Name: Pinzas magnéticas de alta velocidad para mediciones nanomecánicas en elementos sensibles a la fuerza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Aprende a usar pinzas magnéticas de alta velocidad para mediciones nanomecánicas en biomoléculas sensibles a la fuerza como ADN y complejos SNARE. Este método permite estudiar eventos mecanobiológicos en tiempo real.

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Este trabajo fue apoyado por la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el gobierno coreano (MSIT) (NRF-2022R1C1C1012176, NRF-2021R1A4A1031754 y NRF- 2021R1A6A1A10042944). S.-H.R. fue apoyado por la subvención NRF (2021R1C1C2009717).

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

En este trabajo, introdujimos una configuración de espectroscopia de fuerza de molécula única que puede observar cambios estructurales de biomoléculas con alta precisión espaciotemporal. La cámara CMOS de alta velocidad utilizada adquiere 1.200 fotogramas s−1 a una resolución de 1.280 x 1.024, lo que permite el seguimiento de cuentas de 1,2 kHz. Sin embargo, la velocidad de las mediciones está actualmente limitada por el software de seguimiento de cuentas, por lo que el ROI generalmente se reduce a áreas más p...

Las células detectan y responden activamente a estímulos mecánicos. Al hacerlo, muchas biomoléculas muestran propiedades dependientes de la fuerza que permiten cambios estructurales dinámicos. Ejemplos bien apreciados incluyen canales iónicos mecanosensibles y elementos citoesqueléticos que proporcionan a las células información mecánica clave de su entorno.
Además, las moléculas que muestran una naturaleza única de soporte de fuerza también pueden considerarse mecanosensibles en un sentido más amplio. Por ejemplo, la formación local y la fusión de dúplex de ácidos nucleicos, así como estructuras de orden superior como los cuádruples G, desempeñan un papel crucial en la replicación, transcripción, recombinación y, más recientemente, en la edición del genoma. Además, algunas proteínas neuronales implicadas en las comunicaciones sinápticas realizan sus funciones generando fuerzas físicas que superan los niveles de interacciones intermoleculares típicas. No importa qué ejemplo se estudie, la investigación de la nanomecánica de las biomoléculas involucradas con alta precisión espaciotemporal resultará muy útil para revelar los mecanismos moleculares de los procesos mecanobiológicos asociados 1,2,3.
Los métodos de espectroscopia de fuerza de molécula única han servido como herramientas poderosas para examinar las propiedades mecánicas de las biomoléculas 2,4,5,6. Pueden monitorear los cambios estructurales en ácidos nucleicos y proteínas simultáneamente con la aplicación de fuerza, examinando así las propiedades dependientes de la fuerza. Dos configuraciones bien conocidas son las pinzas ópticas y las pinzas magnéticas (MT), que emplean perlas de tamaño micrométrico para manipular moléculas 5,6,7,8. En estas plataformas, el poliestireno (para pinzas ópticas) o las perlas magnéticas (para MT) están atados a moléculas objetivo (por ejemplo, ácidos nucleicos y proteínas) a través de "mangos" moleculares, típicamente hechos de fragmentos cortos de ADN bicatenario (dsDNA). Luego, las perlas se mueven para ejercer fuerza y se obtienen imágenes para rastrear sus ubicaciones que informan sobre cambios estructurales en las moléculas objetivo. Las pinzas ópticas y magnéticas son en gran medida intercambiables en sus aplicaciones, pero existen diferencias importantes en sus enfoques para controlar la fuerza. Las pinzas ópticas son instrumentos intrínsecamente de abrazadera de posición que atrapan cuentas en posición, debido a lo cual la fuerza aplicada fluctúa cuando una construcción objetivo sufre cambios de forma; El aumento de extensión, como el despliegue, afloja la correa y reduce la tensión, y viceversa. Aunque se puede implementar retroalimentación activa para controlar la fuerza en las pinzas ópticas, las MT, en contraste, operan naturalmente como un dispositivo de abrazadera de fuerza, aprovechando las fuerzas magnéticas estables y de campo lejano mediante imanes permanentes, que también pueden soportar perturbaciones ambientales.
A pesar de su larga historia y diseño simple, los MT se han quedado atrás de las pinzas ópticas en sus aplicaciones a mediciones de alta precisión, en gran parte debido a los desafíos técnicos en el seguimiento rápido de cuentas. Recientemente, sin embargo, varios grupos han liderado conjuntamente una mejora multifacética de hardware y software para instrumentos de MT 2,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . En este trabajo, presentamos un ejemplo de tal configuración que se ejecuta a 1.2 kHz y describimos cómo usarla para realizar mediciones nanomecánicas en biomoléculas sensibles a la fuerza. Como sistemas modelo, empleamos horquillas de ADN y complejos SNARE neuronales y examinamos sus rápidos cambios estructurales en el régimen de piconewton. Las horquillas de ADN exhiben transiciones simples de dos estados en un rango de fuerza bien definido20,21 y, por lo tanto, sirven como modelos de juguete para verificar el rendimiento de una configuración de pinzas. A medida que las proteínas SNARE se ensamblan en un complejo sensible a la fuerza que impulsa la fusión de membrana22, también han sido ampliamente estudiadas por espectroscopia de fuerza de molécula única 14,23,24,25. Se presentan enfoques estándar para analizar datos y extraer información útil sobre termodinámica y cinética. Esperamos que este artículo pueda facilitar la adopción de MT de alta precisión en estudios mecanobiológicos y motivar a los lectores a explorar sus propios sistemas de interés sensibles a la fuerza.

pinzas magnéticas de alta velocidad para mediciones nanomecánicas en elementos sensibles a la fuerza

High-Speed Magnetic Tweezers for Nanomechanical Measurements on Force-Sensitive Elements

Las pinzas magnéticas (MT) de una sola molécula han servido como herramientas poderosas para interrogar con fuerza a las biomoléculas, como los ácidos nucleicos y las proteínas, y por lo tanto están preparadas para ser útiles en el campo de la mecanobiología. Dado que el método comúnmente se basa en el seguimiento basado en imágenes de perlas magnéticas, el límite de velocidad en la grabación y análisis de imágenes, así como las fluctuaciones térmicas de las perlas, ha obstaculizado durante mucho tiempo su aplicación en la observación de cambios estructurales pequeños y rápidos en las moléculas objetivo. Este artículo describe métodos detallados para la construcción y operación de una configuración de MT de alta resolución que puede resolver la dinámica de milisegundos a nanoescala de biomoléculas y sus complejos. Como ejemplos de aplicación, se demuestran experimentos con horquillas de ADN y complejos SNARE (maquinaria de fusión de membranas), centrándose en cómo se pueden detectar sus estados transitorios y transiciones en presencia de fuerzas a escala de piconewton. Esperamos que las MT de alta velocidad continúen permitiendo mediciones nanomecánicas de alta precisión en moléculas que detectan, transmiten y generan fuerzas en las células y, por lo tanto, profundicen nuestra comprensión a nivel molecular de la mecanobiología.

Calibración de fuerza Los resultados de los dos métodos de medición de fuerza (varianza de desplazamiento lateral de las perlas y análisis del espectro de potencia) difirieron en 0-2 pN (Figura 2G). De acuerdo con los resultados de la Figura 2F, podemos alcanzar de manera confiable hasta 30 pN con imanes de neodimio regulares.
Transiciones de dos estados de una horquilla de ADN de 8 pb Primero i...

Aquí, describimos una configuración de pinza magnética de alta velocidad que realiza mediciones nanomecánicas en biomoléculas sensibles a la fuerza a la velocidad máxima de 1.2 kHz. Introducimos su aplicación a horquillas de ADN y complejos SNARE como sistemas modelo, pero también será aplicable a otras moléculas involucradas en eventos mecanobiológicos.

Pinzas magnéticas de alta velocidad para mediciones nanomecánicas en elementos sensibles a la fuerza

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are ...

Las biomoléculas experimentan cambios estructurales pequeños y rápidos a menudo en respuesta a la fuerza. Las pinzas magnéticas de alta resolución pueden explorar estas dinámicas bajo fuerzas fisiológicamente relevantes. Como el método realiza mediciones a nanoescala con una precisión de milisegundos, es posible monitorear cambios sutiles en ácidos nucleicos y proteínas en tiempo real.El mal funcionamiento de las proteínas del primer rodamiento y mecanosensibles puede conducir potencialmente a trastornos cardiovasculares y musculoesqueléticos. Las pinzas magnéticas pueden proporcionar información sobre los mecanismos de trabajo de estas proteínas. El conjunto debe estar correctamente alineado y calibrado para obtener buenas resoluciones.Además, se debe tener cuidado durante la preparación e identificación de construcciones moleculares para las mediciones. Comience instalando un microscopio invertido en una mesa óptica antivibración. A continuación, instale una cámara CMOS de alta velocidad y un capturador de fotogramas.Monte verticalmente una etapa lineal motorizada con una longitud de recorrido de más de 20 milímetros en una etapa XY manual para construir una etapa de traslación p

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

En este artículo se describe el uso de pinzas magnéticas para estudiar el efecto de la fuerza en la proteólisis enzimática a nivel sola molécula de una manera altamente paralelizable.

Multiplexado de una sola molécula de mediciones de la Fuerza proteólisis utilizando pinzas magnéticas

Se midió la liberación de la tensión en un axón que fue parcialmente lesionada con un disector de láser por la medición simultánea de espectroscopia de fuerza se realiza en una sonda ópticamente atrapado adherido a la membrana del axón. El protocolo experimental desarrollado evalúa la adhesión axón al sustrato de cultivo.

Medición de la tensión de salida durante Laser Induced Axon lesión axonal a evaluar la adhesión al sustrato en picoNewton y Millisecond Resolución

Pinzas magnéticas, una técnica de la manipulación de una sola molécula de gran alcance, pueden ser adaptadas para las mediciones directas de la torsión (usando una configuración llamada libremente en órbita alrededor de pinzas magnéticas) y el par (usando una configuración denominado pinzas de par magnético) en macromoléculas biológicas. Se dan directrices para efectuar estas mediciones, incluidas las aplicaciones para el estudio de ADN y filamentos de núcleo-proteínas asociadas.

Pinzas Magnéticas para la Medición de Twist and Torque

Una plataforma de una sola molécula magnética Pinzas para manipular G-quadruplexes se divulga, que permite el estudio de estabilidad de G4 y regulación por diversas proteínas.

Manipulación de una sola molécula de G-quadruplexes por pinzas magnéticas

Aquí, presentamos un protocolo para investigar las propiedades mecánicas intracelulares de células embrionarias aisladas de pez cebra en confinamiento tridimensional con medición directa de la fuerza mediante una trampa óptica.

Mediciones directas de la fuerza de la mecánica subcelular en confinamiento utilizando pinzas ópticas

La microscopía de fuerza magnética (MFM) emplea una sonda de microscopía de fuerza atómica magnetizada verticalmente para medir la topografía de la muestra y la intensidad del campo magnético local con resolución a nanoescala. La optimización de la resolución espacial y la sensibilidad de las máquinas digitales multifuncionales requiere equilibrar la disminución de la altura de elevación con el aumento de la amplitud de la unidad (oscilación), y se beneficia de operar en una guantera de...

Optimización de la resolución y sensibilidad de la microscopía de fuerza magnética para visualizar dominios magnéticos a nanoescala

Este protocolo demuestra el uso de pinzas magnéticas de una sola molécula para estudiar las interacciones entre las proteínas teloméricas de unión al ADN (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] y TRF2) y los telómeros largos extraídos de células humanas. Describe los pasos preparatorios para los telómeros y los factores de unión de repetición telomérica, la ejecución de experimentos de una sola molécula y los métodos de recopilación y análisis de datos.

Análisis de las interacciones teloméricas proteína-ADN utilizando pinzas magnéticas de una sola molécula

flexibilidad conformacional desempeña un papel crítico en la función de la proteína. En este documento, se describe el uso de la espectrometría de masas de ionización por electrospray resuelta en el tiempo junto con el intercambio de hidrógeno-deuterio para sondear los rápidos cambios estructurales que impulsan función en proteínas ordenadas y desordenadas.

Resuelta en el tiempo de ionización por electrospray de hidrógeno-deuterio Espectrometría de Masas de cambio para el estudio de la estructura proteica y Dinámica

Aquí describimos un protocolo simple para producir rápidamente cientos de agar medios de crecimiento nematodos, placas 96 pocillos con un número constante de Caenorhhabditis elegans por pozo. Estas culturas son útiles para la detección fenotípica de organismos enteros. Nos centramos aquí en el uso de estas culturas a los productos químicos de la pantalla para efectos de Pro-longevidad.

Un método Simple para la detección química de alto rendimiento en Caenorhabditis Elegans

Aquí presentamos un protocolo de los experimentos electroquímicos celulares para estudiar la contribución del transporte de protones a la velocidad de transporte de electrones extracelular a través de los citocromos de la membrana externa de Shewanella oneidensis MR-1.

Electroquímico detección de deuterio cinético isótopo efecto en extracelular transporte de electrones en la Shewanella oneidensis MR-1

Aprende a usar pinzas magnéticas de alta velocidad para mediciones nanomecánicas en biomoléculas sensibles a la fuerza como ADN y complejos SNARE. Este método permite estudiar eventos mecanobiológicos en tiempo real.

Pinzas magnéticas de alta velocidad para mediciones nanomecánicas en elementos sensibles a la fuerza

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