tripsina, luego agregue cinco mililitros de medio basal de células endoteliales calientes o ECM a las células y comience la disociación mecánica. Diluir 20 microlitros de la suspensión celular con 80 microlitros de 1X PBS CMF, y contar las células usando una cámara de conteo manual bajo un microscopio como se mostró anteriormente.

Semilla 44, 500 células por centímetro cuadrado en los filtros de inserción revertidos precodificados en un volumen de 250 microlitros. Mantenga los filtros de inserción en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados durante tres horas bajo 5% de dióxido de carbono y 21% de oxígeno. Use pinzas estériles para revertir cuidadosamente los filtros de inserción en una placa de 12 pocillos que contenga 1.5 mililitros de ECM caliente por pocillo.

Los filtros de inserción ahora están listos para ser recubiertos en el otro lado. Recubra la parte superior y los filtros de inserción con 500 microlitros de hidrogel a base de matriz extracelular. Coloque los filtros de inserción en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados bajo 5% de dióxido de carbono y 21% de oxígeno durante una hora.

Lávelos una vez con 500 microlitros de DMEM glucosa alta a temperatura ambiente. Lave el cultivo de células endoteliales una vez con 10 mililitros de 1X PBS CMF caliente e incube las células con dos mililitros de tripsina tibia. Retire la tripsina cuando las células comiencen a desprenderse, luego agregue cinco mililitros de ECM caliente y comience la disociación mecánica.

Diluir 20 microlitros de la suspensión celular con 80 microlitros de 1X PBS CMF y contar las células usando una cámara de conteo manual. Semilla las células endoteliales a una densidad de 71, 500 células por centímetro cuadrado en los filtros de inserción precodificados en un volumen de 500 microlitros de ECM caliente. Reemplace el medio de astrocito con 1.5 mililitros de ECM caliente por pocillo.

Luego transfiera los filtros de inserción sembrados a los pocillos que contienen los astrocitos. Coloque los sistemas celulares de tricultivo en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados bajo 5% de dióxido de carbono y 21% de oxígeno. Retire el medio con cuidado del compartimento superior e inferior con una pipeta de vidrio conectada con un sistema de aspiración.

Reemplace el medio con ECM caliente en un volumen de 500 microlitros en el compartimiento superior y 1.5 mililitros en el compartimiento inferior. Renueve el medio cada dos días hasta el día seis repitiendo el mismo procedimiento. Finalmente, vuelva a colocar las células en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados bajo 5% de dióxido de carbono y 21% de oxígeno.

Los datos de inmunocitoquímica confirmaron la expresión de marcadores convencionales como el receptor beta del factor de crecimiento derivado de plaquetas y Desmine para los pericitos, y la proteína ácida fibrilar glial para los astrocitos. Por lo tanto, después de seis días de cultivo con los pericitos y astrocitos, la monocapa de células endoteliales similares al cerebro o BLECs visualizadas con la tinción de unión adherente de Ve-Cadherin muestra una localización continua de las proteínas TJ CLD5 y Z-01 en los bordes celulares. Aquí se muestra la permeabilidad paracelular de BLECS a marcadores fluorescentes de integridad BBB, fluoresceína de sodio y dextrano FIFC.

La acumulación intracelular de R123 en BLECs mostró un aumento significativo en la presencia del inhibidor de la bomba de eflujo Elacridar en comparación con la condición de control con su ausencia. Esto indica la presencia de moléculas activas de la bomba de eflujo a saber, glicoproteína P y proteína de resistencia al cáncer de mama o BCRP en los BLEC. Aquí se muestra la expresión génica de proteínas de unión estrecha, transportadores y receptores de moléculas grandes normalizados por la expresión de RPLP0.

Aquí, los valores mayores que uno corresponden a una mayor expresión génica en el modelo de triple cultivo. La línea roja corresponde a un valor de uno donde el nivel de expresión de los dos modelos es equivalente. La imagen representativa muestra el nivel proteico de proteínas de unión estrecha, transportadores, en receptores de moléculas grandes normalizados por la expresión de beta actina.

Se evaluó el transporte de nanogeles poliméricos neutros basados en NIPAM marcados con fluorescencia. En el tiempo cero, los nanogeles poliméricos se colocaron en el compartimiento luminal a una concentración de 0,1 miligramos por mililitro. Después de 24 horas de incubación, el 5,82% de los nanogeles poliméricos se encontraron en el compartimiento abluminal demostrando su capacidad para cruzar los BLC.

El recubrimiento correcto y la siembra de los pericitos en el filtro revertido es fundamental. Importante es el mantenimiento de la esterilidad e integridad de las estructuras para evitar la contaminación del sistema de cultivo celular.