Proteínas de alto rendimiento del generador de expresiones utilizando una plataforma de microfluidos
23 de agosto de 2012
Se presenta un enfoque de microfluidos para la expresión de matrices de proteínas. El dispositivo consiste en miles de cámaras de reacción controladas por micro-mecánicos válvulas. El dispositivo microfluídico está acoplado a una biblioteca de genes de microarrays-impreso. Estos genes se transcribe y se traduce en un chip, lo que resulta en una matriz de proteína listo para su uso experimental.
El objetivo general de este procedimiento es crear una matriz de proteínas modular que no requiera un paso de purificación, lo que la hace compatible con cualquier biblioteca de proteínas. Esto se logra generando primero genes sintéticos a través de PCR de ensamblaje. A continuación, los genes sintéticos se colocan en portaobjetos de epoxi.
Para fabricar el dispositivo microfluídico, utilice PDMS con control de silicona y moldes de flujo. A continuación, el dispositivo microfluídico se alinea con la matriz de ADN manchado. Finalmente, el lisado de reticulocitos de conejo se introduce en el dispositivo microfluídico y se expresan las proteínas.
En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la expresión de miles de proteínas a través del marcaje de anticuerpos fluorescentes. El uso de la técnica basada en microfluídica tiene varias ventajas sobre los métodos existentes, como los microarrays de proteínas. Micromaquillamos el ADN y luego usamos cellis para producir proteínas en el dispositivo.
Por lo tanto, no requerimos purificación de proteínas y las proteínas nunca se secan. Se mantienen frescos durante todo el experimento. La técnica microfluídica también proporciona una mayor sensibilidad Para fabricar el dispositivo microfluídico, exponga los moldes de control y flujo de silicona al vapor de clorotrimetilsileno durante 10 minutos para promover la liberación de elastómeros.
Después de los pasos de horneado, prepare una mezcla de elastómero a base de silicona y agente de curado en dos proporciones diferentes de cinco a uno y 20 a uno para los moldes de control y flujo respectivamente. Vierta el PDMS de cinco a uno en la capa de control. Desgasificar la capa de control y hornear durante 30 minutos a 80 grados centígrados.
A continuación, reboza la mezcla de PDMS 20 a uno en la capa de flujo a 2.600 RPM durante 60 segundos y luego hornéala a 80 grados centígrados durante 30 minutos. Separe lentamente la capa de control del molde, teniendo cuidado de no despegar el patrón SU eight. Luego, con un bisturí, corte el dispositivo alrededor de su perímetro y use una aguja roma para perforar agujeros para acceder a los canales de control bajo un microscopio.
Alinee manualmente las capas de flujo y control, comenzando por la esquina superior izquierda y colocando la válvula de botón en la capa de control en el centro de la cámara de reacción. A continuación, alinee la primera fila y suelte suavemente la capa de control fila por fila. Asegúrese de que todas las válvulas de botón estén en el centro de las cámaras de reacción y que las válvulas de dirección y entrada crucen los canales de flujo en la posición correcta.
Repita el proceso localmente hasta que todas las filas estén alineadas. Cuando esté completamente alineado, libere cualquier tensión en el PDMS levantándolo con cuidado desde los lados y las esquinas. Luego hornee el dispositivo durante dos horas a 80 grados centígrados después de hornear.
Corte alrededor del perímetro y retire el dispositivo de dos capas de los orificios perforados del molde de flujo para acceder a los canales de flujo y generar construcciones de ADN para el dispositivo. Llevar a cabo la PCR para producir genes sintéticos compuestos por un promotor T seven, un sitio de unión a ribosomas, un marco de lectura abierto con diferentes etiquetas de epítopos en cada extremo y un terminador T seven. Para preparar los genes sintéticos para la ordenación, haga una mezcla de polietilenglicol y D triosa dihidratado Dispense dos microlitros por reacción en los pocillos de un 384.
Plato de pozo. Agregue los genes sintéticos en una placa de 384 pocillos. Luego agregue agua destilada hasta un volumen final de 20 microlitros.
A continuación, utilizando un punto de microarray, una serie de genes sintéticos sobre sustratos de vidrio recubiertos de epoxi. Bajo un estereoscopio, alinee manualmente el dispositivo microfluídico con la matriz de genes con el punto de ADN ubicado en el centro de las cámaras de ADN. A continuación, alinea el resto de las filas.
Terminando con el ajuste fino de todo el dispositivo para aliviar cualquier estrés en el PDMS y garantizar que se adhiera bien al microarray. Levántalo localmente. Finalmente, adhiera el dispositivo al portaobjetos de vidrio incubándolo durante la noche en una placa caliente a 80 grados centígrados.
Los colorantes alimentarios se utilizan en esta sección con fines de visualización. Las válvulas en la capa de control se accionan desde la computadora utilizando la vista de laboratorio. El script de vista de laboratorio controla una serie de microválvulas de solenoide a través de una caja de control electrónico.
El colector de la válvula solenoide está conectado al aire comprimido, que controla el flujo de aire y la presión en las válvulas de control del dispositivo. Usando un tubo de plástico flexible con un diámetro interno de 0.02 pulgadas y una clavija de acero inoxidable, conecte el dispositivo al colector de válvulas solenoides. Llene los tubos con agua destilada doble e inserte el pin en los orificios de acceso de la capa de control.
Asegúrese de que cada tubo esté conectado a su canal de control correspondiente. Para activar los canales de control, ejecute la aplicación de vista de laboratorio, ajuste la presión de aire a cinco PS. A continuación, aplico presión de aire activando la válvula desde el script de vista de laboratorio. Esto empujará el agua hacia los canales de control del PDMS para identificar posibles diafonías entre los canales de control de los dispositivos defectuosos.
Llene primero el sándwich y las válvulas de dirección. Después de todo, los canales de control y las válvulas están llenos de agua, cebe las válvulas para bloquear los canales de flujo debajo de ellas. Aumentando primero la presión de aire a 15 PSI, luego en el programa de vista de laboratorio a través de un conjunto de interruptores de encendido y apagado conectados a válvulas solenoides individuales.
Active todas las válvulas encendiendo todos los botones del interruptor para asegurarse de que todas las válvulas estén abiertas. Conecte un tubo a una de las entradas de flujo y, a cuatro o cinco PSI, fluya aire hacia el dispositivo. Esto liberará las válvulas pegajosas del portaobjetos de vidrio.
El dispositivo ya está preparado y listo para su visualización. El colorante alimentario amarillo se utiliza para visualizar los reactivos en esta sección y la solución incolora representa a los hippies para facilitar el autoensamblaje de una matriz de proteínas en la superficie y evitar la absorción inespecífica dentro del dispositivo microfluídico, modificando químicamente la superficie conectando primero un nuevo tubo con la solución requerida a uno de los canales de flujo del dispositivo. A continuación, conecte el lado libre del tubo al colector manual y abra el flujo de presión de aire.
Cargue 40 microlitros de BSA oxidado con biotina en un tubo nuevo y fluya aproximadamente la mitad a través del dispositivo durante 20 minutos. Use 50 milimolares hippies para lavar cualquier sustrato no reactivo entre cada uno de los pasos. A continuación, fluya 25 microlitros de estreptavidina durante 20 minutos.
Encima de la BSA eludada con biotina, lavar con hees durante cinco minutos para comer la superficie que rodea el botón, cerrar la válvula del botón y fluir el resto de la BSA biotinilada, y luego lavar con el guisante nuevamente durante cinco minutos. Finalmente, para crear una matriz de etiquetas anti silbidos debajo del botón, suelte la válvula del botón y haga fluir 30 microlitros de biotina Penta hiss durante 20 minutos para crear una matriz de proteínas en el dispositivo. Abra las válvulas del cuello y fluya el reticulocito de conejo.
Solución de reacción de transcripción y traducción acoplada rápidamente a través del dispositivo a la cámara de ADN. A continuación, cierre las válvulas sándwich para separar cada gen de su entorno e incube el dispositivo en una placa caliente durante 2,5 horas a 30 grados centígrados. A continuación, etiquete el extremo terminal de las proteínas con el anticuerpo C mix SI 3.
Por último, utilizando un escáner de microarrays con un láser de 532 nanómetros y un filtro de emisión de 575 nanómetros. Determina los niveles de proteína. Esta figura muestra los diferentes niveles de expresión de proteínas en una matriz de proteínas.
Por lo general, el 20% de una biblioteca de genes no se expresa a niveles detectables. Los niveles de fondo se determinaron utilizando cámaras que no estaban manchadas con ADN. Por lo tanto, las señales de las cámaras de proteínas correspondientes se deben al ruido o a la absorción inespecífica de los anticuerpos de marcado.
Si se realiza correctamente, la verificación del dispositivo tarda cuatro horas y el experimento del chip tarda cinco horas.
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Visión general
Este estudio presenta un enfoque microfluídico para la expresión de matrices de proteínas, utilizando un dispositivo con miles de cámaras de reacción controladas por válvulas micromecánicas. La integración de una biblioteca de genes impresa en microarray permite la transcripción y traducción en chip, resultando en una matriz de proteínas lista para usar.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Microfluidics
- Expresión de proteínas
- Bibliotecas de genes
Antecedentes
- Las matrices de proteínas son esenciales para varios ensayos biológicos.
- Los métodos tradicionales a menudo requieren pasos de purificación, limitando la compatibilidad.
- Los dispositivos microfluídicos pueden agilizar el proceso de expresión de proteínas.
- La PCR de ensamblaje se utiliza para generar genes sintéticos para la matriz.
Propósito del estudio
- Crear una matriz de proteínas modular sin pasos de purificación.
- Mejorar la compatibilidad con cualquier biblioteca de proteínas.
- Mejorar la eficiencia de la expresión de proteínas utilizando microfluídica.
Métodos utilizados
- Generación de genes sintéticos a través de PCR de ensamblaje.
- Disposición de genes sintéticos en diapositivas de epoxi.
- Fabricación de un dispositivo microfluídico usando PDMS.
- Flujo de lisado de reticulocitos de conejo en el dispositivo para la expresión de proteínas.
Resultados principales
- Se creó con éxito un dispositivo microfluídico funcional.
- Las proteínas se expresaron en chip sin purificación.
- El método demostró compatibilidad con varias bibliotecas de proteínas.
- La transcripción y traducción en chip se lograron eficazmente.
Conclusiones
- Este enfoque microfluídico simplifica la creación de matrices de proteínas.
- Elimina la necesidad de purificación, mejorando la usabilidad.
- La técnica puede aplicarse a diversas bibliotecas de proteínas para la investigación.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This microfluidic protein expression platform enables high-throughput generation of functional protein arrays without purification, addressing a key bottleneck in target validation and interaction screening. By maintaining proteins in a native, non-denatured state on-chip, the method supports reliable detection of protein-protein, protein-DNA, and protein-RNA interactions. This capability enhances predictive confidence in early discovery by reducing false negatives from protein loss or misfolding during purification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional target validation by expressing full-length proteins with correct folding and post-translational modifications.
- Operational Value: Eliminates purification steps, reducing sample loss and increasing throughput for large-scale library screening.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by providing quantitative expression data for thousands of variants in parallel.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized protein arrays directly from DNA templates, ensuring batch-to-batch consistency for reproducible interaction assays.
- Operational Value: Integrates gene arraying and protein expression on a single microfluidic device, minimizing hands-on time and cross-contamination risk.
- Assay Readiness: Produces quantifiable fluorescent readouts compatible with microarray scanners for high-density interaction mapping.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables rapid profiling of protein interactions across disease-relevant targets identified in upstream omics studies.
- Biomarker Alignment: Supports screening for autoantibodies or therapeutic binding events using patient-derived samples on expressed antigen arrays.
- Preclinical De-risking: Allows early assessment of off-target binding or cross-reactivity profiles before advancing candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from synthetic gene library preparation to interaction screening, enabling a seamless transition from target identification to lead validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by expressing arrayed genes to assess functional protein activity without purification bias.
- Screening: Delivers standardized, fresh protein arrays ready for immediate use in biochemical or biophysical interaction assays.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence-based readouts that allow comparison of expression levels and binding affinities across thousands of conditions.
- Translational Research: Connects genetic variants to functional protein outputs, enabling correlation with phenotypic or clinical data.
- Enterprise Reuse: The microfluidic platform can be reprogrammed with new DNA arrays, supporting iterative screening campaigns across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by expressing proteins in a native state, reducing artifacts from purification or denaturation.
- Operational Value: Enables parallel processing of thousands of reactions in a compact footprint, improving reagent efficiency and throughput.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions by rapidly generating interaction data for large variant libraries.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on comprehensive interaction profiles and expression fidelity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, including PDMS molding and layer alignment.
- Depends on access to microarray spotting equipment for DNA array generation and microfluidic control systems (e.g., LabVIEW with solenoid valves).
- Necessitates standardized protocols for gene library preparation, including assembly PCR and epitope tagging for detection.
- Involves optimization of incubation times and reagent concentrations (e.g., rabbit reticulocyte lysate, biotinylated reagents) for specific protein expression goals.
- Limited by the accessibility of microfluidic fabrication facilities and the technical skill required for precise layer alignment and bonding.
