Microscopía correlativa para el análisis estructural en 3D de Interacciones Dinámicas

El objetivo general de este procedimiento es demostrar el uso de la luz fluorescente correlativa y el método de criomicroscopía electrónica mediante la obtención de imágenes dinámicas de pequeñas partículas de VIH uno que interactúan con las células hela del huésped. Esto se logra primero colocando y cultivando células de heela en la rejilla EM del buscador de oro en una placa de cultivo con fondo de vidrio e infectando las células de heela con partículas de VIH 1 marcadas con GFP. El segundo paso es recopilar imágenes confocales confocales de células vivas en 3D de alta velocidad y lapso de tiempo de células infectadas por VIH uno, y analizar las imágenes mediante el seguimiento automatizado de partículas 3D para la dinámica de partículas individuales después de vitrificar.

La muestra, las mismas partículas virales de los datos de imágenes de células vivas se encuentran en imágenes criofluorescentes para un análisis adicional de tomografía crioelectrónica 3D de alta resolución. El paso final es recopilar series de proyección crioelectromagnética inclinadas para todas las posiciones identificadas que contienen partículas de VIH one y reconstruir toms 3D con un algoritmo de proyección posterior ponderada utilizando el software imad. En última instancia, la microscopía de fluorescencia correlativa de células vivas 3D avanzada y la tomografía crioelectrónica de alta resolución se utilizan para visualizar directamente partículas virales limitadas por difracción dinámica y sus interacciones con las células huésped.

Nuestro trabajo está dirigido a desarrollar un método de correlación que permita la visualización directa de solo eventos de infección por VIH uno. Al combinar microscopía fluorescente de células vivas, microscopía criofluorescente y tomografía crioelectrónica de esta manera, las señales de células vivas y criofluorescentes se pueden utilizar para guiar en gran medida el muestreo en la tomografía crioelectrónica. Además, la información estructural obtenida de la criotomografía electrónica se puede complementar con los datos funcionales dinámicos disponibles a través de imágenes de estilo de vida de objetivos marcados con fluorescencia. La principal ventaja de esta técnica o método existente es que se aplican imágenes de estilo de vida 3D correlativas avanzadas de alta velocidad con un enfoque de tomografía electrónica de coral 3D de alta resolución para estudiar eventos dinámicos que son por naturaleza difíciles de detectar, como el VIH tipo uno y las interacciones de la célula huésped en la etapa temprana de la infección.

Para preparar la rejilla para el cultivo celular, descargue el lado de carbono de una lámina R de 200 malla dos sobre dos cuantitos, rejilla de búsqueda EM dorada por debajo de 25 miliamperios durante 25 segundos durante 25 segundos. Cubra la rejilla EM con fibra nin flotándola con el lado de carbono hacia abajo sobre una gota de 40 microlitros de 50 microgramos por solución de fibra nin mililitro. Déjelo en una campana de cultivo de tejidos bajo luz ultravioleta durante dos horas para la desinfección de la placa de células hela en la rejilla a una densidad de dos veces 10 a la cuarta célula por mililitro en una placa de cultivo con fondo de vidrio.

En DMEM con suplementos apropiados, incubar las células a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente 18 horas antes de la infección por VIH una antes de la infección por VIH, agregar un rastreador de células fluorescentes a las células hela en la placa de cultivo con fondo de vidrio e incubar la placa a 37 grados Celsius durante 10 minutos para permitir la absorción del tinte fluorescente, lavar las celdas con PBS y agregar 50 microlitros de medio fresco precalentado. Coloque la placa en la cámara de células vivas a 37 grados Celsius de un microscopio de escáner confocal de campo barrido. Dado que la crioelectromagnética requiere regiones relativamente delgadas de la muestra.

Seleccione varios campos que contengan de una a tres celdas por cuadrado, con las celdas entre dos fases de mitosis cuando estén más dispersas y almacene estas posiciones con el software de elementos NIS para futuras imágenes. A continuación, infecte las células con VSVG, partículas de VIH uno pseudotipadas que contienen G-F-P-V-P-R y las partículas del virus en el pozo inferior de la placa, teniendo cuidado de no perturbar la rejilla EM. Dado que las posiciones para la obtención de imágenes ya se han seleccionado y almacenado inmediatamente después de la adición de las varias, recopile imágenes confocales 3D de alta velocidad de lapso de tiempo en las posiciones previamente seleccionadas durante 20 a 40 minutos.

Inmediatamente después de la obtención de imágenes confocales de células vivas, coloque la placa de cultivo en un bloque de cobre enfriado con hielo y transfiérala a la sala de preparación de muestras crioelectromagnéticas. Cargue la rejilla EM en las pinzas especializadas, seque rápidamente el medio de cultivo residual con papel de filtro y colóquelo inmediatamente en la rejilla para microlitros de una solución de perlas de oro de 15 nanómetros mezclada con microesferas fluorescentes de 0,2 micras. Las microesferas fluorescentes se utilizan para ayudar a la correlación entre fluorescentes y crio-EM.

Cargue las pinzas en el dispositivo de vitrificación para la congelación por inmersión con los parámetros de transferencia optimizados para lograr los mejores resultados. Para comenzar el procedimiento de microscopía de luz de criofluorescencia, conecte una línea de gas nitrógeno seco a un manguito colocado sobre la lente del objetivo para mantener la lente caliente y libre de heladas, monte una etapa de muestra de criofluorescencia construida en casa en un microscopio de luz de fluorescencia invertida. Conecte la entrada de nitrógeno líquido de la etapa de muestra criogénica al hacedor autopresurizado y coloque la salida de protección contra desbordamiento de nitrógeno líquido en un recipiente apropiado.

Coloque la rejilla de muestra hidratada congelada en el cartucho de muestra EM en el bloque de cobre y coloque un anillo de clip C preenfriado en la parte superior para mantener la rejilla en su lugar. Coloque el cartucho en la cámara interna de la búsqueda de la etapa criogénica y encuentre las mismas partículas de virus a partir de los datos de imágenes de células vivas. Dado que la cuadrícula EM tiene un índice, es sencillo localizar la misma partícula en la cuadrícula tanto en imágenes de células vivas como en imágenes de criofluorescencia.

Adquiera imágenes criogénicas DIC y de fluorescencia en las posiciones identificadas en condiciones criogénicas utilizando un microscopio óptico con una lente de objetivo de trabajo larga. Durante las imágenes de criofluorescencia, verifique periódicamente el nivel de nitrógeno líquido en la etapa criogénica y vuelva a llenarlo con un hacedor autopresurizado según sea necesario para mantener la etapa de muestra por debajo de los 170 grados Celsius negativos para la tomografía crioelectrónica. Cargue la rejilla de muestras en la estación de transferencia criogénica de un microscopio electrónico equipado con una pistola de emisión de campo en modo de búsqueda de dosis baja a un aumento de 140x.

Identifique las regiones o cuadrados de la cuadrícula donde se han adquirido imágenes de criofluorescencia. Grabe una imagen crioelectromagnética de bajo aumento del área correlacionada y guarde la posición en un archivo de escenario en un modo de búsqueda de dosis baja con un aumento de 3.500 x. Inserte una búsqueda de apertura objetivo de 100 micras y guarde todas las posiciones correlacionadas con las señales GFP en un archivo de segunda etapa.

Configure los parámetros de tomografía para adquirir una serie de inclinación, incluido el rango de ángulo de inclinación, la dosis de electrones, el valor de desenfoque y los esquemas de inclinación. Adquiera la serie de inclinación para todas las posiciones guardadas para comenzar este procedimiento. Configure la ventana principal de manera que se puedan ajustar o seguir varias etapas del cálculo de Tomo Graham simultáneamente, modifique los parámetros necesarios y ejecute los programas específicos que requiere cada paso de procesamiento.

En la etapa final, cree una pila completamente alineada con un error residual principal inferior a 0,6 y reconstruya los Toms utilizando un algoritmo de retroproyección ponderada. En Im mod para caracterizar el comportamiento dinámico de las partículas de virus. Las células Hela infectadas con el VIH uno se obtuvieron mediante microscopía confocal de células vivas de alta velocidad y los movimientos de las partículas se analizaron mediante seguimiento automatizado de partículas en 3D.

En esta figura representativa, una sola partícula viral fluorescente verde indicada por la punta de flecha amarilla se rastreó en pilas confocales 3D con un intervalo de tiempo de tres minutos entre fotogramas para evitar el lapso de tiempo de varios minutos. Eso puede ocurrir entre la recolección de la última imagen confocal de células vivas y la congelación por inmersión. Se diseñó y construyó una etapa de microscopía de luz de criofluorescencia para obtener imágenes de muestras hidratadas congeladas dentro de cartuchos crioelectromagnéticos.

En los microscopios ópticos, el panel A muestra un hacedor autopresurizado lleno de nitrógeno líquido que se utiliza para enfriar la etapa de muestra criogénica de cobre. El panel B muestra la vista superior interior de la etapa de muestra criogénica con la cámara interior indicada por la punta de flecha blanca. La rejilla de muestra se coloca en el cartucho de muestra E EM, que se encuentra en el centro de una plataforma de bloques de cobre indicada por la flecha negra.

Esta plataforma se añadió para su uso con microscopios electrónicos no polares. Una vez cargados con la rejilla de muestras, los cartuchos se transfieren a la cámara interior para obtener luz de fluorescencia de grito. Los paneles de microscopía C y D muestran respectivamente el cartucho de muestras antes y después de colocar un anillo de cobre para mantener la rejilla en su lugar para su uso con un microscopio crioelectrónico no polar.

La utilidad del procedimiento para la microscopía correlativa avanzada de células vivas y la criotomografía electrónica se demuestra con la visualización directa de partículas de VIH V one marcadas con fluorescencia que interactúan con una célula de talón huésped. Una imagen DIC registrada con una etapa de microscopía de luz criogénica que se muestra en el panel A se superpone con una imagen de criofluorescencia de partículas marcadas con GFP que se muestra en el panel B. Las partículas marcadas están coloreadas. Los paneles rojos C, D y E son imágenes crio-EM de baja dosis de la región que contiene una partícula fluorescente encerrada en un círculo en los paneles B y C a 140 x 3, 500 x y 27, 500 x respectivamente.

El recuadro en el panel E es una vista ampliada registrada después de la adquisición de los paneles de la serie de inclinación tomográfica, FG y H muestran tres cortes tomográficos de cuatro nanómetros de espesor separados por una distancia de 21 nanómetros en la dirección Z. Las conexiones entre la partícula y la membrana de la célula helo se indican mediante flechas tanto en la imagen de proyección en el recuadro y en el panel E como en los cortes tomográficos. En los paneles F y g.

Hemos presentado un conjunto sencillo de protocolos para proporcionar un enfoque correlativo avanzado para analizar las interacciones dinámicas de virus y estériles utilizando imágenes de fluorescencia de lipocélulas confocales de lapso de tiempo seguidas de tomografía crioelectrónica. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la correlación precisa y confiable entre la imagen fluorescente y la imagen de microscopía electrónica es fundamental para la adquisición exitosa de la tomografía electrónica de cuervo. Los datos descritos por este procedimiento serán útiles para numerosas aplicaciones que involucran procesos celulares dinámicos en biología celular, como la señalización celular, la internalización de receptores de superficie.