Bioingeniería de los microambientes humanizados de la médula ósea en el ratón y su visualización por imágenes en directo

El objetivo general de este método es implantar andamios portadores de células humanas en ratones para crear nichos de médula ósea humanizados y luego obtener imágenes en vivo del comportamiento de las células humanas dentro de los implantes. Este método ayudará a responder preguntas clave en el campo hematopoyético humano, ya que permite reproducir e imágenes en vivo con una resolución de una sola célula diferentes componentes de la médula ósea. La versatilidad de este sistema es una de sus mayores ventajas, ya que permite la implantación de diferentes componentes de nicho uno a uno o en combinación.

Esta metodología podría aplicarse potencialmente a otros campos de investigación, como la metástasis tumoral o los estudios de cribado de fármacos. Usando la técnica estéril adecuada, comience cortando una esponja de gelatina esterilizada en 24 pedazos de tamaño similar. Reconstituya los andamios de gelatina por inmersión en etanol y luego en PBS.

A continuación, frote suavemente cada andamio sobre un pañuelo estéril para eliminar el exceso de líquido y transfiera los andamios a pocillos individuales de una placa de 24 pocillos de fijación ultrabaja. Usando una jeringa de insulina, inyecte cuidadosamente una vez 10 a la quinta a una vez 10 a la sexta células estromales en 50 microlitros de medio de cultivo en cada andamio, y coloque la placa en una incubadora de cultivo celular. Al inyectar las celdas en el andamio, asegúrese de que no haya fugas fuera del andamio.

Después de una hora, llene cada pocillo con tres mililitros de medio de cultivo celular fresco y devuelva los andamios a la incubadora. Después de 24 horas, inyecte una vez 10 a la quinta células hematopoyéticas en los andamios, seguido de incubación y adición adicional de medios, y 24 horas de incubación como se acaba de demostrar. Para la generación de andamios portadores de dos proteínas morfogenéticas óseas humanas recombinantes, coloque los andamios reconstituidos en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos con fondo en U y agregue cinco microlitros de proteína morfogenética ósea humana recombinante dos a cada andamio.

Luego cubra los andamios con 20 microlitros de trombina y 20 microlitros de fibrinógeno. Para la implantación quirúrgica de los andamios de bioingeniería, primero se debe afeitar el área quirúrgica en la parte posterior del ratón experimental y usar una punta de algodón humedecida en clorhexidina diluida para limpiar la superficie de la piel expuesta tres veces en cada dirección. A continuación, utilice pinzas estériles y un bisturí para hacer una incisión de 0,5 a 0,7 centímetros anterior a posterior en la piel, e inserte las pinzas debajo del tejido subcutáneo para hacer una bolsa.

Inserte el andamio profundamente en el bolsillo y cierre la incisión con pegamento quirúrgico. Permita que los andamios implantados se desarrollen durante ocho a 24 semanas antes del explante. Después de la administración intravenosa de sustancias fluorescentes y la eutanasia de los animales, esterilizar la piel como se acaba de demostrar y hacer una incisión cutánea longitudinal en el lomo del animal, cerca del sitio de implantación original.

Separe cuidadosamente la piel de la bolsa subcutánea donde se implantó el andamio, luego use pinzas para agarrar suavemente el andamio y corte con cuidado la membrana residual y los tejidos que rodean el andamio para recuperar la estructura. Use pegamento adhesivo de acción rápida para asegurar el andamio a una placa de Petri de 35 por 10 mililitros. En el caso de los andamios de proteínas morfogenéticas óseas, antes de llenar la placa con PBS, utilice un microtaladro quirúrgico bajo un microscopio microquirúrgico para adelgazar la superficie ósea, lo que permite la visualización de los fluoróforos y la captura de imágenes de alta resolución.

Tenga especial cuidado durante el proceso de perforación porque el grosor del hueso suele variar entre los andamios, y es importante no romper la superficie. Llene el plato con PBS a temperatura ambiente. Para obtener imágenes de microscopía de 2 fotones de los andamios de bioingeniería, coloque el andamio en la platina del microscopio confocal y seleccione la lente de inmersión en agua 20 veces 1.0 NA.

Luego, en el modo de adquisición del software de imágenes, seleccione el cuadro mostrar herramientas manuales. En el menú láser, encienda el láser de 2 fotones y deje que el láser se caliente y se estabilice. Cuando el láser esté listo, en el menú de configuración de imágenes, active el modo de canal y cambie la pista de cada fotograma.

En el menú de trayectoria de luz, seleccione el divisor de luz principal MBS 760 plus y no desescaneado. Active los cuatro detectores no escaneados y establezca la configuración como se ilustra en el esquema. En el menú de canales, establezca la longitud de onda del láser en 890 nanómetros y la potencia en 50%Establezca el maestro de ganancia en 500 a 600, el desplazamiento digital a cero y la ganancia digital a 15 para cada canal.

En el modo de adquisición, configure los parámetros adecuados para obtener imágenes de alta resolución sin dañar el tejido y blanquear los fluoróforos. A continuación, ajuste el zoom a uno para el escaneo inicial de la imagen. Cuando se hayan configurado todos los parámetros, baje la lente hasta que toque la solución salina y configure manualmente el enfoque de la lente usando una lámpara como fuente de luz.

Ahora active el menú Z-stack y seleccione la primera y última función. Establezca el intervalo requerido entre dos cortes secuenciales y seleccione en vivo para obtener una imagen de un escaneo en vivo de la muestra, ajustando la ganancia digital y el desplazamiento digital según sea necesario para una exposición óptima. Para visualizar varios canales al mismo tiempo, seleccione la función de división.

En el menú de la etapa, mientras está en el modo en vivo, escanee la imagen y marque las regiones de interés, como la ubicación de las cavidades óseas. Cuando se complete el escaneo de muestra, desplácese a la primera región de interés y use las funciones establecer primero y establecer último en el modo en vivo para establecer la parte superior e inferior de la pila Z 3D que rodea el área de interés. A continuación, establezca el centro, C, y haga clic en el botón Iniciar experimento para iniciar la adquisición de imágenes de pila Z de la región de interés.

Una vez completada la adquisición, guarde las imágenes en la carpeta designada y escanee la siguiente región de interés. En estas imágenes representativas, se puede observar la morfología macroscópica de diferentes andamios recuperados de ratones NSG inmunodeficientes ocho semanas después de la implantación. La co-siembra con células endoteliales humanas aumenta la vascularización del andamio, mientras que la adición de la proteína morfogenética ósea humana recombinante dos induce la formación de hueso.

Estos andamios, obtenidos mediante microscopía de 2 fotones en vivo, revelan la presencia de vasos sanguíneos en los andamios y el injerto a largo plazo de las células hematopoyéticas humanas en el parénquima del andamio. Los andamios sembrados con células estromales endoteliales y mesenquimales humanas ilustran la participación de las células endoteliales humanas en la formación de vasos dentro del andamio, lo que resulta en una vasculatura quimérica murino-humana. La formación de tejido óseo se puede visualizar mediante microscopía de 2 fotones, así como la formación de cavidades en la vasculatura humanizada en el tejido endosteal, que se asemeja mucho al tejido endosteal de la médula ósea.

Además, en los andamios portadores de la proteína morfogenética ósea humana recombinante, la morfología del tejido dentro del andamio se asemeja a la médula ósea madura con tejido adiposo, lo que sugiere que las células estromales mesenquimales humanas también contribuyen a la formación de tejido adiposo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de toda la bioingeniería y los principales andamios murinos. Recuerde siempre mantener un ambiente ascético y tenga mucho cuidado al manipular los andamios.

Hay que tener en cuenta las limitaciones asociadas a este método, como las quimeras humano-ratón de los tejidos. Recuerde que después de la toma de imágenes, las muestras se pueden utilizar para estudios posteriores, ya que los andamios se pueden digerir y, por lo tanto, se pueden extraer células vivas de ellos.