Desarrollo de organoides a partir de la hipófisis del ratón como modelo in vitro para explorar la biología de las células madre hipofisarias
25 de febrero de 2022
La glándula pituitaria es el regulador clave del sistema endocrino del cuerpo. Este artículo describe el desarrollo de organoides a partir de la hipófisis del ratón como un nuevo modelo 3D in vitro para estudiar la población de células madre de la glándula, cuya biología y función siguen siendo poco conocidas.
Nuestro modelo organoide es muy valioso para explorar la biología de las células madre hipofisarias en condiciones homeostáticas y de remodelación hipofisaria, como en la maduración neonatal de la glándula, el deterioro funcional asociado al envejecimiento y el crecimiento tumoral en la glándula. Hasta la fecha, nuestra técnica de organoides hipofisarios es la única herramienta disponible para crecer y expandir de manera confiable y robusta las células madre hipofisarias primarias del ratón. Demostrando el procedimiento estarán Emma Laporte y Charlotte Nys, estudiantes de doctorado en mi grupo de investigación.
Para comenzar, lave la cabeza del ratón con agua desionizada para eliminar la sangre. Rocíe etanol al 70% en la cabeza para generar un ambiente estéril. Luego, retire la piel entre las orejas con herramientas quirúrgicas estériles.
Para abrir el cráneo, rompa el puente de la nariz con tijeras estériles. Abra aún más el cráneo a partir del puente de la nariz hacia las orejas en ambos lados. Retire el cráneo y el cerebro con pinzas estériles sin tocar la glándula pituitaria.
Retire las sillas de diafragma con pinzas romas. Luego, bajo un estereomicroscopio, separe el lóbulo anterior de los lóbulos posterior e intermedio. Aísle cuidadosamente el lóbulo anterior con pinzas romas y recójalo en un matraz Erlenmeyer de 10 mililitros que contenga tres mililitros de A mediano.Agregue dos mililitros de solución de tripsina al 2,5% precalentada.
Incubar a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Agregue dos mililitros de solución de DNAse precalentada y revuelva el matraz Erlenmeyer 10 veces. Deje que la hipófisis se hunda hasta el fondo y retire el sobrenadante.
Agregue dos mililitros de solución inhibidora de tripsina precalentada e incube a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Retire el sobrenadante cuando la hipófisis se hunda hasta el fondo. Agregue dos mililitros de B medio precalentado e incube durante cinco minutos.
Agregue dos mililitros de C medio precalentado a esto e incube durante 15 minutos. Deje que la hipófisis se hunda hasta el fondo y retire el sobrenadante. Luego, enjuáguelo tres veces con C medio precalentado.Agregue dos mililitros de C.Aspirado medio precalentado y expulse la glándula pituitaria con una pipeta Pasteur estéril y pulida al llama varias veces hasta que los fragmentos ya no sean visibles.
Transfiera la suspensión a un tubo de 15 mililitros que contenga 4,5 mililitros de solución de DNAsa precalentada. Enjuague el matraz tres veces con dos mililitros de C medio precalentado y transfiera la suspensión al tubo. Mezcle la suspensión celular recolectada y filtre a través de un colador celular de 40 micras en un tubo de 30 mililitros.
Enjuague el tubo y el colador celular tres veces con dos mililitros de C medio y transfiera la suspensión al tubo. Llene una pipeta Pasteur de vidrio con dos mililitros de BSA. Coloque la punta de la pipeta en la parte inferior del tubo y salga suavemente para formar una capa de densidad visible.
Centrifugar a 190 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender la bolita celular en un mililitro de DMEM/F-12 avanzado helado. Luego, cuantifique las celdas con un contador de celdas.
Centrifugar la suspensión celular a 190 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y retirar el sobrenadante. Resuspend el pellet celular en DMEM/F-12 avanzado para alcanzar una densidad celular de 1,1 veces 10 a las 6ª células por mililitro. Agregue ECM al volumen deseado de suspensión celular en una proporción de 30:70 y mezcle bien.
Deposite una gota de 30 microlitros de esta mezcla en cada pocillo de una placa de 48 pocillos precalentada. Gire la placa boca abajo y deje que el ECM se solidifique a 37 grados centígrados durante 20 minutos. Después de la incubación, agregue cuidadosamente 250 microlitros de medio organoide hipofisario precalentado complementado con un inhibidor de ROCK de 10 micromolares.
Cada dos o tres días, cambie el medio sin inhibidor de ROCK durante 10 a 14 días hasta que los organoides estén completamente desarrollados. Para pasar los organoides, primero aspire el medio suavemente y agregue 400 microlitros de DMEM / F-12 avanzado en frío para desintegrar el ECM. Luego, recoja los organoides en un tubo de microcentrífuga.
Lave el pozo con 400 microlitros de DMEM/F-12 avanzados en frío. Centrifugar el tubo a 200 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante y agregue 400 microlitros de enzima TrypLE Express precalentada.
Mezclar invirtiendo el tubo varias veces e incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Agregue 400 microlitros de DMEM/F-12 avanzado en frío helado. Centrifugar a 200 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y retirar el sobrenadante.
Resuspend el pellet con 100 microlitros de DMEM/F-12 avanzado en frío. Estreche una punta P-200 y use la punta para disociar los organoides mediante el pipeteo vigoroso hasta que se obtengan fragmentos de organoides. Agregue 800 microlitros de DMEM / F-12 avanzado.
Centrifugar a 190 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y retirar el sobrenadante. Para pasar los organoides, resuspenda el pellet en un volumen adecuado de DMEM / F-12 avanzado y agregue ECM en una proporción de 30: 70. Mezclar bien.
Continúe sembrando y cultivando los organoides como se describe en el manuscrito de texto. Las células individuales disociadas del lóbulo anterior se sembraron en ECM y se cultivaron en medio organoide pituitario. 14 días después de la siembra, los organoides estaban completamente desarrollados y alcanzaron un diámetro de hasta 500 micrómetros.
En esta etapa, los organoides exhibieron morfología quística con una capa epitelial que encierra un lumen. No se recomienda usar los pozos en los que aparecen estructuras densas después del crecimiento. Para el pasaje, se utilizaron fragmentos organoides para la siembra.
Siete días después del pasaje, se observó un rebrote organoide favorable con estructuras quísticas. Los organoides densos deben descartarse, ya que los organoides desfavorables pueden apoderarse del cultivo. El análisis de tinción por inmunofluorescencia para los marcadores epiteliales E-cadherina y citoqueratinas 8 y 18 confirmó el carácter epitelial de los organoides.
La expresión de los marcadores de células madre hipofisarias Sox2 y Trop2 demostró el tallo, y el marcador específico de la hipófisis LHX3 mostró el fenotipo hipofisario de los organoides. La expresión del marcador Ki67 mostró que las células organoides constituyentes se encuentran en un estado proliferativo. El análisis RTQ PCR mostró una mayor expresión de marcadores de tallo en los organoides que en el lóbulo anterior incluso después de múltiples pasajes, validando el enriquecimiento de las células madre.
Es importante colocar el número apropiado de células individuales en la cúpula de ECM en la siembra inicial, y al pasar los organoides, uno debe recordar volver a sembrar fragmentos y no células individuales.
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Resumen
Este artículo presenta un nuevo modelo tridimensional in vitro desarrollado a partir de organoides hipofisarios de ratón para estudiar la población de células madre de esta glándula. El modelo es fundamental para explorar la biología de las células madre hipofisarias bajo diversas condiciones, incluyendo la maduración neonatal y el crecimiento tumoral.
Componentes Principales del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología de células madre
- Endocrinología
Antecedentes
- La glándula pituitaria regula el sistema endocrino.
- Comprender su población de células madre es esencial para obtener conocimientos sobre diversas afecciones.
- Las técnicas actuales para estudiar estas células son limitadas.
- Este estudio presenta un método confiable para cultivar células madre pituitarias.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un modelo de organoide tridimensional a partir de la hipófisis de ratón.
- Investigar la biología y función de las células madre hipofisarias.
- Proporcionar una herramienta para estudiar las afecciones que afectan la glándula pituitaria.
Métodos Utilizados
- Aislamiento de células madre de la hipófisis de ratón.
- Desarrollo de cultivos de organoides.
- Evaluación del crecimiento y expansión de las células madre.
- Aplicación del modelo en diversas condiciones fisiológicas.
Resultados principales
- El modelo de organoides respalda con éxito el crecimiento de células madre primarias del hipófisis de ratón.
- Permite explorar el comportamiento de las células madre en condiciones de homeostasis y remodelación.
- Demuestra el potencial para estudiar el deterioro funcional asociado al envejecimiento.
- Proporciona información sobre la dinámica del crecimiento tumoral en la glándula hipófisis.
Conclusiones
- El modelo de organoide desarrollado es un avance significativo para la investigación de la hipófisis.
- Ofrece una plataforma única para estudiar la biología de las células madre.
- Esta técnica puede conducir a una mejor comprensión de los trastornos relacionados con la hipófisis.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El establecimiento de organoides derivados de la hipófisis de ratón como un modelo robusto in vitro permite la exploración sistemática de la biología de las células madre hipofisarias tanto en condiciones de homeostasis como de remodelación. Esta plataforma aborda una brecha crítica en la validación de objetivos y la reducción mecanicista de riesgos para carteras de investigación endocrina y regenerativa. La reproducibilidad del modelo y su expansión a largo plazo respaldan la confianza predictiva en estudios de descubrimiento temprano y traslacionales.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofarmacia
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la evaluación del fenotipo y los estados de activación de las células madre hipofisarias en condiciones definidas.
- Apoya la reducción de riesgos biológicos al reproducir la naturaleza pluripotente y los marcadores específicos del tejido in vivo.
- Facilita una mayor confianza predictiva en la selección de dianas para programas endocrinos y regenerativos.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona un sistema 3D validado para la evaluación cuantitativa de la proliferación y diferenciación de células madre.
- Permite la estandarización de ensayos mediante el análisis reproducible de la expansión de organoides y la expresión de marcadores.
- Facilita la preparación para cribados de compuestos que afectan la función o remodelación de las células madre hipofisarias.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con la modelización relevante para enfermedades de la maduración, el envejecimiento y la tumorigénesis hipofisarias.
- Permite la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica de intervenciones dirigidas a células madre.
- Apoya el avance ajustado al riesgo mediante la modelización de estados glandulares tanto sanos como enfermos.
Integración de la Secuencia y Flujo de Trabajo
Este modelo de organoide se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica, permitiendo la prueba de hipótesis, la aclaración de vías y la validación funcional de dianas de células madre hipofisarias.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la prueba de hipótesis nulas sobre la activación y el fenotipo de células madre bajo condiciones controladas.
- Cribado: Proporciona resultados cuantitativos reproducibles para evaluar los efectos de compuestos sobre el crecimiento de organoides y la expresión de marcadores.
- Análisis: Permite la medición de la proliferación (Ki67), la pluripotencia (Sox2, Trop2) y los marcadores específicos del tejido (LHX3) para análisis comparativo.
- Investigación Traducional: Modela transiciones fisiológicas clave y estados patológicos relevantes para trastornos endocrinos.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma escalable y reutilizable para investigaciones de biología de células madre entre programas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la investigación de células madre hipofisarias.
- Valor operativo: Estandariza los flujos de trabajo para el cultivo, expansión y análisis fenotípico de organoides.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al permitir una validación robusta en etapas tempranas.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de programas de descubrimiento endocrino y regenerativo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo de organoides, análisis de marcadores de células madre y obtención de imágenes cuantitativas.
- Necesita acceso a infraestructura avanzada de cultivo celular, obtención de imágenes y análisis molecular.
- Exige estandarización entre equipos para la siembra, el pase y la validación de marcadores reproducibles.
- Puede ser necesaria una adaptación para otras especies o modelos de enfermedad más allá de la pituitaria de ratón.
- El control cuidadoso de la densidad celular y la selección de fragmentos es fundamental para garantizar una calidad constante de los organoides.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:53
Isolation of Mouse Anterior Lobe
1:57
Dissociation of Pituitary into Single Cells
4:28
Establishment and Culturing of Anterior Lobe Derived Organoids
7:31
Results: Establishment and Validation of Anterior Lobe Derived Organoids
9:21
Conclusion
