Combina la sincronización celular mitótica y microscopia Confocal de alta resolución para estudiar el papel de las proteínas multifuncional ciclo celular durante la Mitosis

El objetivo general de este procedimiento es utilizar la sincronización doble de timidina y la microscopía confocal de alta resolución para estudiar las funciones mitóticas de las proteínas multifuncionales que pueden poseer funciones críticas de interfase. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular, sobre cómo delinear las funciones normales de las proteínas involucradas en el ciclo celular y la mitosis. Las principales ventajas de esta técnica son que las células pueden mantener su comportamiento fisiológico normal y que este método también es muy fácil de realizar.

El Dr. Mohammed Amin, un post-doc de mi laboratorio, que es un experto en el uso de este método, demostrará este procedimiento. Para obtener imágenes de células fijas de la progresión de las células mitóticas, comience sembrando aproximadamente dos veces 10 a la quinta célula HeLa en cada pocillo de una placa de seis pocillos, que contiene un cubreobjetos esterilizado con etanol y UV al 70% y dos mililitros de medio DMEM. Después de 24 horas en una incubadora de cultivo celular, bloquee las células con dos mililitros de timidina recién diluida y medio fresco por pocillo, y devuelva la placa a la incubadora durante otras 18 horas.

Al día siguiente, lave las células dos veces con dos mililitros de PBS y una vez con medio fresco a 37 grados centígrados. Regrese las células a la incubadora durante nueve horas para liberar las células del bloqueo, seguido de la adición de otros dos mililitros de medio suplementado con timidina por pocillo. Después de la segunda incubación de bloqueo, lave las células dos veces con dos mililitros de PBS y una vez con dos mililitros de medio fresco a 37 grados Celsius, y agregue 100 nanomolares de siRNA recién preparado a los pocillos apropiados.

Después de nueve a 10 horas, aspire el sobrenadante y fije las células en los cubreobjetos con paraformaldehído al cuatro por ciento durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después del lavado con PBS, permeabilizar las celdas fijas con detergente al 0,5% durante 10 minutos a temperatura ambiente, seguido de dos lavados de cinco minutos en PBS. Bloquee las celdas con un uno por ciento de BSA en PBS durante una hora a temperatura ambiente.

A continuación, etiquete las células con 50 microlitros de los anticuerpos primarios de interés durante una hora a 37 grados centígrados. Al final de la incubación, lavar las células tres veces en PBS y marcarlas con 50 microlitros de los anticuerpos secundarios apropiados de interés. Después de una hora a temperatura ambiente, lave las celdas dos veces en PBS durante cinco minutos cada lavado y etiquete las celdas con DAPI durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Siga la tinción DAPI con dos lavados de cinco minutos en PBS y utilice el medio de montaje adecuado para montar los cubreobjetos en portaobjetos de microscopio transparentes individuales. A continuación, utilizando objetivos de inmersión en aceite apocromáticos DIC con plano de apertura numérica de 60 o 100 X 1,4 montados en un microscopio confocal invertido de alta resolución equipado con una cámara adecuada, adquiera imágenes de las proteínas inmunoteñidas en pilas Z de 0,2 micrómetros de grosor. Para obtener imágenes de células vivas de la progresión de las células mitóticas, siembre aproximadamente de 0,5 a una vez 10 por 10 a la quinta célula HeLa que exprese de manera estable mCherry H2B y alfa-tubulina GFP en placas con fondo de vidrio de 35 mililitros que contengan 1,5 mililitros de medio DMEM.

Cultive las células en una incubadora de cultivo celular durante 24 horas. Luego, la timidina bloquea las células dos veces como se acaba de demostrar, esta vez lavando las células dos veces con dos mililitros de PBS y una vez con un mililitro de medio DMEM precalentado al final de cada bloque de timidina y tratando las células con siRNA después del primer bloque durante el primer lavado con timidina. Cultive las células en medio Leibovitz fresco precalentado, suplementado con 10% de FBS y 20 milimolares HEPES durante ocho horas para liberar las células del segundo bloque.

A continuación, coloque la primera placa en la cámara de temperatura controlada de un microscopio confocal de alta resolución y utilice el objetivo de 60 X y las imágenes de campo claro para enfocar las células. Cuando las celdas estén visibles, ajuste manualmente la posición de la placa a la región elegida y utilice el software de adquisición de imágenes para establecer la potencia y la exposición del láser, los parámetros de adquisición de imágenes y el período de duración del experimento. Seleccione los filtros GFP y mCherry apropiados y adquiera imágenes de fluorescencia y luz transmitida pulsada cada 10 minutos durante un máximo de 16 horas, para obtener imágenes de lapso de tiempo del proceso de mitosis.

Nueve horas después de la liberación del bloque doble de timidina, adquiera las imágenes en 12 planos z separados por un micrómetro. A continuación, analice las imágenes mediante el seguimiento de las células mitóticas individuales y utilice el software de origen adecuado para montar la película correspondiente. Aunque la mayoría de las células de control y de siRNA de Cdt1 se encuentran en la etapa de metafase a las nueve horas después de la liberación del bloqueo doble de timidina, la fijación a las 10 horas revela que la mayoría de las células tratadas con siRNA de Cdt1 todavía están detenidas en la prometafase tardía, mientras que las células de control entran en anafase y segregan sus cromosomas como se esperaba.

El tratamiento en frío nueve horas después de la liberación del bloqueo doble de timidina facilita la retención de microtúbulos de cinetocoro estables, que son relativamente menos robustos en las células con depleción de Cdt1 en comparación con las células con depleción de control. La licencia del origen de la replicación del ADN no se altera en las células con Cdt1 o en las células agotadas por el control durante la fase G2-M, ya que no se encontró que estas células indujeran la acumulación de gamma H2AX fosforado, un marcador de daño en el ADN, durante la fase G2 posterior. Sin embargo, la transfección de siRNA Cdt1 de cultivos asíncronos induce la acumulación de focos positivos de fosfo gamma H2AX, posiblemente debido al daño en el ADN inducido por una licencia de replicación de ADN inadecuada.

Después de la ruptura de la envoltura nuclear, las células normales entran en mitosis y experimentan un inicio de anafase para salir de la mitosis en aproximadamente 30 a 60 minutos. Sin embargo, la eliminación mediada por ARNi de Hec1, una proteína clave del cinetocoro necesaria para la formación robusta de la unión de los microtúbulos del cinetocoro, retrasa la progresión mitótica normal al inicio de la anafase o la salida de la mitosis incluso después de varias horas de retraso en la mitosis. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en tres o cuatro días si se realiza correctamente.

Al intentar el procedimiento, es importante recordar disolver la timidina por completo después de descongelarla del congelador. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el western blot para responder a preguntas adicionales como, ¿cuáles son los patrones de expresión de las proteínas de interés durante la mitosis en comparación con la interfase? Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología celular exploraran la biogénesis del cáncer en modelos de cultivo de células humanas y utilizaran la microscopía confocal de alta resolución para identificar las funciones relacionadas con el ciclo celular de las proteínas de interés.

No olvide que trabajar con reactivos como el paraformaldehído y el DAPI puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes y una bata de laboratorio al realizar este procedimiento.