Name: Microscopía correlativa de luz y electrónica de doble color para la visualización de interacciones entre mitocondrias y lisosomas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T13:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Aprende a utilizar microscopía correlativa de luz y electrónica de doble color para visualizar interacciones entre mitocondrias y lisosomas en células HeLa. Este método avanza el estudio del control de calidad mitocondrial.

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Esta investigación fue apoyada por el programa de investigación básica KBRI a través del Instituto de Investigación del Cerebro de Corea financiado por el Ministerio de Ciencia y TIC (24-BR-01-03). Los plásmidos TMEM192-V5-APEX2 fueron amablemente proporcionados por Hyun-Woo Rhee (Universidad Nacional de Seúl). Los datos de TEM se adquirieron en las instalaciones centrales de investigación del cerebro en KBRI.

El flujo de trabajo paso a paso para la preparación de muestras se muestra en Figura 1.
1. Cultivo celular y transfección
<ol>
	<li>Cultivo de células HeLa a una densidad de 1 × 105 células en placas de cultivo de 35 mm con fondo de rejilla de vidrio que contienen DMEM con 10% de suero fetal bovino y 100 U/mL de penicilina y estreptomicina a 37 °C.</li>
	<li>Al día siguiente de sembrar las células, cotransfecte las células con una confluencia del 30%-40% con los plásmidos TMEM192-V5-APEX2 y Mito-mEosEM utilizando el reactivo de transfección de acuerdo con las instrucciones del fabricante (1 μg de ADN de TMEM192-V5-APEX2 y plásmido Mito-mEosEM con 3 μL de reactivo de transfección). Después de la transfección, tratar las células con DMSO o U18666A (2 μg/mL) y bafilomycin A1 (100 nM) durante 18 h.</li>
</ol>
2. Imágenes microscópicas confocales
<ol>
	<li>Después de tratar las células con bafilomycina y U18666A durante 18 h, retire el medio de cultivo y agregue inmediatamente 250 μL de solución fijadora tibia (30 °C-37 °C) (2,5% de glutaraldehído y 2% de paraformaldehído en una solución de cacodilato de sodio 0,1 M [pH 7,0]) mediante un pipeteo suave. Retire inmediatamente el fijador, reemplácelo con 1,5 ml de fijador nuevo e incube en hielo durante 30 minutos. A continuación, lave las células durante 3 x 10 min en 1 mL de tampón de cacodilato de sodio 0,1 M helado. 
	NOTA: Los vapores de aldehído son tóxicos. Todos los experimentos deben realizarse en una campana extractora ventilada.</li>
	<li>Añadir 1 mL de solución fría de glicina 20 mM para apagar el aldehído e incubar en hielo durante 10 min. Lavar 3 x 10 min con tampón de cacodilato de sodio 0,1 M frío.</li>
	<li>Prepare una solución fresca que contenga 300 μM de Amplex-Red añadiendo 10 mM deH2O2 a una solución de cacodilato de 0,1 M. Añada 500 μL de solución Amplex-Red a la placa de muestra e incube durante 5 minutos en hielo.</li>
	<li>Retire la solución Amplex-Red y enjuague 3 x 10 min con tampón de cacodilato de sodio 0,1 M.</li>
	<li>Después de la tinción Amplex-Red, utilice un microscopio confocal para obtener imágenes del área alrededor de las células de interés en el modo de escaneo de mosaico de 3 x 3. Capture tanto el contraste de interferencia diferencial (DIC) como la señal de fluorescencia para identificar y registrar la cuadrícula y las letras en el plato de la cuadrícula utilizando un objetivo de 40x (o 60x). 
	NOTA: Estas imágenes de descripción general sirven como un mapa para identificar células objetivo específicas en las muestras incrustadas en plástico.</li>
	<li>Visualice las celdas objetivo con un aumento alto utilizando un objetivo de 40x (o 60x) y adquiera una imagen de pila Z. 
	NOTA: Esta imagen de gran aumento se superpone a una imagen de microscopio electrónico para crear una imagen correlativa.</li>
</ol>
3. Preparación de la muestra para el bloque EM
<ol>
	<li>Después de la imagen de LM, añadir 1 mL de tetróxido de osmio reducido al 1% (preparado conteniendo un 3% de ferrocianuro de potasio en tampón de cacodilato 0,3 M con un volumen igual de tetróxido de osmio acuoso al 2%) para la postfijación a 4 °C durante 1 h, y luego enjuagar durante 3 x 10 min con agua destilada a 4 °C. 
	NOTA: Los vapores de tetróxido de osmio son tóxicos. Todos los experimentos deben realizarse en una campana extractora ventilada.</li>
	<li>Enjuague 3 x 10 min con agua destilada a temperatura ambiente, luego deshidrate en una serie de etanol graduado durante 15 min cada vez (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% y 100%) a temperatura ambiente.</li>
	<li>Mezcle etanol con resina epoxi en proporciones de volumen de 3:1, 1:1 y 1:3, preparando un total de 300 μL de cada mezcla. Vierte cada resina epoxi en el plato, dejándola incubar a temperatura ambiente durante 1 h. A continuación, utiliza la resina epoxi 100% para la impregnación durante la noche.</li>
	<li>Prepare la cápsula de inclusión o el tubo de PCR llenándolo con resina epoxi fresca, coloque el tubo o la cápsula boca abajo en la región de interés y colóquelo en un horno a 60 °C durante 48 h para polimerizar.</li>
</ol>
4. Seccionamiento e imágenes TEM
<ol>
	<li>Después de que la resina epoxi se haya polimerizado por completo, separe el vidrio inferior del bloque de polímero sumergiéndolo en nitrógeno líquido.</li>
	<li>Coloque el bloque de muestras en el portamuestras del ultramicrótomo y colóquelo en el bloque de recorte. Usa una cuchilla de afeitar para recortar la resina en forma trapezoidal o rectangular alrededor del objeto de interés.</li>
	<li>Coloque el bloque de muestras recortado en el portamuestras y ajuste el disco de diamante. Asegúrese de que el borde delantero del bloque de muestras esté perfectamente paralelo al borde del disco de diamante.</li>
	<li>Con un ultramicrótomo, corte secciones ultrafinas de aproximadamente 60-70 nm de las celdas incrustadas planas. Recoja las secciones en serie en una rejilla de ranura recubierta de formvar y séquelas en una placa caliente.</li>
	<li>Teñir la sección con el tinte de contraste durante 2 minutos y el citrato de plomo durante 1 minuto.</li>
	<li>Coloque la rejilla en el portamuestras TEM para su observación. Identifique la célula objetivo de interés en función de la imagen DIC del microscopio óptico. Visualice toda el área de la celda utilizando imágenes superpuestas en mosaico con un aumento de 1.700x.</li>
</ol>
5. Costura de imágenes con imageJ Fiji.
<ol>
	<li>Para comenzar a unir imágenes, inicie imageJ Fiji25 y haga clic en Archivo | Nuevo | TrakEM2 (en blanco) | Seleccione la carpeta de almacenamiento para crear un nuevo proyecto TrakEM226 (Figura 2A1).</li>
	<li>Abra el conjunto de datos de imágenes de teselas arrastrando y soltando los datos de imagen de teselas sin procesar en el espacio de trabajo (Figura 2A2).</li>
	<li>Haga clic con el botón derecho del ratón y seleccione Alinear | Montar todas las imágenes de esta capa | elastic (correspondencias de bloques no lineales) y, a continuación, haga clic en Aceptar para aceptar los parámetros restantes de los valores predeterminados (Figura 2A3).</li>
	<li>Haga clic con el botón derecho del ratón y seleccione Exportar | Crear imagen plana para crear una imagen cosida y, a continuación, haga clic en Archivo | Guardar como para guardar la imagen.</li>
</ol>
6. Cambiar el tamaño de la imagen de fluorescencia
<ol>
	<li>Abra el software de ampliación de fotos (consulte la tabla de materiales). Haga clic en Archivo | Abra y seleccione la imagen de fluorescencia.</li>
	<li>Introduzca la anchura y la altura para que sean del mismo tamaño que la imagen del microscopio electrónico, y seleccione el algoritmo que se aplicará en el método de cambio de tamaño (Figura 2B1).</li>
	<li>Haga clic en Archivo | Guardar COMO para guardar la imagen redimensionada.</li>
</ol>
7. Registro de imágenes basado en puntos de referencia con el plugin Big Warp
<ol>
	<li>Abra ImageJ Fiji y arrastre y suelte la micrografía de fluorescencia redimensionada (imagen FM) y la micrografía electrónica cosida (imagen EM).</li>
	<li>Haga clic en Plugins | Visor de BigData | Big Wrap para iniciar el registro, luego haga clic en el menú desplegable para seleccionar la imagen FM como imagen en movimiento y la imagen EM como imagen de destino (Figura 2C1). 
	NOTA: Cada imagen FM y EM tendrá tres nuevas ventanas emergentes (Imagen en movimiento de BigWrap, Imagen fija de BigWrap y Puntos de referencia) para mostrar puntos de referencia.</li>
	<li>Compare las imágenes FM y EM utilizando funciones como zoom (rueda del ratón), rotación de la imagen (mover el ratón mientras se mantiene pulsado el botón izquierdo) y mover (mover el ratón mientras se mantiene pulsado el botón derecho) y, a continuación, pulse la barra espaciadora del teclado para activar el modo de referencia, y pulse el botón izquierdo del ratón para marcar al menos tres puntos de referencia identificados en las imágenes FM y EM ( Figura 2C2, puntos rosas y flecha roja).</li>
	<li>Después de marcar todos los puntos de referencia identificados, vaya a Archivo | Exportar imagen en movimiento | OK y aparecerá una nueva ventana emergente con la imagen FM transformada (Figura 2C3). 
	NOTA: La ventana emergente recién creada es una imagen FM transformada en función del punto de referencia. Revise la alineación y realice ajustes, si es necesario, agregando o modificando puntos de referencia y volviendo a calcular la transformación.</li>
	<li>Haga clic en Archivo | Guardar como para guardar la imagen FM transformada.</li>
</ol>
8. Superposición de imágenes CLEM
<ol>
	<li>En ImageJ, arrastre y suelte la imagen FM transformada y la imagen EM unida.</li>
	<li>Haga clic en la imagen | Tipo | Color de 8 bits para establecer el mismo tipo de imagen para las imágenes LM y EM (Figura 2D1). 
	NOTA: La imagen EM debe convertirse dos veces en el siguiente orden: 8 bits -> color RGB -> color de 8 bits.</li>
	<li>Haga clic en la imagen | Color >| Fusionar canales para combinar las imágenes en una imagen compuesta seleccionando las imágenes FM y EM en el menú desplegable, respectivamente (Figura 2D2).</li>
	<li>Haga clic en Archivo | Guardar como para guardar la imagen CLEM.</li>
</ol>

Correlative Microscopy Reveals Stress-Induced Mitochondria-Lysosome Interactions

<ol><li>Giacomello, M., Pyakurel, A., Glytsou, C., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+mitochondrial+membrane+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of mitochondrial membrane dynamics.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (4), 204-224 (2020).</li>
<li>Spinelli, J. B., Haigis, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+contributions+of+mitochondria+to+cellular+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism.</a> Nat Cell Biol. 20 (7), 745-754 (2018).</li>
<li>Lopez, J., Tait, S. W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+apoptosis%3A+Killing+cancer+using+the+enemy+within%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial apoptosis: Killing cancer using the enemy within.</a> Br J Cancer. 112 (6), 957-962 (2015).</li>
<li>Wang, C., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondria+in+apoptosis%2A%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondria in apoptosis*.</a> Annu Rev Genet. 43, 95-118 (2009).</li>
<li>Rossi, A., Pizzo, P., Filadi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium%2C+mitochondria+and+cell+metabolism%3A+A+functional+triangle+in+bioenergetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Calcium, mitochondria and cell metabolism: A functional triangle in bioenergetics.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (7), 1068-1078 (2019).</li>
<li>Giorgi, C., Marchi, S., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+machineries%2C+regulation+and+cellular+functions+of+mitochondrial+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The machineries, regulation and cellular functions of mitochondrial calcium.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (11), 713-730 (2018).</li>
<li>Talari, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-droplet+associated+mitochondria+promote+fatty-acid+oxidation+through+a+distinct+bioenergetic+pattern+in+male+wistar+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Lipid-droplet associated mitochondria promote fatty-acid oxidation through a distinct bioenergetic pattern in male wistar rats.</a> Nat Commun. 14 (1), 766(2023).</li>
<li>Enkler, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arf1+coordinates+fatty+acid+metabolism+and+mitochondrial+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Arf1 coordinates fatty acid metabolism and mitochondrial homeostasis.</a> Nat Cell Biol. 25 (8), 1157-1172 (2023).</li>
<li>Trivedi, P. C., Bartlett, J. J., Pulinilkunnil, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+biology+and+function%3A+Modern+view+of+cellular+debris+bin%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Lysosomal biology and function: Modern view of cellular debris bin.</a> Cells. 9 (5), 1131(2020).</li>
<li>Mony, V. K., Benjamin, S., O'Rourke, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lysosome-centered+view+of+nutrient+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">A lysosome-centered view of nutrient homeostasis.</a> Autophagy. 12 (4), 619-631 (2016).</li>
<li>Thelen, A. M., Zoncu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+for+the+lysosome+in+lipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Emerging roles for the lysosome in lipid metabolism.</a> Trends Cell Biol. 27 (11), 833-850 (2017).</li>
<li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-lysosome-related+organelles+mediate+mitochondrial+clearance+during+cellular+dedifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-lysosome-related organelles mediate mitochondrial clearance during cellular dedifferentiation.</a> Cell Rep. 42 (10), 113291(2023).</li>
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<li>Pickrell, A. M., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+pink1%2C+parkin%2C+and+mitochondrial+fidelity+in+parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The roles of pink1, parkin, and mitochondrial fidelity in parkinson's disease.</a> Neuron. 85 (2), 257-273 (2015).</li>
<li>Wong, Y. C., Peng, W., Krainc, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+regulation+of+inter-mitochondrial+contact+fate+and+motility+in+charcot-marie-tooth+type+2%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Lysosomal regulation of inter-mitochondrial contact fate and motility in charcot-marie-tooth type 2.</a> Dev Cell. 50 (3), 339-354.e4 (2019).</li>
<li>Peng, W., Wong, Y. C., Krainc, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-lysosome+contacts+regulate+mitochondrial+Ca%282%2B%29+dynamics+via+lysosomal+trpml1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-lysosome contacts regulate mitochondrial Ca(2+) dynamics via lysosomal trpml1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (32), 19266-19275 (2020).</li>
<li>Juhl, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+membrane+contact+sites+for+sterol+transfer+between+endo-lysosomes+and+mitochondria+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of membrane contact sites for sterol transfer between endo-lysosomes and mitochondria in living cells.</a> Sci Rep. 11 (1), 8927(2021).</li>
<li>Khalil, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specialized+pathway+for+erythroid+iron+delivery+through+lysosomal+trafficking+of+transferrin+receptor+2%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Adv%22%5BJournal%5D)">A specialized pathway for erythroid iron delivery through lysosomal trafficking of transferrin receptor 2.</a> Blood Adv. 1 (15), 1181-1194 (2017).</li>
<li>Russell, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3d+correlative+light+and+electron+microscopy+of+cultured+cells+using+serial+blockface+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">3d correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy.</a> J Cell Sci. 130 (1), 278-291 (2017).</li>
<li>Van Rijnsoever, C., Oorschot, V., Klumperman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light-electron+microscopy+%28clem%29+combining+live-cell+imaging+and+immunolabeling+of+ultrathin+cryosections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Correlative light-electron microscopy (clem) combining live-cell imaging and immunolabeling of ultrathin cryosections.</a> Nat Methods. 5 (11), 973-980 (2008).</li>
<li>Loginov, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+organelle+microscopy%3A+Fluorescence+guided+volume+electron+microscopy+of+intracellular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlative organelle microscopy: Fluorescence guided volume electron microscopy of intracellular processes.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 829545(2022).</li>
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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.

Este protocolo describe CLEM de dos colores para observar la interacción de mitocondrias y lisosomas en células fijas utilizando etiquetas mEosEM y APEX2 codificadas genéticamente. En las últimas décadas, los avances en microscopía han mejorado enormemente la capacidad de observar cambios en las redes de orgánulos32,33, y el estudio de las interacciones de orgánulos se ha vuelto cada vez más interesante. La microscopía de superresolución se ha utilizado para observar cambios en los contactos altamente dinámicos entre las mitocondrias y los lisosomas 34,35,36. Sin embargo, a pesar del uso de microscopía de superresolución, es difícil distinguir los cambios en el grosor de las membranas mitocondriales internas y externas (aproximadamente 22 nm) y las uniones de las crestas (aproximadamente 28 nm)37. La microscopía electrónica de transmisión tiene la ventaja de poder observar la estructura de las muestras biológicas a muy alta resolución, pero tiene la desventaja de que las imágenes solo se pueden ver en blanco y negro, lo que dificulta la distinción de orgánulos en imágenes complejas. En nuestro protocolo, utilizamos un método CLEM que combina las ventajas de la microscopía óptica y electrónica para monitorear la interacción de dos orgánulos diferentes tiñéndolos con diferentes colores. En particular, el CLEM de dos colores es una herramienta invaluable para observar y analizar la mitofagia, el proceso de degradación mitocondrial dentro de los lisosomas, como se muestra en la Figura 3.
Las imágenes de células vivas generalmente se realizan en condiciones fisiológicas, lo que permite a los investigadores observar los procesos celulares dinámicos en tiempo real. Sin embargo, las técnicas de microscopía electrónica a menudo requieren procedimientos de preparación de muestras que requieren mucho tiempo, incluida la fijación y la tinción. El retraso de tiempo entre la obtención de imágenes de células vivas y la preparación de muestras de microscopía electrónica limita la resolución temporal de la técnica y puede dar lugar a eventos celulares dinámicos potencialmente perdidos. Para superar la limitación de la CLEM de células vivas, hemos desarrollado un método CLEM de dos colores en el que la sonda mEosEM23 y el colorante químico (Amplex-Red) se tiñen con la enzima de marcaje de proximidadAPEX2 38 sin perder la señal de fluorescencia incluso en entornos fijadores hostiles. En un estudio CLEM de células vivasanterior 39, se encontraron discrepancias entre las señales de fluorescencia y las imágenes EM debido a problemas de resolución temporal en el muestreo TEM después de imágenes de células vivas y limitaciones técnicas en la preparación de muestras. Sin embargo, al adquirir imágenes de fluorescencia de células fijas durante un tiempo suficiente (imágenes de pila z de células enteras con un gran aumento), podemos resolver el problema de la resolución temporal y mejorar la correlación entre las imágenes LM y EM (Figura 3 y Figura 4).
Otro factor clave para obtener resultados exitosos de CLEM es cómo registrar con precisión la imagen LM con la imagen EM. Para hacer esto, primero usamos una combinación de modos de imágenes de fluorescencia y DIC durante las imágenes de microscopía óptica para crear un mapa de navegación alrededor de las células objetivo. Usando este mapa de navegación, pudimos identificar fácilmente las células de interés en el ultramicrotomo y TEM. En segundo lugar, al adquirir imágenes de mosaico TEM de celdas enteras con gran aumento, pudimos obtener muchos puntos de referencia que podrían usarse para el registro de imágenes. En nuestra experiencia, cuanto mayor sea el número de puntos de referencia, mejor será la precisión de alineación de las imágenes LM y EM en el complemento Big Warp.
En este estudio, mostramos los dominios de interacción de lisosomas y mitocondrias con resultados de CLEM de alta resolución. Además, la sonda de doble color permitió una distinción precisa entre mitocondrias y lisosomas. Sin embargo, este método tiene algunas limitaciones. Primero, si el tiempo de reacción durante el etiquetado proximal de Amplex-Red por la enzima APEX2 es demasiado largo, el Amplex-Red se difundirá y se tiñirá más que la ubicación de la proteína diana38. En segundo lugar, el grosor (volumen del eje z) del área donde el lisosoma está envuelto en las mitocondrias es bastante pequeño, por lo que la fusión de las dos membranas de orgánulos no se puede determinar en una sección seriada de 50 nm de espesor. Además, es un desafío importante alinear con precisión el eje z de una sección óptica con un microscopio óptico y una sección mecánica con un ultramicrotomo. Para superar estas limitaciones, se puede utilizar CLEM de dos colores en combinación con la tomografía electrónica convencional40 o el volumen de sección en serie CLEM41.

Las mitocondrias y los lisosomas son los principales orgánulos unidos a la membrana que son esenciales para el mantenimiento de la homeostasis celular. Las mitocondrias son orgánulos celulares altamente dinámicos modulados por eventos de fisión y fusión1. En general, las mitocondrias se conocen como la fuente de energía de la célula y son conocidas por su importante papel en la fosforilación oxidativa, la producción de ATP y el almacenamiento de metabolitos como calcium2. Además de su papel en el metabolismo energético, las mitocondrias están involucradas en una serie de otros procesos de señalización celular, incluyendo la apoptosis3,4, calcium signaling5,6 y el metabolismo de los lípidos7,8. De manera similar, los lisosomas son orgánulos celulares altamente dinámicos que desempeñan múltiples funciones como centros de reciclaje celular para mantener la limpieza celular a través de la degradación de proteínas, la autofagia, la endocitosis y la fagocitosis9. Aparte de su papel en la degradación, los lisosomas también desempeñan funciones en la fisiología celular, como la detección de nutrientes, la homeostasis10, el metabolismo de los lípidos11 y la desdiferenciación celular12.
A pesar de la existencia de numerosos estudios sobre las funciones de los orgánulos celulares individuales, nuestra investigación reciente se ha concentrado en la interferencia menos comprendida entre las mitocondrias y los lisosomas, que se ha demostrado que influye tanto en la fisiología como en la patología celular. Los contactos entre las mitocondrias y los lisosomas se han observado en varios tipos de células, incluidas las células cancerosas, las neuronas y las células derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSC)13, y se observan principalmente bajo estrés celular o en enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Parkinson13,14 y la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth15. El contacto entre las mitocondrias y los lisosomas juega un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis metabólica a través del intercambio de iones (por ejemplo, Ca2+)16, cholesterol17 y iron18 entre los dos orgánulos. Además, el contacto entre las mitocondrias y los lisosomas desempeña un papel crucial en el control de calidad de los orgánulos celulares. Por ejemplo, las mitocondrias dañadas pueden ser objeto de degradación a través del proceso de mitofagia, en el que son engullidas por autofagosomas y entregadas a los lisosomas para su degradación. En consecuencia, se puede facilitar la eliminación de las mitocondrias disfuncionales antes de que causen más daño a la célula o a las mitocondrias normales. Esta interacción entre las mitocondrias y los lisosomas es crucial para mantener la homeostasis celular y prevenir la acumulación de orgánulos disfuncionales. Por lo tanto, solo las mitocondrias dañadas se eliminan selectivamente, lo que permite que las mitocondrias sanas funcionen de manera óptima dentro de la célula.
Microscopía correlativa de luz y electrónica (CLEM) es una técnica de imagen que recientemente ha recibido atención como método de investigación al combinar las ventajas de la microscopía óptica (LM) y la microscopía electrónica (EM) para proporcionar información estructural detallada a diferentes escalas. En CLEM, primero se obtienen imágenes de una muestra utilizando LM para identificar regiones específicas de interés, seguido de los pasos de preparación de la muestra EM, como la fijación, la deshidratación y la inclusión. A continuación, se observa la misma muestra bajo un microscopio electrónico. Aunque recientemente se han reportado métodos CLEM de células vivas19,20,21,22, sigue siendo un desafío combinar con precisión imágenes ópticas de muestras biológicas altamente dinámicas con imágenes de microscopía electrónica de células fijas en un solo plano. En el caso de los orgánulos altamente dinámicos, como las mitocondrias y los lisosomas, su localización precisa puede cambiar a medida que se observan en vivo bajo el microscopio óptico, y continúan moviéndose incluso durante el corto tiempo de retardo necesario para la fijación.
Por lo tanto, en este protocolo, se emplearon dos etiquetas moleculares diferentes que permanecen activas incluso dentro de soluciones fijadoras para visualizar la interacción entre las mitocondrias y los lisosomas, que desempeñan un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis metabólica a través del intercambio de iones (por ejemplo, Ca2+)16, cholesterol17 y iron18 entre estos orgánulos. Las construcciones TMEM192-V5-APEX2 y Mito-mEosEM se utilizaron para observar las interacciones de las mitocondrias y los lisosomas en células cultivadas a nivel de EM y LM. En el caso de las mitocondrias, se seleccionó la etiqueta mEosEM por su capacidad para preservar la señal de fluorescencia durante la preparación de la muestra EM en una solución fijadora y OsO423. En el caso de los lisosomas, se utilizó la etiqueta APEX2, una proteína de aproximadamente 28 kDa, para estudiar la localización de una proteína específica tanto a nivel de EM como de LM24. En presencia de peróxido de hidrógeno, el sustrato del APEX2, Amplex-Red, forma un polímero insoluble que se puede observar mediante microscopía confocal en la ubicación de la marca. En este protocolo, se utilizó CLEM de doble color para visualizar la estructura de las interacciones entre los lisosomas y las mitocondrias en células fijas.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Productos químicos y reactivos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25% Glutaraldehído</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>16200</td><td>Los humos de aldehído son extremadamente tóxicos. Úselo solo en la campana extractora.</td></tr><tr><td>Solución de peróxido de hidrógeno al 30%</td><td>Merck</td><td>107210</td><td></td></tr><tr><td>Solución de paraformaldehído al 4%</td> Los humos de ldehído <td>Biosesang</td><td>PC2031-100-00</td><td>son extremadamente tóxicos. Úselo solo en la campana extractora.</td></tr><tr><td>Amplex Red</td><td>ThermoFisher</td><td>A12222</td><td></td></tr><tr><td>Epon 812</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>Transfección de plásmidos</td></tr><tr><td>Glicina</td><td>SIGMA</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de plomo 3%</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>22410</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de osmio al 4 % solución acuosa</td><td>Electrónica Microscopy Sciences</td><td>16320</td><td>Muy tóxico. Úselo solo en la campana extractora.</td></tr><tr><td>Hexacianoferrato de potasio (II) trihidrato;</td><td>SIGMA</td><td>P3289</td><td></td></tr><tr><td>Cacodilato de sodio trihidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250-500G</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de uranilo</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>UranyLess Tinción EM</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>22409</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Construcción de plásmidos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mito-mEosEM</td><td>addgene</td><td>132706</td><td>DOI:&nbsp; 10.1016/j.chembiol.2024.02.007</td></tr><tr><td>TMEM192-V5-APEX2</td><td>Sharma N.&nbsp; et al.</td><td>N/A</td><td>DOI:&nbsp; 10.1016/j.chembiol.2024.02.007</td></tr><tr><td>Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 filtro de jeringa mmm</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Cubreobjetos cuadriculados</td><td>Mattek</td><td>P35G-1.5-14-CGRD</td><td></td></tr><tr><td>BEEM Cápsulas de Inclusión Ted</td><td>Pella</td><td>130</td><td></td></tr><tr><td>Formvar Soportado Rejilla de cobre de una ranura</td><td>Ted Pella</td><td>01705</td><td></td></tr> Cuchillo >de <tr><td>diamante</td><td>DiATOME</td><td>DU4530</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo ultramicroscópico</td><td>Leica</td><td>ARTOS Microscopía</td><td></td></tr> <tr><td>confocal invertida</td><td></td><<fuerte> <td></td> Invertida Nikon A1 Rsi/Ti-E <td></td></tr><tr><td>Microscopía electrónica de transmisión</td><td>FEI</td><td>Tecnai G2</td><td></td></tr><tr><td></td>Software y <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Algoritmos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji/Image J</td><td>NIH / código</td><td></td> abierto <td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Paquete de software ImageJ BigWarp</td><td>NIH / código</td><td></td> abierto <td>https://imagej.net/plugins/bigwarp</td></tr><tr><td>Photozoom Pro 8&nbsp;</td><td>BenVista</td><td></td><td>https://www.benvista.com/photozoompro Alternative software Image Resizer : https://imageresizer.com/ Gigapixel AI : https://www.topazlabs.com/gigapixel ON1 redimensiona : https://www.on1.com/products/resize-ai/</td></tr></tbody></table>

microscopía correlativa de luz y electrónica de doble color para la visualización de interacciones entre mitocondrias y lisosomas

Dual-color Correlative Light and Electron Microscopy for the Visualization of Interactions between Mitochondria and Lysosomes

Los orgánulos celulares, como las mitocondrias y los lisosomas, muestran estructuras dinámicas. A pesar de la mayor resolución de la microscopía electrónica de transmisión para el análisis estructural, la microscopía óptica es esencial para la visualización de orgánulos dinámicos mediante el etiquetado específico del objetivo. El siguiente protocolo describe un método que combina microscopía correlativa de luz y electrónica de doble color (CLEM) para observar las interacciones entre las mitocondrias y los lisosomas. En este estudio, las mitocondrias se marcaron con mEosEM (Mito-mEosEM) y los lisosomas con TMEM192-V5-APEX2. Los resultados obtenidos de las imágenes CLEM permiten observar los cambios en las interacciones entre mitocondrias y lisosomas en condiciones de estrés externo. El tratamiento con bafilomicicina (BFA), que inhibe la función lisosomal, dio lugar a un aumento del contacto entre las mitocondrias y los lisosomas, lo que llevó a la formación de mitocondrias fragmentadas atrapadas dentro de los lisosomas. Por el contrario, el tratamiento con U18666A, que inhibe la exportación de colesterol de los lisosomas, hizo que los lisosomas estuvieran rodeados de mitocondrias, lo que indica una forma distinta de interacción. Este estudio presenta un método eficaz para observar las interacciones entre las mitocondrias y los lisosomas en células fijas. Además, las imágenes CLEM con sondas de doble color ofrecen una poderosa herramienta para futuras investigaciones sobre la dinámica de los orgánulos y sus implicaciones para la función y la patología celular.

Para visualizar las interacciones entre mitocondrias y lisosomas utilizando este protocolo de microscopía electrónica de correlación de doble color, empleamos Mito-mEosEM y TMEM192-V5-APEX2. Primero se obtuvieron imágenes de células fijadas mediante microscopía óptica, seguido del muestreo y obtención de imágenes por microscopía electrónica. Los resultados de las imágenes correlacionadas se muestran en la Figura 3A,B y en la Figura 4A. Siguiendo el protocolo descrito anteriormente, verificamos si podíamos observar los cambios en la interacción entre mitocondrias y lisosomas bajo estrés externo.
El tratamiento de células con BFA, un inhibidor de la V-ATPasa lisosomal, inhibe la autofagia, lo que resulta en una calidad mitocondrial reducida y un aumento de las interacciones entre mitocondrias y lisosomas27. En células tratadas con BFA, observamos mitocondrias atrapadas dentro de lisosomas (Figura 3B), en comparación con células de control tratadas con DMSO (Figura 3A). Aunque es difícil distinguir mitocondrias electrondensas fragmentadas y compartimentos celulares dentro de lisosomas únicamente en micrografías electrónicas, pueden diferenciarse fácilmente en imágenes correlacionadas (Figura 3B1,B2). La estructura de alteración mitocondrial (Figura 3A1,A2; flecha azul) observada en las mitocondrias de células tratadas con DMSO no está relacionada con lisosomas, y la estructura en la imagen de fluorescencia que parece ser un lisosoma atrapado dentro de una mitocondria grande es una estructura en la que la mitocondria rodea al lisosoma (Figura 3A2; flecha roja).
A continuación, evaluamos los efectos de U18666A (2 µg/mL durante 18 h), un inhibidor bien conocido de NPC1 que bloquea el movimiento del colesterol fuera de los lisosomas28. Las células tratadas con U18666A mostraron un aumento en la interacción directa entre mitocondrias y lisosomas (Figura 4). Además, los contactos entre mitocondrias y lisosomas en muestras tratadas con U18666A fueron diferentes a los observados en muestras tratadas con BFA. En células HeLa tratadas con BFA, la mitocondria fragmentada queda completamente atrapada dentro del lisosoma, una morfología de mitofagia previamente descrita12,29. Sin embargo, en el grupo tratado con U18666A, algunos lisosomas positivos para TMEM192 parecen estar englobados por la mitocondria (Figura 4D,E)30,31.
<img alt="Flujo de trabajo de preparación e imagen de células: transfección, marcado con APEX2, microscopía confocal, análisis con microscopía electrónica de transmisión (TEM)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67020/67020fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figura 1"> 
Figura 1: Esquema general de la microscopía electrónica de transmisión (TEM) correlativa (CLEM) mediante el uso de una sonda fluorescente con etiqueta genética. (A) Las células HeLa se cultivaron en placas de cultivo de vidrio con rejilla de fondo de 35 mm. (B) Las células fijadas fueron marcadas con Amplex-Red mediante la proteína APEX2. (C) Se obtuvieron imágenes de fluorescencia con un microscopio confocal. Se utilizó una platina motorizada y la función de escaneo en mosaico para capturar una imagen general amplia y una imagen de alta resolución de la célula diana. La imagen amplia sirve como mapa de navegación para identificar la ubicación de la célula diana en especímenes embebidos en plástico. (D) Continuar con la postfijación y el embebido tras la deshidratación. (E) El embebido se realizó utilizando un tubo de PCR o una cápsula BEEM llenos de resina, colocados sobre la célula diana en el cubreobjetos. (F) Tras la polimerización de la resina, la eliminación del cubreobjetos dejó un patrón de rejilla impreso en la superficie inferior del bloque. (G) La célula diana se identificó mediante el patrón impreso en la superficie de la resina, y la célula diana fue seccionada con un grosor aproximado de 60 nm utilizando un ultramicrotomo. (H) Se recogieron secciones seriadas sobre una rejilla de cobre con ranura recubierta con formvar. (I) Las rejillas se analizaron mediante microscopía electrónica de transmisión. Abreviaturas: TEM = microscopía electrónica de transmisión; CLEM = microscopía correlativa de luz y electrones; ROI = región de interés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67020/67020fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Diagrama de procesamiento de imágenes: ensamblaje de imágenes, redimensionamiento de fluorescencia, registro de puntos de referencia, superposición CLEM." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67020/67020fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Procesamiento de imágenes y generación de la imagen CLEM utilizando ImageJ Fiji. (A1) Interfaz gráfica principal de Fiji y TrakEM2. (A2) Importación del conjunto de datos de imágenes en mosaico adquirido con MET a 1.700x de aumento. (A3) Alineación y ejemplo de una imagen ensamblada utilizando el método de alineación de imágenes de TrakEM2. (B1-B3) Conversión de una micrografía óptica pequeña en imágenes grandes de alta calidad utilizando software de ampliación fotográfica. (C1-C3) Flujo de trabajo para el registro entre imágenes de microscopía óptica e imágenes de microscopía electrónica utilizando el software del complemento Big Wrap. (D1-D3) El proceso de superposición de una imagen de FM transformada y una imagen de EM para sintetizar una imagen de microscopía correlacionada. Abreviaturas: TEM = microscopía electrónica de transmisión; CLEM = microscopía correlacionada de luz y electrones; FM = microscopía de fluorescencia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67020/67020fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Diagrama de microscopía confocal, MET, MICE; localización de mitocondrias y lisosomas; análisis de estructuras celulares." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67020/67020fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3: Imágenes de MICE de los sitios de contacto mitocondrial y lisosomal tratados con o sin bafilomicina A1. Células HeLa fueron co-transfectadas con Mito-mEosEM (mitocondrias; verde) y TMEM192-APEX2 (lisosomas; rojo) y luego teñidas con el colorante Amplex-Red. (A) Células HeLa no tratadas. La información molecular proveniente de la señal de fluorescencia (panel izquierdo) y la información ultraestructural obtenida mediante MET (panel central) se superpusieron (panel derecho) basándose en la señal y la morfología mitocondrial. (A1,A2) En células HeLa no tratadas, la membrana interna mitocondrial está interrumpida (flecha azul), o las mitocondrias y los lisosomas están muy próximos entre sí (flecha roja). (B1,B2) En células HeLa tratadas con bafilomicina A1 durante 18 h, se observó mitofagia, caracterizada por el atrapamiento de mitocondrias no degradadas en los lisosomas (flecha verde). Barras de escala = 1 µm (A1,A2,B1,B2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67020/67020fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Imágenes de microscopía confocal, MET y MELC de mitocondrias (verde) y lisosomas (rojo) en células." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67020/67020fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4: Imágenes de MELC de los sitios de contacto mitocondrial y lisosomal tratados con U18666A (A) Imágenes de MELC de dos colores de células HeLa que expresan Mito-mEosEM y TMEM192-V5-APEX2 (marcado con Amplex-Red) tras tratamiento con U18666A (2 µg/mL durante 18 h). (A1,A2) Las flechas rojas indican los sitios de contacto entre mitocondrias y lisosomas. Barras de escala = 1 µm. (B1-B3,C1-C3) La flecha roja indica la aparición de fusión entre orgánulos mediante imágenes seriadas. Barras de escala = 500 nm (B1-B3). Barras de escala = 1 µm (C1-C3). (D,E) Imágenes de MET de alta magnificación de los sitios de fusión entre mitocondrias y lisosomas. Se utilizaron pseudocolores para distinguir entre mitocondria (verde) y lisosoma (rojo). Barras de escala = 100 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67020/67020fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este protocolo describe un mecanismo para utilizar la microscopía óptica y electrónica correlativa para visualizar la interacción de mitocondrias y lisosomas marcados con mEosEM y APEX2, respectivamente.

Microscopía correlativa de luz y electrónica de doble color para la visualización de interacciones entre mitocondrias y lisosomas

Cellular organelles, such as mitochondria and lysosomes, display dynamic structures. Despite the higher resolution of transmission electron microscopy for ...

dual-color-correlative-light-electron-microscopy-for-visualization

Research

Investigación

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La mitofagia es el principal mecanismo de control de calidad mitocondrial. Sin embargo, la evaluación de la mitofagia in vivo se ve obstaculizada por la falta de ensayos cuantitativos fiables. Aquí se presenta un protocolo para la observación de la mitofagia en células vivas utilizando un colorante mitocondrial verde-fluorescente permean celular y un colorante lisosómico rojo-fluorescente.

Visualización de la mitofagia con tintes fluorescentes para mitocondrias y lisosomas

Aquí, presentamos un protocolo para la microscopía correlativa de luz-electrónica optimizada en sección basada en el marcaje endógeno y fluorescente como herramienta para investigar la localización de proteínas raras en relación con la ultraestructura celular. El poder de este enfoque se demuestra mediante la localización ultraestructural de LC3 endógena en células hambrientas sin tratamiento con bafilomycina.

Localización ultraestructural de LC3 endógena mediante microscopía óptica correlativa en sección

Explorar la mitofagia a través de microscopía electrónica, sensores genéticos e inmunofluorescencia requiere equipos costosos, personal calificado y una inversión de tiempo significativa. Aquí, demostramos la eficacia de un kit de colorante de fluorescencia comercial para cuantificar el proceso de mitofagia tanto en Caenorhabditis elegans como en una línea celular de cáncer de hígado.

Detección de mitofagia en Caenorhabditis elegans y células de mamíferos utilizando colorantes específicos de orgánulos

Este protocolo presenta un flujo de trabajo para la propagación, diferenciación y tinción de células SH-SY5Y cultivadas y neuronas primarias del hipocampo de rata para la visualización y el análisis de la ultraestructura mitocondrial mediante microscopía de agotamiento de emisiones estimuladas (STED).

Uso de imágenes de células vivas de STED para visualizar la ultraestructura de la membrana interna mitocondrial en modelos de células neuronales

Aprende a utilizar microscopía correlativa de luz y electrónica de doble color para visualizar interacciones entre mitocondrias y lisosomas en células HeLa. Este método avanza el estudio del control de calidad mitocondrial.

Microscopía correlativa de luz y electrónica de doble color para la visualización de interacciones entre mitocondrias y lisosomas (Video) | JoVE Journal

Microscopía correlativa de luz y electrónica de doble color para la visualización de interacciones entre mitocondrias y lisosomas

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