Name: Combina la sincronización celular mitótica y microscopia Confocal de alta resolución para estudiar el papel de las proteínas multifuncional ciclo celular durante la Mitosis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Aprende a sincronizar células HeLa con doble timidina y analizarlas mediante microscopía confocal de alta resolución. Este método permite estudiar los roles mitóticos de proteínas multifuncionales que también actúan durante la interfase.

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Agradecemos al Dr. Kozo Tanaka de la Universidad de Tohoku, Japón para el intercambio de células HeLa expresando estable mCherry histona H2B y GFP-α-tubulina. Este trabajo fue financiado por una subvención NCI a DV (R00CA178188) y por fondos de puesta en marcha de la Universidad de Northwestern.

1. doble bloque de timidina y liberación: preparaciones de reactivos
<ol><li>Tomar 500 mL que Dulbecco modificado Eagle medium (DMEM) suplementado con 10% FBS, penicilina y estreptomicina.</li>
	<li>Hacer caldo de 100 mM de timidina en agua estéril y conservar en alícuotas a-80 ° C.</li>
</ol>2. Protocolo para la proyección de imagen de celular fijo de progresión mitótica (figura 1A)
<ol><li>El día 1, semilla ~ 2 x 105 células de HeLa en los pocillos de una placa de 6 pozos con un cubreobjetos (esterilizado con etanol al 70% y la radiación ultravioleta) y 2 mL de medio DMEM. Crecen las células en una incubadora humidificada durante 24 h a 37 ° C y 5% CO2.</li>
	<li>a 1 cuadra de timidinast : en el día 2, mezclar bien el volumen requerido de timidina en el medio DMEM fresco (concentración de 2 mM stock, final de 100 m m).</li>
	<li>Añadir 2 mL de timidina contiene medios a las células en cada pozo del pozo 6 de la placa e incubar durante 18 h.</li>
	<li>El día 3, el medio de aspirar y lavar las células dos veces con 2 mL de 1 x PBS y una vez con DMEM precalentado fresco; crecen las células en medio DMEM precalentado fresco de 9 h liberar células del bloque.</li>
	<li>2 bloque de timidinand : otra vez, añadir 2 mL de timidina contiene medios (concentración final de 2 mM) a las células en cada pocillo de la placa de la pozo 6.</li>
	<li>Incubar durante 18 h otro.</li>
	<li>El día 4, el medio de aspirar y lavar las células dos veces con 2 mL de 1 x PBS y una vez con DMEM fresco de precalentado.</li>
	<li>SiRNAs diluidos (control y Cdt1) y el reactivo de transfección en medio de cultivo libre de suero por separado durante 10 minutos mezclan juntos e incuban por 20 min a TA. La concentración final de siRNA en cada transfección fue 100 nM. Añadir la mezcla de reacción a las células que han sido lavadas de timidina.</li>
	<li>Incube las células a 37 ° C durante 9-10 h para liberar del bloqueo y fijar las células en el cubreobjetos con el 4% PFA por 20 min a TA. PRECAUCIÓN: El PFA es tóxico, usar protección adecuada.</li>
	<li>
Immunostain células, después permeabilizing con detergente de 0,5% (v/v) durante 10 min a temperatura ambiente y lavado las células dos veces con PBS 1 x durante 5 minutos.
	<ol>
<li>Bloque de celdas con 1% BSA (w/v) de 1 x PBS para 1 h a temperatura ambiente, seguido por el tratamiento de células con 50 μl de anticuerpos primarios (anticuerpo de ratón anti-α-tubulina diluido 1:1, 000, anticuerpos anti-Zwint1 diluido al 1: 400 y mouse anti-phospho-ɣ H2AX diluido en 1:300) en el 1% (p/v) BSA en PBS 1 x por 1 h a 37 oC.</li>
		<li>Después de lavar las células con 1 x PBS tres veces, tratar las células con 50 μl de anticuerpos secundarios para cada cubierta de vidrio (Alexa 488 y rojo rodamina en diluciones de 1: 250 en el 1% (p/v) BSA en 1 PBS de x) por 1 h a TA.</li>
		<li>Después de lavar las células con PBS 1 x dos veces por 5 minutos cada uno, tratar las células con DAPI (0.1µg / mL en PBS 1 x) por 5 min a TA.</li>
		<li>Después de lavar las células con PBS 1 x dos veces por 5 minutos cada uno, colocar el cubreobjetos frente a las células a los medios de montaje apropiados en un portaobjetos microscópico claro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Imagen de las células de las proteínas immunostained con 60 X o con objetivo de inmersión de aceite de 100 X 1.4 NA Plan apocromática DIC montadas en un microscopio confocal invertido de alta resolución equipado con una cámara apropiada según sea necesario para la calidad de las imágenes necesarias.</li>
	<li>Adquisición de imágenes a temperatura ambiente como z-pilas de 0.2 μm de espesor utilizando el software apropiado para el microscopio.</li>
</ol>3. Protocolo para la proyección de imagen de células vivas de progresión mitótica (Figura 3A)
<ol><li>El día 1, aproximadamente 0.5-1 x 105 células de HeLa expresando estable mCherry H2B y GFP-α-tubulina (ligeramente variable basada en el tipo de la célula y las proteínas que expresan) en platos de fondo de cristal de 35 mm con 1,5 mL de medio DMEM de semillas y cultivarlas en un humidificado incubadora para 24 h a 37 oC y 5% CO2.</li>
	<li>a 1 cuadra de timidinast : en el día 2, agregar 1,5 mL de timidina contiene los medios de comunicación a las células en el plato (timidina 100 mM, concentración final de 2 mM,).</li>
	<li>Incubar durante 18 h.</li>
	<li>El día 3, Aspire el medio que contenía timidina y lavar tres veces, las células dos veces con 2 mL de PBS 1 x y una vez con DMEM fresco de precalentado.</li>
	<li>SiRNAs diluidos (control y Hec1) reactivo de transfección con medio de cultivo libre de suero por separado durante 10 minutos mezclar juntos e incubar por 20 min a TA. La concentración final de siRNA en cada transfección fue 100 nM. Añadir la mezcla de reacción a las células que han sido lavadas de timidina.</li>
	<li>Cultivar células en 1,5 mL de medio DMEM precalentado fresco de 8 h liberar células del bloque.</li>
	<li>2 bloque de timidinand : Añadir 1,5 mL de contiene timidina media (concentración final de 2 mM) a las células en el plato.</li>
	<li>Incubar durante 18 h otro.</li>
	<li>El día 4, Aspire el medio y lavar tres veces, las células dos veces con 2 mL de PBS 1 x y una vez con DMEM fresco de precalentado. Luego crecen las células en fresco precalentado Leibovitz de medio (L-15) suplementado con 10% FBS y 20 mM HEPES pH 7.0 durante 8 h para liberar células del bloque.</li>
	<li>Coloque el plato en la cámara de control de temperatura en el microscopio confocal de alta resolución que ya ha conectado al menos 30 minutos antes de comenzar la proyección de imagen para estabilizar las temperaturas experimentales y escenario.</li>
	<li>Enfoque en campo brillante con el objetivo x 60 hasta que las células son visibles, luego tamizar manualmente el escenario a la región de elección.</li>
	<li>Configurar la luz y energía láser, exposición, parámetros de adquisición de imagen y duración del experimento usando el software de adquisición de imagen de microscopio de elección. Utilice filtros para GFP (excitación 488; 385 emisión nm) y mCherry (561 excitación nm y 385 nm emisión) para adquirir imágenes.</li>
	<li>Realizar el experimento de Time-lapse por separado adquiriendo pulsada luz transmitida y fluorescencia imágenes cada 10 minutos durante un período hasta 16 h.</li>
	<li>Adquisición de imágenes como doce 1.0 μm separado z aviones a las 9 h después de la liberación del bloque doble timidina utilizando software apropiado al microscopio.</li>
	<li>Analizar las imágenes de progresión mitótica las células individuales de seguimiento y finalmente montar la película correspondiente con el software ImageJ/Fiji.</li>
</ol>

<ol><li>Lajtha, L. G., Oliver, R., Berry, R., Noyes, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+radiation+effect+on+the+process+of+synthesis+of+deoxyribonucleic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of radiation effect on the process of synthesis of deoxyribonucleic acid.</a> Nature. 182 (4652), 1788-1790 (1958).</li>
<li>Puck, T. T., Steffen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+Cycle+Analysis+of+Mammalian+Cells.+I.+A+Method+for+Localizing+Metabolic+Events+within+the+Life+Cycle%2C+and+Its+Application+to+the+Action+of+Colcemide+and+Sublethal+Doses+of+X-Irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Life Cycle Analysis of Mammalian Cells. I. A Method for Localizing Metabolic Events within the Life Cycle, and Its Application to the Action of Colcemide and Sublethal Doses of X-Irradiation.</a> Biophys. J. 3, 379-392 (1963).</li>
<li>Santaguida, S., Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+and+miracles+of+kinetochores%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The life and miracles of kinetochores.</a> EMBO J. 28 (17), 2511-2531 (2009).</li>
<li>Musacchio, A., Desai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Molecular+View+of+Kinetochore+Assembly+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">A Molecular View of Kinetochore Assembly and Function.</a> Biology (Basel). 6 (1), E5(2017).</li>
<li>Chaudhry, M. A., Chodosh, L. A., McKenna, W. G., Muschel, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+HeLa+cells+in+G1+or+G2+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of HeLa cells in G1 or G2 phases.</a> Oncogene. 21 (12), 1934-1942 (2002).</li>
<li>Zhou, J. Y., Ma, W. L., Liang, S., Zeng, Y., Shi, R., Yu, H. L., Xiao, W. W., Zheng, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+microRNA+expression+profiles+during+the+cell+cycle+in+synchronized+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">Analysis of microRNA expression profiles during the cell cycle in synchronized HeLa cells.</a> BMB Rep. 42 (9), 593-598 (2009).</li>
<li>Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+translational+landscape+of+the+mammalian+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The translational landscape of the mammalian cell cycle.</a> Mol. Cell. 52 (4), 574-582 (2013).</li>
<li>Chen, X., Simon, E. S., Xiang, Y., Kachman, M., Andrews, P. C., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+analysis+of+cell+cycle-regulated+Golgi+disassembly+and+reassembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics analysis of cell cycle-regulated Golgi disassembly and reassembly.</a> J. Biol. Chem. 285 (10), 7197-7207 (2010).</li>
<li>Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merging+high-quality+biochemical+fractionation+with+a+refined+flow+cytometry+approach+to+monitor+nucleocytoplasmic+protein+expression+throughout+the+unperturbed+mammalian+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle.</a> Nature Protocols. 8 (3), 602-626 (2013).</li>
<li>Coquelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+non-synchronized+cells+in+the+G1%2C+S+and+G2+phases+of+the+cell+cycle+for+the+study+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Enrichment of non-synchronized cells in the G1, S and G2 phases of the cell cycle for the study of apoptosis.</a> Biochem. Pharmacol. 72 (11), 1396-1404 (2006).</li>
<li>Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Synchronization procedures.</a> Methods Enzymol. 351, 457-467 (2002).</li>
<li>Cooper, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rethinking+synchronization+of+mammalian+cells+for+cell+cycle+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Rethinking synchronization of mammalian cells for cell cycle analysis.</a> Cell Mol. Life Sci. 60 (6), 1099-1106 (2003).</li>
<li>Whitfield, M. L., Sherlock, G., Saldanha, A. J., Murray, J. I., Ball, C. A., Alexander, K. E., Matese, J. C., Perou, C. M., Hurt, M. M., Brown, P. O., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+periodically+expressed+in+the+human+cell+cycle+and+their+expression+in+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (6), 1977-2000 (2002).</li>
<li>Vassilev, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+small-molecule+inhibitor+reveals+critical+mitotic+functions+of+human+CDK1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10660-10665 (2006).</li>
<li>Varma, D., Chandrasekaran, S., Sundin, L. J., Reidy, K. T., Wan, X., Chasse, D. A., Nevis, K. R., DeLuca, J. G., Salmon, E. D., Cook, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+the+human+Cdt1+replication+licensing+protein+by+the+loop+domain+of+Hec1+is+required+for+stable+kinetochore-microtubule+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Recruitment of the human Cdt1 replication licensing protein by the loop domain of Hec1 is required for stable kinetochore-microtubule attachment.</a> Nat. Cell Biol. 14 (6), 593-603 (2012).</li>
<li>Garcia, M., Westley, B., Rochefort, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Bromodeoxyuridine+specifically+inhibits+the+synthesis+of+estrogen-induced+proteins+in+MCF7+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">5-Bromodeoxyuridine specifically inhibits the synthesis of estrogen-induced proteins in MCF7 cells.</a> Eur. J. Biochem. 116 (2), 297-301 (1981).</li>
<li>Bostock, C. J., Prescott, D. M., Kirkpatrick, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+the+double+thymidine+block+for+synchronizing+mammalian+cells+at+the+G1-S+border%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">An evaluation of the double thymidine block for synchronizing mammalian cells at the G1-S border.</a> Exp. Cell Res. 68 (1), 163-168 (1971).</li>
<li>Martin-Lluesma, S., Stucke, V. M., Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Hec1+in+spindle+checkpoint+signaling+and+kinetochore+recruitment+of+Mad1%2FMad2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of Hec1 in spindle checkpoint signaling and kinetochore recruitment of Mad1/Mad2.</a> Science. 297, 2267-2270 (2002).</li>
<li>Brouwers, N., Mallol Martinez, N., Vernos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Kif15+and+its+novel+mitotic+partner+KBP+in+K-fiber+dynamics+and+chromosome+alignment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Role of Kif15 and its novel mitotic partner KBP in K-fiber dynamics and chromosome alignment.</a> PLoS One. 12 (4), e0174819(2017).</li>
<li>Dou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+localization+of+Mps1+kinase+to+kinetochores+is+essential+for+accurate+spindle+microtubule+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dynamic localization of Mps1 kinase to kinetochores is essential for accurate spindle microtubule attachment.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), E4546-E4555 (2015).</li>
<li>Chan, Y. W., Jeyaprakash, A. A., Nigg, E. A., Santamaria, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+B+controls+kinetochore-microtubule+attachments+by+inhibiting+Ska+complex-KMN+network+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Aurora B controls kinetochore-microtubule attachments by inhibiting Ska complex-KMN network interaction.</a> J Cell Biol. 196 (5), 563-571 (2012).</li>
</ol>

Los autores declaran que ellos no tienen ningún interés financiero competencia.

La ventaja más importante de la sincronización doble de la timidina es que proporciona un tamaño de muestra mayor de células mitóticas en una ventana de tiempo corto con muchas de estas células en mitosis al unísono, así también, lo que permite el análisis de la alineación del cromosoma, bipolar eje formación y segregación cromosómica con eficiencia mucho más alta.
Muchos complejos de la proteína reguladora y vías de señalización están dedicadas a asegurar una progresión normal a través de la ...

En el ciclo celular, las células se someten a una serie de eventos altamente reguladas y controladas temporal para la exacta duplicación de su genoma y su proliferación. En los mamíferos, el ciclo celular consta de interfase y fase M. En la interfase, que consta de tres etapas: G1, S, y G2, la célula duplica su genoma y experimenta un crecimiento que es necesario para el ciclo normal de la célula progresión1,2. En la fase de M, que consta de mitosis (profase, Prometafase, metafase, anafase y telofase) y citocinesis, una célula parental produce dos células hijas genéticamente idénticas. En la mitosis, la hermana chromatids del genoma duplicado son condensado (profase) y son capturadas en sus cinetocoros por microtúbulos del huso mitótico ensamblado (Prometafase), que impulsa su alineación en la placa de la metafase (metafase) seguida por su igual segregación cuando hermana cromátides se divide hacia y transportados en el eje opuesto postes (anafase). Las dos células hijas se separan físicamente por la actividad de un anillo contráctil de actina-basado (telofase y citocinesis). El cinetocoro es una estructura proteica especializada que reúne en la región centromérica de cromátides hermanas y servir como sitios de fijación para los microtúbulos del huso. Su función principal es la captura de cromosoma, alineación, y ayuda en la corrección de accesorio de microtúbulos del huso indebido, al mediar el puesto de control de ensamblaje del huso para mantener la fidelidad de cromosoma segregación3,4.
La técnica de sincronización celular sirve como una herramienta ideal para la comprensión de los eventos moleculares y estructurales implicados en la progresión del ciclo celular. Este enfoque se ha utilizado para enriquecer poblaciones de células en fases específicas de diversos tipos de análisis, incluyendo perfiles de expresión génica, análisis de los procesos bioquímicos celulares y la detección de la localización subcelular de las proteínas. Las células mamíferas sincronizadas pueden utilizarse no sólo para el estudio de productos de genes individuales, sino también de enfoques de análisis de genomas enteros, incluyendo análisis de microarray del gene expresión5, de patrones de expresión de miRNA6, regulación traduccional7y análisis proteómico de proteína modificaciones8. Sincronización puede utilizarse también para estudiar los efectos de genes o proteínas precipitación o knock-out, o de productos químicos en la progresión del ciclo celular.
Las células se pueden sincronizar en las diferentes etapas del ciclo celular. Métodos físicos y químicos son ampliamente utilizados para la sincronización celular. Los criterios más importantes para la sincronización de la célula son que la sincronización debe ser fotoefecto y reversible. Debido a las potenciales consecuencias adversas celulares de la sincronización de las células por agentes farmacológicos, métodos de química dependiente pueden ser ventajosos para el estudio de eventos del ciclo celular clave. Por ejemplo, hidroxiurea, amphidicolin, mimosina y lovastatina, pueden utilizarse para la sincronización de la célula en fase G1/S, pero, debido a su efecto sobre las vías bioquímicas que inhibir, activar mecanismos de control del ciclo celular y matar a un importante fracción de las células9,10. Por otra parte, inhibición de la regeneración de la replicación del ADN mediante la adición de timidina a los medios de crecimiento, conocidos como "bloque de timidina", puede detener el ciclo celular en ciertos puntos11,12,13. Las células también pueden sincronizarse en fase G2/M por tratar con nocodazole y RO-33069,14. Nocodazole, que previene el montaje del microtubule, tiene una relativamente alta citotoxicidad. Por otra parte, las células nocodazole detenido puedan volver a interfase precozmente por deslizamiento mitotic. Doble timidina bloque detención en fase G1/S y después de la liberación del bloque, las células se encuentran células actuar sincrónicamente a través de G2 y mitosis. La progresión normal del ciclo celular de células de bloque de timidina puede observarse bajo microscopia confocal de alta resolución por fijación de la célula o en proyección de imagen. El efecto de la perturbación de las proteínas mitotic puede estudiarse específicamente cuando las células entraran y proceden a través de mitosis después del lanzamiento del bloque doble de timidina. Cdt1, una proteína multifuncional, está involucrado en licencias de origen de replicación de ADN en la fase G1 y se necesita para archivos adjuntos de microtúbulos cinetocoros durante mitosis15. Para estudiar la función de Cdt1 durante la mitosis, es necesario adoptar un método que evita el efecto de su agotamiento en licencias de replicación durante la fase G1, mientras que al mismo tiempo efectuar su agotamiento específicamente durante la fase G2/M solamente. Aquí, presentamos protocolos detallados basados en el bloque de timidina doble para estudiar la función mitótica de proteínas múltiples funciones durante las diferentes etapas del ciclo celular por proyección de imagen fija y células vivas.

<table><tbody><tr><td>DMEM (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>Tienda en 4 &deg; C</td></tr><tr><td>DPBS (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td>Tienda en 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Leibovitz' s (1x) L-15 medium</td><td>Life Technologies</td><td>21083-027</td><td>Tienda a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Medio reducido de suero (Opti-MEM)</td><td>Life Technologies</td><td>319-85-070</td><td>Tienda a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Penicilina y estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063 (Pen Strep)</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>dilución Dharmafect2</td><td>GE Dharmacon</td><td>T-2002-02</td><td>Tienda en 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>MP Biomedicals LLC</td><td>103056</td><td>Disuelto en agua destilada estéril</td></tr><tr><td>Cdt1 siRNA</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Ref 10</td></tr><tr><td>Hec1 siRNA</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Ref 13</td></tr><tr><td>Células HeLa que expresan GFP-H2B</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Células HeLa que expresan GFP-&alfa;-tubulina y mCherry H2B</td><td>Generoso regalo del Dr. Kozo Tanaka de Tohoku universidad, Japón</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución de formaldehído</td><td>Sigma-Aldrich Corporation</td><td>F8775</td><td>Tóxico, necesita precaución</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich Corporation</td><td>D9542</td><td>Tóxico, necesita precaución</td></tr><tr><td>Anti-&alfa;-tubulina para ratones</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc32293</td><td>dilución 1:1.000</td></tr><tr><td>Conejo ant-Zwint1</td><td>Bethyl</td><td>A300-781A</td><td>dilución 1:400</td></tr><tr><td>Antifosfo-y gamma para ratones; H2AX (Ser139)</td><td>Upstate Biotechnology</td><td>05-626, clon JBW301</td><td>dilución 1:300</td></tr><tr><td>Alexa 488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td></td><td>1:250</td></tr><tr><td>dilución Rodamine Red-X</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td></td><td>1:250 dilución</td></tr><tr><td>BioLite Multiplato de 6 pocillos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130184</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Plato con fondo de vidrio</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35GCOL-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido Nikon Eclipse TiE</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disco giratorio para cámara confocal</td><td>Yokagawa</td><td>CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>Ultra 888 EM-CCD</td><td>Andor</td><td>iXon Ultra EMCCD</td><td></td></tr> láser de <tr><td>4 longitudes de onda</td><td>Agilent</td> Technologies <td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de incubación para microscopios</td><td>Tokai Hit</td><td>TIZB</td><td></td></tr><tr><td>Software NIS-elements</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

combina la sincronización celular mitótica y microscopia confocal de alta resolución para estudiar el papel de las proteínas multifuncional ciclo celular durante la mitosis

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Estudio de los distintos eventos de regulación del ciclo celular en una forma dependiente de la fase proporciona una comprensión clara acerca de la división y crecimiento celular. La sincronización de poblaciones celulares en etapas específicas del ciclo celular ha resultado para ser muy útil en tales esfuerzos experimentales. Sincronización de las células por tratamiento con sustancias químicas que son relativamente menos tóxicos puede ser ventajoso sobre el uso de medicamentos inhibidores farmacológicos para el estudio de los eventos del ciclo celular consecuente y obtener enriquecimiento específico de las fases mitóticas. Aquí, describimos el protocolo de sincronización de las células humanas en las diferentes etapas de la célula ciclo, incluyendo ambos en fase S y fase M con un bloque doble timidina y suelte el procedimiento para el estudio de la funcionalidad de proteínas mitotic en la alineación del cromosoma y la segregación. Este protocolo ha sido muy útil para el estudio de los roles mitotic de proteínas multifuncionales que poseen funciones de interfase establecido. En nuestro caso, la función mitótica de Cdt1, una proteína crítica para replicación origen licencia en fase G1, se puede estudiar con eficacia solamente cuando Cdt1 específicas de G2/M puede ser agotado. Describimos el protocolo detallado para agotamiento de Cdt1 específicas de G2/M usando la sincronización doble de la timidina. También explicar el protocolo de la fijación de la célula y proyección de imagen de célula mediante microscopía confocal de alta resolución después del lanzamiento de timidina en vivo. El método también es útil para el análisis de la función de proteínas mitotic bajo condiciones fisiológicas y perturbadas como para Hec1, un componente del complejo Ndc80 ya que permite obtener tamaños de muestra grandes de células mitotic para fija y vivo de la célula Análisis como se muestra aquí.

Estudio de la progresión mitótica y estabilidad de los microtúbulos en células fijas después del lanzamiento de doble bloque de timidina Cdt1 participa en la concesión de licencias de origen de replicación del ADN en la fase G1. Se degrada durante la fase S, pero nuevamente se acumula en la fase G2/M. Para estudiar su papel en la mitosis, Cdt1 endógeno debe agotarse en la fase G/M usando la técnica de sincronización más adecuada de células, la timidina doble bloque<sup...

Presentamos un protocolo para sincronización de timidina doble de células HeLa, seguido por el análisis mediante microscopía confocal de alta resolución. Este método es clave para la obtención de gran número de células que proceden síncrono de fase S de la mitosis, lo que permite estudios sobre roles mitotic de proteínas multifuncionales que también poseen las funciones de interfase.

Combina la sincronización celular mitótica y microscopia Confocal de alta resolución para estudiar el papel de las proteínas multifuncional ciclo celular durante la Mitosis

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...

El objetivo general de este procedimiento es utilizar la sincronización doble de timidina y la microscopía confocal de alta resolución para estudiar las funciones mitóticas de las proteínas multifuncionales que pueden poseer funciones críticas de interfase. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular, sobre cómo delinear las funciones normales de las proteínas involucradas en el ciclo celular y la mitosis. Las principales ventajas de esta técnica son que las células pueden mantener su comportamiento fisiológico normal y que este método también es muy fácil de realizar.El Dr. Mohammed Amin, un post-doc de mi laboratorio, que es un experto en el uso de este método, demostrará este procedimiento. Para obtener imágenes de células fijas de la progresión de las células mitóticas, comience sembrando aproximadamente dos veces 10 a la quinta célula HeLa en cada pocillo de una placa de seis pocillos, que contiene un cubreobjetos esterilizado con etanol y UV al 70% y dos mililitros de medio DMEM. Después de 24 horas en una incubadora de cultivo celular, bloquee las células con dos mililitros de timidina recién diluida y medio fresco por pocillo, y d

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Investigación

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Biology

Biología

Aquí se describe un protocolo básico de la imagen y cuantificar el tiempo mitótico de las células de mamíferos viven de cultivo de tejidos después de la transfección de siRNA.

Time-lapse de imágenes de mitosis después de la transfección de siRNA

El cinetocoro es donde el SAC inicia su señal de control de la segregación mitótica de las cromátidas hermanas. Se describe un método para visualizar la contratación y la rotación de una de las kinetochore proteínas y su coordinación con el movimiento de los cromosomas...

El estudio de puesto de control mitótico, ilustrando comportamiento dinámico de proteínas cinetocoro y el movimiento de cromosomas en vivo<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones Sincitial

Metafase anafase transición se activa a través de la promoción de complejos anafase (APC / C)-dependiente de ubiquitinación y posterior destrucción de la ciclina B. En este caso, hemos establecido un sistema que, a raíz de pulso-caza etiquetado, permite monitorizar la proteólisis de ciclina B en poblaciones de células enteras y facilita la detección de interferencia por el puesto de control mitótico.

El estudio de la proteólisis de ciclina B en el nivel de células individuales en poblaciones de células enteras

La mitosis progenitoras neurales es un parámetro crítico de la neurogénesis. Gran parte de nuestra comprensión de la mitosis progenitoras neurales se basa en el análisis de tejido fijado. Formación de imágenes en vivo en rodajas de cerebro de embriones es una técnica versátil para evaluar la mitosis con alta resolución temporal y espacial en un entorno controlado.

Imágenes en vivo de la mitosis en el desarrollo de la corteza de embriones de ratón

Presentamos dos protocolos de sincronización celular que proporcionan un contexto para el estudio de eventos relacionados con fases específicas del ciclo celular. Mostramos que este enfoque es útil para analizar la regulación de genes específicos en un ciclo celular no perturbado o en la exposición a agentes que afectan el ciclo celular.

Estudio de la expresión genética regulada por el ciclo celular mediante dos protocolos complementarios de sincronización celular

Este protocolo eficientemente estudios División de célula mamífera en matrices de colágeno 3D mediante la integración de sincronización de la división celular, monitoreo de eventos de la división de matrices 3D utilizando la técnica de imágenes de células vivas, la microscopia confocal tiempo-resolved de la reflexión cuantitativos y análisis de imágenes.

División de célula mamífera en Matrices 3D mediante microscopia de reflexión Confocal cuantitativa

Este protocolo describe un método sencillo y conveniente para marcar y visualizar energizados cromosomas en las células mitotic usando la etiqueta Histone2B-GFP BacMam 2.0 y un sistema de microscopia confocal spinning disc.

Imágenes de células vivas de la segregación de cromosomas durante la Mitosis

Aquí, presentamos imágenes de células vivas que es un método de microscopía no tóxico que permite a los investigadores estudiar el comportamiento de las proteínas y la dinámica nuclear en las células de levadura de fisión viva durante la mitosis y la meiosis.

Examen de la dinámica nuclear de levadura de ficción mitotica y meiótica por microscopía de células vivas de fluorescencia

Aquí presentamos un protocolo para evaluar la dinámica de la formación del husillo y la progresión mitotica. Nuestra aplicación de imágenes de lapso de tiempo permite al usuario identificar células en varias etapas de la mitosis, rastrear e identificar defectos mitoticos, y analizar la dinámica del husillo y el destino de las células mitoticas al exponerse a fármacos antimitoticos.

Imágenes de células vivas para evaluar la dinámica del tiempo metafásico y el destino celular después de las perturbaciones del husillo mitático

Este protocolo detalla dos métodos de detención del ciclo celular de levadura y liberación opcional, y elabora el uso de microscopía de fluorescencia para estudiar los procesos dependientes del ciclo celular en S. cerevisiae.

Manipulación y análisis de procesos dependientes del ciclo celular en levaduras en ciernes

Aprende a sincronizar células HeLa con doble timidina y analizarlas mediante microscopía confocal de alta resolución. Este método permite estudiar los roles mitóticos de proteínas multifuncionales que también actúan durante la interfase.

Combina la sincronización celular mitótica y microscopia Confocal de alta resolución para estudiar el papel de las proteínas multifuncional ciclo celular durante la Mitosis (Video) | JoVE Journal

Combina la sincronización celular mitótica y microscopia Confocal de alta resolución para estudiar el papel de las proteínas multifuncional ciclo celular durante la Mitosis

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