Bioingeniería de los microambientes humanizados de la médula ósea en el ratón y su visualización por imágenes en directo

El objetivo general de este método consiste en implantar andamios portadores de células humanas en ratones para crear nichos de médula ósea humanizados y luego obtener imágenes en vivo del comportamiento de las células humanas dentro de los implantes. Este método ayudará a responder preguntas clave en el campo de la hematopoyesis humana, ya que permite reproducir e imaginar en vivo, con resolución a nivel de célula individual, diferentes componentes de la médula ósea. La versatilidad de este sistema es una de sus principales ventajas, ya que permite la implantación de distintos componentes del nicho uno por uno o en combinación.

Esta metodología podría aplicarse potencialmente a otros campos de investigación, como estudios de metástasis tumoral o cribado de fármacos. Utilizando la técnica estéril adecuada, comience por cortar una esponja de gelatina esterilizada en 24 piezas de tamaño similar. Reconstituya los andamios de gelatina mediante inmersión en etanol y luego en PBS.

Luego, seque suavemente cada andamio sobre un tejido estéril para eliminar el exceso de líquido y transfiera los andamios a pozos individuales de una placa de 24 pozos con adherencia ultra baja. Utilizando una jeringa de insulina, inyecte cuidadosamente de uno por 10 a la quinta a uno por 10 a la sexta células estromales en 50 microlitros de medio de cultivo en cada andamio, y coloque la placa en una incubadora de cultivo celular. Al inyectar las células en el andamio, asegúrese de que no haya fugas hacia el exterior del andamio.

Después de una hora, llene cada pocillo con tres mililitros de medio fresco de cultivo celular y devuelva los andamios al incubador. Después de 24 horas, inyecte una vez 10 a la quinta células hematopoyéticas en los andamios, seguido de incubación y adición adicional de medio, y una incubación de 24 horas como se acaba de demostrar. Para la generación de andamios portadores de proteína morfogenética ósea humana recombinante dos, coloque los andamios reconstituidos en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos con fondo en U y añada cinco microlitros de proteína morfogenética ósea humana recombinante dos a cada andamio.

Luego, cubra los andamios con 20 microlitros de trombina y 20 microlitros de fibrinógeno. Para la implantación quirúrgica de los andamios bioingenierizados, primero afeite el área quirúrgica en la espalda del ratón experimental y utilice una punta de algodón sumergida en clorhexidina diluida para limpiar la superficie de la piel expuesta tres veces en cada dirección. A continuación, use pinzas estériles y un escalpelo para realizar una incisión de 0,5 a 0,7 centímetros de anterior a posterior en la piel, e inserte las pinzas bajo el tejido subcutáneo para crear una bolsa.

Introduzca el andamio profundamente en el bolsillo y cierre la incisión con pegamento quirúrgico. Deje que los andamios implantados se desarrollen durante ocho a 24 semanas antes del explante. Después de la administración intravenosa de sustancias fluorescentes y la eutanasia de los animales, esterilice la piel tal como se acaba de demostrar y realice una incisión longitudinal en la piel de la espalda del animal, cerca del sitio original de implantación.

Separar cuidadosamente la piel del bolsillo subcutáneo donde se implantó el andamio, luego usar pinzas para agarrar suavemente el andamio y cortar cuidadosamente la membrana residual y los tejidos que lo rodean para recuperar la estructura. Utilizar pegamento adhesivo de acción rápida para fijar el andamio a una placa de Petri de 35 por 10 mililitros. Para los andamios con proteína morfogenética ósea dos, antes de llenar la placa con PBS, usar un microtaladro quirúrgico bajo un microscopio microquirúrgico para adelgazar la superficie ósea, permitiendo la visualización de los fluoróforos y la captura de imágenes de alta resolución.

Tenga especial cuidado durante el proceso de perforación, ya que el espesor del hueso suele variar entre andamios, y es importante no romper la superficie. Llene la placa con PBS a temperatura ambiente. Para la imagenología por microscopía de dos fotones de los andamios bioingenierizados, coloque el andamio sobre la platina del microscopio confocal y seleccione la lente de inmersión en agua de 20 veces con apertura numérica 1.0.

Luego, en el modo de adquisición del software de imagen, seleccione la casilla mostrar herramientas manuales. En el menú del láser, encienda el láser de dos fotones y permita que el láser se caliente y se estabilice. Cuando el láser esté listo, en el menú de configuración de imagen, active el modo de canal y cambie de pista cada cuadro.

En el menú de trayectoria de luz, seleccione detección no barrida y el divisor de haz principal MBS 760 plus. Active los cuatro detectores no barridos y configure la configuración según se ilustra en el esquema. En el menú de canales, establezca la longitud de onda del láser en 890 nanómetros y la potencia en 50 %. Establezca la ganancia principal entre 500 y 600, el desplazamiento digital en cero y la ganancia digital en 15 para cada canal.

En el modo de adquisición, configure los parámetros adecuados para obtener imágenes de alta resolución sin dañar el tejido ni provocar el apagado de los fluoróforos. Luego, establezca el zoom en uno para el escaneo inicial de la imagen. Una vez que todos los parámetros hayan sido configurados, baje la lente hasta que toque la solución salina y ajuste manualmente el enfoque de la lente utilizando una lámpara como fuente de luz.

Ahora active el menú Z-stack y seleccione la función primero-último. Establezca el intervalo requerido entre dos cortes subsecuentes y seleccione live para obtener una imagen de escaneo en vivo de la muestra, ajustando la ganancia digital y el offset digital según sea necesario para una exposición óptima. Para visualizar múltiples canales al mismo tiempo, seleccione la función dividida.

En el menú de etapas, mientras está en modo en vivo, escanee la imagen y marque las regiones de interés, como la ubicación de las cavidades óseas. Cuando finalice el escaneo de la muestra, desplácese a la primera región de interés y utilice las funciones «establecer primero» y «establecer último» en el modo en vivo para definir la parte superior e inferior del conjunto tridimensional Z que rodea el área de interés. Luego, establezca el centro, C, y haga clic en el botón iniciar experimento para comenzar la adquisición de imágenes en conjunto Z de la región de interés.

Una vez finalizada la adquisición, guarde las imágenes en la carpeta designada y escanee la siguiente región de interés. En estas imágenes representativas, puede observarse la morfología macroscópica de diferentes andamios recuperados de ratones inmunodeficientes NSG ocho semanas después del implante. La siembra conjunta con células endoteliales humanas aumenta la vascularización del andamio, mientras que la adición de la proteína morfogenética ósea humana recombinante dos induce la formación ósea.

Estos andamios, observados mediante microscopía de dos fotones en tiempo real, revelan la presencia de vasos sanguíneos en los andamios y el injerto a largo plazo de células hematopoyéticas humanas en el parénquima del andamio. Los andamios sembrados con células endoteliales humanas y células estromales mesenquimales ilustran la participación de las células endoteliales humanas en la formación de vasos dentro del andamio, dando lugar a una vasculatura quimérica murino-humana. La formación de tejido óseo puede visualizarse mediante microscopía de dos fotones, así como la formación de cavidades en la vasculatura humanizada en el tejido endosteo, que se asemeja en gran medida al tejido endosteo de la médula ósea.

Además, en andamios portadores de proteína morfogenética ósea humana recombinante dos, la morfología del tejido dentro del andamio se asemeja a la de médula ósea madura con tejido adiposo, lo que sugiere que las células estromales mesenquimales humanas también contribuyen a la formación de tejido adiposo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de todos los andamios bioingenierizados y los principales andamios murinos. Recuerde siempre mantener un ambiente aséptico y tener especial cuidado al manipular los andamios.

Tenga en cuenta las limitaciones asociadas con este método, como los quimeras humano-murinos de los tejidos. Recuerde que después del análisis de imágenes, las muestras pueden utilizarse para estudios adicionales, ya que los andamios pueden digerirse y, por lo tanto, las células vivas pueden recuperarse de ellos.