Name: Dispositivo microfluídico bicapa para la producción de tapones combinatorios (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Aprende a fabricar un dispositivo microfluídico de PDMS bicapa para producir tapones combinatorios en emulsiones agua-en-aceite. Este método automatiza la generación de bibliotecas fluorescentes cuantitativas para investigación oncológica de precisión.

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Nos gustaría agradecer a Stacey Martina de NanoLab TuE por su ayuda con la deposición de vapor de HMDS. Esta investigación fue financiada por el Instituto de Sistemas Moleculares Complejos (ICMS) de la Universidad Holandesa y por el programa de gravitación de la Organización Holandesa para la Investigación Científica (NWO) IMAGINE! (Proyecto número 24.005.009).

Configuración de un dispositivo microfluídico para la producción de tapones combinatorios

F. E. es un trabajador independiente de TheraMe! AG. Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

En este artículo, se ha presentado un conjunto de protocolos para la fabricación y operación de un dispositivo microfluídico basado en PDMS para la generación automatizada de bibliotecas combinatorias en compartimentos de agua en aceite llamados tapones. La combinación de la microfluídica con la tecnología de gotas proporciona una técnica potente para encapsular una pequeña cantidad de reactivos en un gran número de compartimentos, lo que abre vías para el cribado combinatorio a gran escala.
Anteriormente, se han descrito varias tecnologías para generar compartimentos químicamente distintos utilizando microfluídica, cada una con sus ventajas y limitaciones. Kulesa et al.50, describieron una estrategia para encapsular células con códigos de barras en gotas utilizando placas de microtitulación y fusionar estas gotas utilizando un campo eléctrico para crear una biblioteca combinatoria. Si bien este enfoque puede generar muchas combinaciones de gotas, está limitado por la necesidad de pasos de manipulación manual en el flujo de trabajo. Tomasi et al.51 desarrollaron una plataforma microfluídica para fusionar una gota que contiene esferoide (agregados celulares flotantes libres) con una gota de estímulo, permitiendo así la manipulación del microambiente esferoide. Este método permite el estudio de fenómenos importantes como las interacciones célula-célula y el efecto de los fármacos, pero su rendimiento es relativamente bajo. Eduati et al.46 y Utharala et al.47 desarrollaron una plataforma basada en válvulas microfluídicas que puede generar bibliotecas combinatorias de alto rendimiento de forma automatizada. Sin embargo, en estos estudios, las válvulas se operan utilizando un dispositivo Braille, lo que requiere engorrosos pasos de alineación entre la microválvula y el chip microfluídico. Una característica clave del sistema descrito en este documento es la implementación de válvulas neumáticas PDMS para regular el flujo de fluido en los canales de entrada. Dado que estas válvulas están basadas en PDMS, se pueden incorporar sin problemas en los pasos de fabricación del chip microfluídico. Además, son una opción relativamente sencilla para controlar el flujo de líquidos en los canales de entrada, ya que pueden accionarse aplicando presión a través de una fuente de gas externa. Finalmente, se puede programar la duración y la secuencia de presurización y despresurización de estas válvulas, automatizando así la producción de distintas poblaciones de tapones de una manera de alto rendimiento. Otra característica importante es el uso de regímenes de presión constante para la inyección de reactivos a través de la entrada, lo que permite optar por no incorporar canales de residuos para aliviar cualquier acumulación de presión que surja en un régimen de caudal constante. Esto simplifica el diseño del dispositivo, reduce la necesidad de válvulas y hardware adicionales para controlar las válvulas del canal de residuos y minimiza el desperdicio de reactivos.
Si bien la fabricación de dispositivos con PDMS es relativamente sencilla, la implementación de dichos dispositivos requiere el uso de una amplia parafernalia de hardware, como las válvulas solenoides neumáticas (para controlar el accionamiento de las válvulas PDMS), bombas de presión (para controlar el flujo de reactivos de entrada y aceite) y programas de software (para regular las válvulas solenoides). Si bien representan una inversión significativa, dicha configuración proporciona consistencia y confiabilidad para el funcionamiento exitoso del dispositivo. Además, los componentes de hardware y la arquitectura descritos en este protocolo se configuran de forma modular. Por lo tanto, se pueden utilizar alternativas para algunos módulos para reducir costos o para adaptarlos a una necesidad específica. Por ejemplo, existe una variedad de bombas que se pueden utilizar en función de la utilidad, el presupuesto, la disponibilidad y la conveniencia 52,53,54. Se pueden incorporar componentes adicionales, como depósitos de fluidos y reguladores de temperatura, para reactivos de entrada sensibles23. Además, este diseño puede ampliarse o reducirse para abordar necesidades científicas específicas. Por ejemplo, en este artículo, se describe un prototipo de ocho entradas que permite combinar ocho reactivos únicos para producir tapones. Esto se puede escalar a un dispositivo de 16 entradas que permite un mayor número de entradas y combinaciones más grandes de las mismas. En consecuencia, necesitará canales de control adicionales y válvulas solenoides para abordar las entradas, pero un prototipo de este tipo permite generar bibliotecas combinatorias más grandes y diversas. Finalmente, en este artículo, cada población de tapones se produce por la apertura de tres de las ocho entradas acuosas del dispositivo microfluídico. Se observó que, para tal configuración, una presión de aproximadamente 200 mbar para los reactivos de aceite y de 400 mbar para los reactivos acuosos correspondía a un régimen de producción de tapones, que es impulsado únicamente por el accionamiento de la válvula. Cuando se aplicaron presiones más altas a los aceites, se observó una ruptura de los tapones, y la aplicación de presiones más bajas condujo a una fusión de los tapones. El régimen de presión óptimo para la producción de tapones depende de una amplia gama de factores, como el número de entradas que contribuyen a la formación de un tapón, la naturaleza y la viscosidad de los fluidos y las dimensiones de los canales, y debe optimizarse cuando sea necesario.
Uno de los inconvenientes de operar en un régimen de presión constante es que los fluidos con diferentes viscosidades tienen diferentes caudales bajo presión constante. Por lo tanto, debe asegurarse de que los reactivos acuosos que fluyen a través de las entradas sean de viscosidades comparables. El uso de fluidos de diferentes viscosidades afectará no solo el flujo de fluido en los canales de entrada, sino también la formación de tapones en la unión en T, comprometiendo así la composición de las poblaciones de tapones. Otro inconveniente es la contaminación de una población de tapones a partir de reactivos residuales en la unión en T. Cuando el dispositivo cambia entre la producción de diferentes poblaciones de enchufes, el primer/último enchufe en la secuencia de cada población tiende a ser contaminado por la población anterior o la siguiente. Esto se puede superar produciendo réplicas adicionales de cada población y descontando el tapón contaminado durante el análisis. Por último, también existe la posibilidad de variación entre dispositivos individuales que surge de inconsistencias en la fabricación y/o fuentes externas (fluctuaciones de presión). Este problema se puede mitigar reutilizando un solo chip microfluídico varias veces y asegurándose de que se realice una ejecución completa de una biblioteca combinatoria en un solo chip para minimizar el efecto de estas inconsistencias.
El dispositivo microfluídico y el conjunto de protocolos operativos que lo acompañan presentados en este artículo se han utilizado para demostrar la producción de una biblioteca combinatoria cuantitativa de tapones. Por lo tanto, esta plataforma puede generar rápidamente bibliotecas combinatorias de distintas poblaciones de enchufes de una manera de alto rendimiento. Como resultado, estas tecnologías se pueden utilizar para una variedad de propósitos de detección, incluidos, entre otros, el cribado combinatorio de fármacos en muestras de biopsias de pacientes, en el que un pequeño número de células recuperadas de una biopsia puede distribuirse en un gran número de gotas y tratarse con una gran combinación del fármaco anticancerígeno para optimizar la terapia individual para una muestra de paciente determinada y, por lo tanto, acelerar la terapia personalizada contra el cáncer46. 48,55.

La microfluídica permite la manipulación de pequeñas cantidades de fluidos en microcanales1. La escala de funcionamiento de los dispositivos microfluídicos típicos es de decenas a cientos de micrómetros, lo que permite la miniaturización de las reacciones químicas y biológicas, lo que permite que dichas reacciones se lleven a cabo con cantidades relativamente pequeñas de reactivos. Inicialmente, los dispositivos microfluídicos se fabricaban con materiales como el silicio2 y el vidrio3. A pesar de que todavía están en uso4, plantean ciertos problemas, como la compatibilidad con solventes, el alto costo de fabricación y las dificultades en la integración de controles para el flujo de fluidos 5,6. Las metodologías de fabricación basadas en PDMS, denominadas litografía blanda, ofrecen una alternativa económica para la creación rápida de prototipos de dispositivos7 y una vía para fabricar dispositivos complejos de múltiples capas8. La adición de válvulas y bombas a los dispositivos PDMS permite controlar el enrutamiento y la velocidad de los fluidos en los dispositivos 9,10. Se han desarrollado varios métodos para diseñar y accionar microválvulas de manera reversible o irreversible, por ejemplo, válvulas bimetálicas hechas de silicio y aluminio, que se accionan térmicamente11 o utilizan gas generado a partir de una reacción electroquímica para desviar una membrana de nitruro de silicio12. Gu et al. demuestran el uso de los pines mecánicos de una pantalla Braille para aplicar presión sobre los microcanales para regular el flujo13. Un conjunto de microválvulas que ha ganado popularidad son las válvulas neumáticas basadas en PDMS iniciadas por el grupo de Stephen Quake14. Por lo general, dichas válvulas se componen de dos microcanales ortogonales: un canal de flujo y un canal de control. Tras la presurización del canal de control, una delgada membrana PDMS se desvía hacia el canal de flujo, cerrándolo y, por lo tanto, interrumpiendo el flujo de fluido. Una vez despresurizada, la membrana se relaja, abriendo así el canal de flujo y permitiendo la reanudación del flujo de fluido. De este modo, las válvulas PDMS permiten la regulación del caudal de forma robusta y reversible, ya que el canal de control puede presurizarse y despresurizarse varias veces15. Además, dado que estas válvulas pueden accionarse mediante la aplicación de presión, abren vías para el control digital y la automatización16. Además, al ser del mismo material, pueden integrarse sin problemas en la fabricación de dispositivos basados en PDMS utilizando técnicas de litografía blanda 8,17,18. Estas características hacen que las válvulas PDMS sean una opción atractiva para la regulación de flujo en dispositivos microfluídicos. Thorsen et al. utilizaron el principio de tales válvulas para diseñar un multiplexor fluídico (una matriz combinatoria de válvulas neumáticas) para abordar casi mil canales de flujo de entrada con veinte canales de control19. Este principio se ha extendido para dirigir selectivamente los fluidos a los quimiostatos microfluídicos en el chip, de modo que se puedan llevar a cabo reacciones únicas simultáneamente en cada reactor 20,21,22,23. Sin embargo, estos microrreactores, si bien son útiles para optimizar el uso de reactivos limitados, no pueden paralelizar múltiples reacciones y no son suficientes para estudios de alto rendimiento.
La microfluídica de gotas es una subcategoría de la microfluídica que implica la producción de gotas a través de la manipulación de un flujo de líquido multifásico inmiscible en dispositivos microfluídicos24. La formación de gotas implica la ruptura de un fluido continuo mediante la introducción de un fluido inmiscible, lo que resulta en un pellizco debido a la inestabilidad en la energía interfacial y en la formación de una emulsión25. Los tensioactivos ayudan en la formación de gotas redondeadas cuando las emulsiones abandonan el microcanal estabilizando las energías interfaciales26. Las gotas más grandes, llamadas tapones, son menos estables y pueden recogerse en un compartimento de retención (como un trozo de tubo) como una serie de compartimentos acuosos espaciados a ambos lados por uno o más líquidos inmiscibles27. Además de la miniaturización y la compartimentación, la microfluídica de gotas también ofrece un mayor rendimiento de las reacciones biológicas, ya que se puede producir un gran número de gotas monodispersas, cada una de las cuales sirve como nanorreactor28. Las gotas, una vez generadas, también pueden ser sometidas a manipulaciones adicionales, como la división 29,30, la fusión31,32, la clasificación33,34 y el ensamblaje en estructuras de orden superior 35,36. La microfluídica de gotas ha revolucionado varios campos científicos y tecnologías, desde la PCR37 hasta la transcriptómica unicelular38, desde el descubrimiento de fármacos39,40 hasta la virología41, desde la secuenciación de próxima generación42 hasta la síntesis química43.
La integración de la litografía blanda basada en PDMS y las microválvulas con la tecnología de gotas es una potente combinación que permite la regulación del flujo de fluido en los microcanales y el posterior control del contenido de las gotas. Dependiendo de la apertura y cierre de los canales, es posible producir distintas poblaciones de gotas, cada una con una composición específica. Dicha plataforma podría miniaturizar, compartimentar y paralelizar reacciones bioquímicas y, por lo tanto, ser una técnica útil para el cribado combinatorio44. El cribado combinatorio es un método de alto rendimiento para generar decenas de miles de combinaciones de reactivos seleccionados y producir bibliotecas que constan de poblaciones individuales de composición conocida. El cribado combinatorio se ha utilizado para descubrir efectos sinérgicos entre fármacos y antibióticos para la inhibición del crecimiento bacteriano45. En el campo de la terapia oncológica, el cribado combinatorio se ha utilizado para probar combinaciones de fármacos anticancerígenos en un paciente determinado, avanzando así en la terapia personalizada46,47. Mathur et al. se han basado en esta tecnología mediante la integración de un enfoque combinatorio de código de barras de ADN para evaluar los cambios en el transcriptoma en el cribado de fármacos de alto rendimiento48. Por lo tanto, el cribado combinatorio es una tecnología potente pero incipiente, y existe la necesidad de desarrollar diversas tecnologías microfluídicas para ejecutar y facilitar dichos procedimientos de cribado.
El objetivo de este manuscrito es presentar un conjunto completo de protocolos para la fabricación de un dispositivo microfluídico bicapa capaz de generar una biblioteca combinatoria de tapones de agua en aceite y describir el hardware y software necesarios para el funcionamiento de dicho dispositivo. El flujo de fluido se regula mediante válvulas neumáticas basadas en PDMS controladas por presión, que a su vez son controladas por un programa LabVIEW personalizado. El flujo de reactivos en el dispositivo se logra utilizando bombas de presión disponibles en el mercado. Se presenta un prototipo de ocho entradas en el que se forma un tapón con el contenido de tres entradas, cada una de las cuales contiene un reactivo acuoso. La fase acuosa se encuentra con una fase oleosa continua y los tapones se producen en una unión en T con una frecuencia de 0,33 Hz. El funcionamiento del sistema se demuestra mediante la producción de una biblioteca cuantitativa que contiene tres poblaciones distintas de tapones fluorescentes. Esta tecnología y conjunto de protocolos ayudarán a acelerar la producción de bibliotecas combinatorias para fines de cribado de alto rendimiento.

<table><tbody><tr><td>1,1,3,3 tetrametildisiloxano</td><td>Merck Life Science NV</td><td>MFCD00008256</td><td></td></tr><tr><td>módulo de entrada/salida digital de 4 canales</td><td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td><td>750-504</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Boom Labs</td><td>BOOMSKEUZW3</td><td></td></tr><tr><td>software de análisis</td><td>Universidad Tecnológica de Eindhoven</td><td>https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE</td><td></td></tr><tr><td>AZ 40XT 11D</td><td>Merck Ciencias de la Vida NV&nbsp;</td><td>212299</td><td>&nbsp; Fotorreprotección positiva&nbsp;</td></tr><tr><td>Revelador AZ 726 MIF</td><td>Merck Life Science NV</td><td></td><td>10055824960 Revelador para fotorresistencia positiva</td></tr><tr><td>Biopsy Punch, Rapid Core</td><td>World Precision Instruments Germany, GMBH</td><td>504529</td><td>0.75 mm ID, W/Plunge</td></tr><tr><td>Blue colorante alimentario</td><td>PME</td><td>FC1036</td><td></td></tr><tr><td>Módulo final del controlador&nbsp;</td><td>WAGO Kontakttechnik GmbH&nbsp;</td>Controlador <td>Ethernet 750-600</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>WAGO Kontakttechnik GmbH&nbsp;</td><td>750-881</td><td></td></tr><tr><td>FC-40</td><td>Merck Millipore</td><td>F9755-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de flujo</td><td>Fluigent Sistema de presión Fluigent</td><td>FLU-S-D</td><td></td></tr><tr><td>&NBSP;</td><td>Fluigent&nbsp;</td><td>MFCS-EZ&nbsp;</td><td>0 - 2 bar</td></tr><tr><td>Fluoresceína</td><td>Merck Life Science NV</td><td>MFCD00005050</td><td></td></tr><tr><td>Placa caliente&nbsp;</td><td>Torrey Pines Scientific&nbsp;</td>Microscopio invertido <td>HP61</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Instrumentos Nikon&nbsp;</td><td>Eclipse Ti-E</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Boom Labs</td><td>BOOMSKEUZE3</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW (versión de software 20)</td><td>Universidad Tecnológica de Eindhoven</td><td>https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE/tree/main/LabVIEW_8_inlet_device_ VERSION_1</td><td>Todos los archivos han sido guardados para LabVIEW versión 20. Se recomienda utilizar esta versión o superior para abrir los archivos.</td></tr><tr><td>Talones Luer&nbsp;</td><td>Laboratorios Instech, Inc.&nbsp;</td><td>LS23</td><td>calibre 23, conectores</td></tr> <tr><td>Luer a lengüeta macho de 0,5"&nbsp;</td><td>Cole Parmer&nbsp;</td><td>45505-32 y nbsp;</td><td>3/32" de diámetro interior</td></tr><tr><td>Tubo de PTFE MasterFlex</td><td>Avator/VWR</td><td>48634</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>VWR</td><td>470150-480</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio,&nbsp; Aceite</td> mineral <td>Corning</td><td>2947-75X50</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>Millipore</td><td>330760-1L</td><td></td></tr><tr><td>mr DEV 600</td><td>Micro resist Technology</td><td>R815100</td><td>Revelador para horno fotorresistente negativo</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>&nbsp; Heraeus T6P 50045757</td><td></td></tr><tr><td>Plasma de oxígeno asher</td><td>Quorum Technologies</td><td>K1050X</td><td></td></tr><tr><td>Photomask</td><td>CAD/Art Services, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diseño de fotomáscara</td><td>Universidad Tecnológica de Eindhoven (Adaptado de Merten Lab, EPFL)</td><td>https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE/blob/main/8_inlet_JoVE_device_design.dwg</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de válvulas neumáticas</td><td>FESTO</td><td></td><td>1x 8 conjuntos de válvulas, Válvulas normalmente cerradas</td></tr><tr><td>Obleas de</td><td>silicio Materiales</td><td></td> de silicio<td>< 1-0-0>, 100 mm de diámetro, 525 &mu; m de espesor</td></tr><tr><td>Cuchillas de un solo filo&nbsp;</td><td>GEM Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo blando</td><td>Fluigent</td><td></td><td>1 mm de diámetro interior, 3 mm de diámetro exterior</td></tr><tr><td>Recubrimiento giratorio&nbsp;</td><td>Corporación de Tecnologías Laurell&nbsp;</td><td>WS-650MZ-23NPPB</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico&nbsp;</td><td>Corporación Olympus&nbsp;</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3050</td><td>Kayakli Advanced Materials</td><td>Y311075 1000L1GL</td><td>Fotorresistencia negativa</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Kit de elastómero de silicona (PDMS)</td><td>Dow</td><td>1317318</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa</td><td>B Braun Injekt - F Jeringa de dosificación fina</td><td>10303002</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de exposición UV-LED</td><td>Idonus</td><td>Bomba de vacío UV-EXP150S-SYS</td><td></td></tr><tr><td></td><td>&nbsp; Vacuumbrand GmbH&nbsp;</td><td>MD1C</td><td></td></tr><tr><td>Básculas de pesaje&nbsp;</td><td>Sartorius&nbsp;</td><td>M-prueba</td><td></td></tr></tbody></table>

dispositivo microfluídico bicapa para la producción de tapones combinatorios

Bilayer Microfluidic Device for Combinatorial Plug Production

La microfluídica de gotas es una herramienta versátil que permite la ejecución de un gran número de reacciones en compartimentos de nanolitros químicamente distintos. Estos sistemas se han utilizado para encapsular una variedad de reacciones bioquímicas, desde la incubación de células individuales hasta la implementación de reacciones de PCR, desde la genómica hasta la síntesis química. El acoplamiento de los canales microfluídicos con válvulas reguladoras permite controlar su apertura y cierre, lo que permite la rápida producción de bibliotecas combinatorias a gran escala que consisten en una población de gotas con composiciones únicas. En este artículo, se presentan los protocolos para la fabricación y operación de un dispositivo microfluídico bicapa basado en PDMS impulsado por presión que se puede utilizar para generar bibliotecas combinatorias de emulsiones de agua en aceite llamadas tapones. Mediante la incorporación de programas de software y hardware microfluídico, el flujo de fluidos deseados en el dispositivo se puede controlar y manipular para generar bibliotecas de tapones combinatorios y para controlar la composición y cantidad de poblaciones de tapones constituyentes. Estos protocolos acelerarán el proceso de generación de cribados combinatorios, en particular para estudiar la respuesta a fármacos en células de biopsias de pacientes con cáncer.

Aquí se presenta la fabricación de un dispositivo bicapa basado en polidimetilsiloxano (PDMS) para la producción de bibliotecas combinatorias en emulsiones de agua en aceite (tapones). El hardware y el software necesarios para automatizar la producción de enchufes se detallan en el protocolo, y también se demuestra la producción de una biblioteca cuantitativa de enchufes fluorescentes.

Dispositivo microfluídico bicapa para la producción de tapones combinatorios

Droplet microfluidics is a versatile tool that allows the execution of a large number of reactions in chemically distinct nanoliter compartments. Such ...

En el Grupo de Biología de Sistemas para Oncología utilizamos un enfoque computacional y experimental combinado para desentrañar el intrincado mecanismo que da forma al microambiente tumoral. Utilizamos modelos matemáticos basados en datos clínicos y biología del cáncer para identificar los factores que influyen en la respuesta individual a la terapia con el objetivo final de mejorar la oncología de precisión. Dada la naturaleza heterogénea y dinámica de la respuesta tumoral al tratamiento, la biología de las perturbaciones ha demostrado el potencial para superar la limitación de los biomarcadores genómicos.Nuestro enfoque consiste en someter las células tumorales receptivas a un extenso cribado de fármacos anticancerígenos para identificar las propiedades fenotípicas de los tumores con el fin de determinar tratamientos anticancerígenos más eficaces. La microfluídica es una tecnología valiosa que ayuda en el análisis de una pequeña cantidad de muestra, como una biopsia tumoral, distribuyéndola en compartimentos individuales, como gotas o tapones. También permite el control de la composición de cada tapón, creando así múltiples poblaciones de tapones químicamente distintos.Presentamos aquí un dispositivo totalmente basado en PDMS donde el flujo de fluido está regulado por válvulas sísmicas accionadas por presión, que permiten la producción rápida, controlada y programable de distintas poblaciones de tapones. Además, dado que las válvulas sísmicas también están basadas en PDMS, pueden integrarse sin problemas en la fabricación de dispositivos. La combinación de los datos obtenidos del cribado combinatorio de células cancerosas con modelos matemáticos nos permitirá estudiar las vías de señalización que regulan el comportamiento del microambiente tumoral.Esta investigación allanará el camino para nuevas estrategias para la oncología de precisión, proporcionando la justificación para personalizar el tratamiento para pacientes individuales.

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