Name: Microscopía correlativa para el análisis estructural en 3D de Interacciones Dinámicas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 43 s
Description: Aprende microscopía correlativa de fluorescencia y crioelectrón para analizar partículas dinámicas de HIV-1 en células HeLa. Este método integra imágenes 3D de alta velocidad con tomografía de alta resolución.

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Los autores desean agradecer a Travis Wheeler y el taller de máquinas en el Departamento de Biología Celular y Fisiología de la Universidad de Pittsburgh para la construcción de la etapa de la muestra crio-fluorescencia, Changlu Tao Cheng y Xu de la Universidad de Ciencia y Tecnología de China para la técnica asistencia, y el Dr. Teresa Brosenitsch para la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (GM082251 GM085043 y).

1. Cultivo de células HeLa en carbono con recubrimiento de oro EM Buscador Grids <ol><li> Descarga el resplandor del lado de carbono de un R2 de malla 200/2 Quantifoil oro EM buscador de la red de menos de 25 mA durante 25 s. </li><li> Cubra la rejilla EM con fibronectina, por flotar, carbono-hacia abajo, sobre una gota de 40 l 50 mg / ml solución de fibronectina, luego desinfectarla con luz UV durante 2 horas en una campana de cultivo de tejidos. </li><li> Células HeLa placa en la red a una densidad de 2 x 10 4 células / ml (cultivo total de 2 ml) en una placa de cultivo con fondo de cristal y crecer las células a 37 ° C, con 5% de CO 2, en DMEM suplementado con 4,5 g / L de L-glutamina y glucosa, 10% inactivado por calor suero fetal de ternera, 100 unidades / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina, durante aproximadamente 18 horas. Las células HeLa se infectaron después del cultivo O / N. </li></ol> 2. La infección por VIH-1 y células vivas imágenes <ol><li> Añadir un rastreador celular fluorescente (Red CMTPX, 1 l / 2 ml) a la cultura con fondo de cristalplato (de la etapa 1.3) y se incuba la placa a 37 ° C durante 10 min, para permitir la toma de hasta-el tinte fluorescente. </li><li> Se lavan las células con PBS y añadir 50 l de medio fresco precalentado. </li><li> Coloque el plato sobre la cámara en vivo de células, a 37 ° C, de un campo de escáner de microscopio confocal de barrido. Seleccionar varios campos (posiciones 10-15) que contienen 1 a 3 células / cuadrados, con las celdas entre dos fases de la mitosis, cuando son más dispersa y plano (véanse las figuras 2c y 2d), ya que requiere cryoEM regiones relativamente delgadas de la muestra. Guarde estas posiciones para obtener imágenes de futuro (paso 2.5). </li><li> Infectar las células con pseudo-mecanografiadas partículas VSV-G del VIH-1 que contienen GFP-VPR (utilizamos 40 l de una muestra que contiene 40 ng / ml de p24). Cuando la adición de las partículas de virus en la parte inferior del plato, tener cuidado de no perturbar la red EM, ya que las posiciones de formación de imágenes ya han sido seleccionados y almacenados. </li><li> Inmediatamente después de la adición de los viriones, recoger TIme-lapse de alta velocidad confocal de imágenes en 3D, en las posiciones previamente seleccionados (desde el paso 2.3) de 20-40 min. </li><li> Confocal imágenes fueron adquiridas mediante MetaMorph y analizados por el rastreo de partículas 3D automatizado para la dinámica de las partículas individuales utilizando el software Imaris (Ver Figura 1). Ya que estamos correlacionando el comportamiento dinámico de difracción limitada VIH-1 partículas con ultraestructura celular, time-lapse de imágenes de células vivas y rastreo de partículas 3D son fundamentales para los resultados. Sin embargo, para una estructura grande y estática, una imagen de fluorescencia sencillo (sin-vivo de células) sería suficiente para el análisis correlativo. </li></ol> 3. Frozen-hidratado EM Preparación de la muestra Para reducir al mínimo el retardo de tiempo entre la recolección de la última imagen confocal y crio-fijación de la muestra, la FEI Vitrobot (u otro dispositivo de vitrificación) debe ser iniciado y preparado para la inmersión de congelación durante la colección de imágenes de células en vivo confocal de fluorescencia.<ol><li> Encienda el dispositivo de vitrificación y fijar la temperatura del clima a 22 ° C, la humedad objetivo al 100%, el tiempo de transferencia de 7 segundos, y el tiempo de espera y tiempo de drenaje de 1 seg. </li><li> Coloque la caja de almacenamiento de red en el émbolo dewar y preparar etano líquido frío. Monte el dewar en el dispositivo de vitrificación. </li><li> Inmediatamente después de la formación de imágenes de células vivas confocal (sección 2), coloque la placa de cultivo en un bloque de cobre enfriada con hielo y la transferencia a la sala de preparación de muestras cryoEM. Coloque la rejilla EM en las pinzas especializadas y secar rápidamente lejos cualquier medio de comunicación en la red. El secante se realiza manualmente, con papel de filtro, después de lo cual 4 l de solución de 15 nm de bolas de oro se mezcla con 0,2 micras microesferas fluorescentes se coloca inmediatamente en la parrilla. Las perlas de oro se utilizan como marcadores de referencia para ayudar a la recogida de datos tomográfica y la alineación. Las microesferas fluorescentes se utilizan para ayudar a la correlación entre las imágenes fluorescentes y cryoEM (Véanse las Figuras 2c-2f). </li><li> Coloque las pinzas en el dispositivo de vitrificación y dar instrucciones al dispositivo de borrar y hundir congelación de etano líquido 16. Los parámetros optimizados Blot para alcanzar el mejor resultado son: tiempo de transferencia, 7 seg; blot desplazamiento, 0; tiempo de drenaje, 1 seg; temperatura, 22 ° C, y humedad, 100%. </li><li> Transfiera la red frozen-hidratado a un titular cryoEM para imágenes cryoET inmediata, oa un almacenamiento de nitrógeno líquido dewar para su uso posterior. </li></ol> 4. Cryo-Microscopía de fluorescencia de luz Se requiere un sistema, la cámara muestra la crio-fluorescencia de fabricación casera y la etapa (Figura 3) para llevar a cabo los pasos 04.01 a 04.10. Las especificaciones detalladas y descripción de la etapa se pueden encontrar en Junio ​​et al. 15. <ol><li> Llenar un nitrógeno líquido auto-presión Dewar con nitrógeno líquido por lo menos 2 horas antes de iniciar la crio-microscopía de luz de fluorescencia (véase la Figura 3a). </li><li> Montar una homebuilt crio-fetapa de la muestra luorescence 15 (Figura 3) en un microscopio de luz invertido de fluorescencia, tales como una Olympus IX 71. </li><li> Conectar la entrada de nitrógeno líquido de la etapa de crio-muestra para el dewar de auto-presión y colocar la salida de protección contra el desbordamiento de nitrógeno líquido en un recipiente apropiado. Conecte una línea de gas nitrógeno seco a una manga colocada sobre la lente del objetivo de mantener la lente cálido y libre de heladas. </li><li> Coloque una plataforma bloque de cobre (flecha negro en la Figura 3b) en la cámara de crio-etapa para la carga de la rejilla muestra congelada-hidratado. Enfriar y llenar la cámara de cobre de la crio-etapa con nitrógeno líquido a través de la línea de entrada de la auto-presión de llenado Dewar. </li><li> Cuando la etapa criogénica alcanza la temperatura del nitrógeno líquido (en aproximadamente 4-6 min), la transferencia de la caja de almacenamiento de red (desde el paso 3.5) a la etapa criogénica. </li><li> Coloque la rejilla muestra congelada hidratado en el cartucho muestra de EM en el bloque de cobre y el clip de la glibrado en su lugar con un anillo C (si se utiliza un cartucho microscopio Polara), o coloque un anillo de cobre pre-enfriado en la parte superior (negro punta de flecha en la Figura 3d), para mantener la red en el lugar y también para facilitar la recuperación de la red después de imágenes crio-fluorescencia (si por un crio-microscopio de electrones no Polara). </li><li> Coloque el cartucho (de la etapa 4.6) en la cámara interior de la crio-etapa (punta de flecha blanca en la Figura 3b). </li><li> Busca y encuentra las mismas partículas de virus de los datos de formación de imágenes de células vivas. Desde la rejilla EM tiene un índice, es fácil de localizar la misma partícula en la parrilla en las dos imágenes de células en vivo e imágenes de crio-florescencia. </li><li> Adquirir imágenes GFP crio-DIC y en las posiciones identificadas bajo la crio-estado utilizando un microscopio de luz con un tiempo de trabajo (2,7-4 mm) lente del objetivo. Durante la proyección de imagen de la crio-fluorescencia, revisar periódicamente el nivel de nitrógeno líquido en la etapa criogénica y volverlo a llenar, según sea necesario, para mantener el escenario de ejemplo siguiente -170° C. </li><li> Al término de las imágenes de crio-fluorescencia, reposar el cartucho de muestra para la plataforma bloque de cobre y guarde el cartucho en un termo de nitrógeno líquido para su análisis cryoET futuro con un sistema Polara. Si se utiliza un microscopio crioelectrónica no Polara, retire el anillo de cobre, recuperar la red muestra, colocarla en una caja de almacenamiento de red, y almacenar la muestra en un termo de nitrógeno líquido hasta que la muestra es examinada por cryoET. </li><li> Para el análisis de datos, se superponen los crio-DIC y GFP imágenes adquiridas (desde el paso 4.9, véase la figura 4b) y correlacionar las posiciones de las señales de GFP en la imagen Cryo-fluorescencia con los obtenidos en la serie de imágenes de células vivas. </li></ol> 5. Cryo-tomografía electrónica <ol><li> Cargar el cartucho de la muestra en la estación de crio-transferencia de un microscopio electrónico equipado con un arma de emisión de campo, tales como Polara microscopio G2. </li><li> En el modo de baja dosis de investigación con una ampliación de 140X, identify y guardar las cuadrículas correspondientes (del paso 4,11) en un archivo de escenario. </li><li> En el modo de baja dosis de investigación con una ampliación de 3500 X, insertar un 100 micras apertura del objetivo, buscar y guardar todos los puestos se correlacionaron con señales de GFP en un segundo archivo de escenario. </li><li> En el modo de dosis baja exposición, encontrar un área en blanco para ajustar la intensidad del haz a una dosis de 1 o 2 e - / Å 2 y refinar el eje de inclinación, utilizando la función y etapa, quemando el hielo en una región de carbono sin importancia con varias perlas de oro. </li><li> En el modo de baja dosis de enfoque, ajustar la distancia de enfoque a ~ 3 micras y ajustar el ángulo para alinear la dirección de enfoque a ser paralelo al eje de inclinación. </li><li> En el modo de baja dosis de investigación, hay que recordar posiciones guardadas (del paso 5.3), ajuste la altura eucéntrica muestra y compruebe el rango de inclinación de la zona de interés. Adquirir una imagen de proyección con una dosis de electrones muy baja (~ 1 e - / a 2) a 8 a 10 micras desenfoque, en exposmodo de ure, para confirmar las partículas del virus correlacionados para la crio-tomografía electrónica. </li><li> Cambie al modo de baja dosis de enfoque. En el menú de funciones de auto TEM, preceder a la altura eucéntrica automatizado y se centran en las funciones del área de enfoque. </li><li> Establecer los parámetros para la adquisición de una serie de inclinación. En la figura 4, en el presente trabajo, los ángulos de inclinación que varía ± 70 °, por debajo y por encima de 45 °, a los 3 ° y 2 ° de inclinación incrementos, respectivamente, fueron utilizados, con 6 micras desenfoque y aproximadamente el 70 e - / Å 2 dosis total. </li><li> Repita los pasos 5.7 y 5.8 para todas las posiciones guardadas. Software de tomografía por lotes puede ser utilizado para la recogida de datos automatizada en múltiples posiciones para aumentar el rendimiento. </li></ol> 6. Reconstrucción tridimensional utilizando IMOD 17 <ol><li> Inspeccione la serie inclinación prima para ajustar los valores mínimos y máximos de densidad y determinar si hay algún fin de ser excluido debido a la gran cambio de imagen. </li><li> Iniciar Etomo y el panel de configuración utilizando tomografía tipo de eje, tamaño de píxel, diámetro fiducial, etc. A continuación, crear scripts com. </li><li> Configurar la ventana principal de tal manera que varias etapas de la computación tomografía se pueden ajustar / siguieron simultáneamente. Modificar los parámetros necesarios y ejecutar los programas específicos que son requeridos por cada paso del proceso (Ver Etomo tutorial, <a href="http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html" target="_blank">http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html</a> ). </li><li> En la etapa final, crear una pila alineada completa (con un error residual medio inferior a 0,6) y reconstruir tomografías utilizando un algoritmo de retroproyección ponderada en IMOD. </li><li> DeNoise áreas potenciales de interés mediante una difusión anisotrópica no lineal borde mejorar el programa 3D implementado en IMOD con los parámetros adecuados para mejorar el contraste y la claridad. </li></ol>

<ol><li>Leis, A., Rockel, B., Andrees, L., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+cells+at+the+nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Visualizing cells at the nanoscale.</a> Trends in Biochemical Sciences. 34, 60-70 (2009).</li>
<li>Maurer, U. E., Sodeik, B., Grunewald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+3D+intermediates+of+membrane+fusion+in+herpes+simplex+virus+1+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Native 3D intermediates of membrane fusion in herpes simplex virus 1 entry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10559-10564 (2008).</li>
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<li>Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+structure+determination+of+native+mammalian+cells+using+cryo-FIB+and+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 180, 318-326 (2012).</li>
<li>Sartori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+microscopy%3A+bridging+the+gap+between+fluorescence+light+microscopy+and+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 160, 135-145 (2007).</li>
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<li>Rigort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromachining+tools+and+correlative+approaches+for+cellular+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 172, 169-179 (2010).</li>
<li>Gruska, M., Medalia, O., Baumeister, W., Leis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+tomography+of+vitreous+sections+from+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron tomography of vitreous sections from cultured mammalian cells.</a> Journal of Structural Biology. 161, 384-392 (2008).</li>
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<li>Dubochet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 21, 129-228 (1988).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).</li>
<li>Whitfield, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+periodically+expressed+in+the+human+cell+cycle+and+their+expression+in+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors.</a> Molecular Biology of the Cell. 13, 1977-2000 (2002).</li>
<li>Agronskaia, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+fluorescence+and+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrated fluorescence and transmission electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 164, 183-189 (2008).</li>
<li>Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused-ion-beam+thinning+of+frozen-hydrated+biological+specimens+for+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 4, 215-217 (2007).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

Hemos presentado un conjunto sencillo de protocolos para proporcionar un enfoque correlativo avanzada para analizar los procesos celulares dinámicos mediante time-lapse confocal de fluorescencia de células vivas seguido cryoET. Nuestro desarrollo metodológico para correlacionar imágenes de células vivas 3D con alta resolución cryoET es fundamental para investigar muchos problemas biológicos difíciles, tales como la visualización y partículas raras, dinámica (no estática, como se informó anteriormente) de difracción limi...

Cryo-tomografía de electrones (cryoET) es una técnica de imagen de gran alcance que permite la visualización en tres dimensiones (3D) de las células y los tejidos y proporciona información detallada sobre la organización de los orgánulos nativas y estructuras celulares en resolución molecular en un primer estado fisiológico a 1. Sin embargo, la inherentemente bajo contraste de muestra congelada sin teñir-hidratado, combinada con su sensibilidad a la radiación, hace que sea difícil la localización de áreas de interés dentro de una célula y, posteriormente, la realización de la serie de inclinación con éxito sin dañar el área de destino. Con el fin de superar estos problemas, un enfoque correlativo que combina microscopía de luz y de electrones es necesario. Características específicas de relieve por marcaje fluorescente se identifican y se encuentran por microscopía de luz de fluorescencia, y a continuación, sus coordenadas se transfieren al microscopio electrónico para la adquisición de los datos estructurales 3D de alta resolución. Este método correlativo ayuda a localizar el objetivo de unreas de interés que deben abordarse. Debido a la limitación sobre el espesor de la muestra con cryoEM (&lt;300 nm), actualmente sólo las regiones periféricas de la célula son adecuados para el análisis estructural 3D por CryoET. Una mayor reducción del espesor de las muestras congeladas, hidratadas por vítreo seccionar 8 o crio-centrado del haz de iones (FIB) de molienda 9 ampliaría la capacidad de proyección de imagen correlativa. Anteriormente, los métodos correlativos se utilizaron principalmente para facilitar la adquisición de datos cryoET para las grandes y estática estructuras 10-13. En estos estudios, crio-etapas se han aplicado a aceptar rejillas cryoEM y cabe en cualquier un microscopio vertical o un microscopio invertido 10,11,14. Aunque las redes de conmutación parece bastante sencillo en sus diseños, hay adicional transferencia de pasos implicados para la red EM, el aumento de la probabilidad de que la red puede ser deformada, dañada y contaminada. Recientemente hemos demostrado un avance técnico enmicroscopía correlativa que nos permite visualizar directamente los eventos dinámicos que son por naturaleza difíciles de capturar, como el VIH-1 y las interacciones de células huésped en las primeras etapas de la infección 15. Esto lo logramos a través del diseño e implementación de una plataforma de muestra crio-microscopía de luz que se adapta un sistema de cartucho para minimizar el daño espécimen debido a la manipulación red, facilitando así la correlación. Nuestro diseño incluye un soporte del cartucho de muestra integrada, que permite tanto la crio-microscopía de luz y electrónica criogénica a realizar, de forma secuencial, en el mismo soporte de la muestra, sin transferencia de la muestra, lo que agiliza el proceso correlativo. Además, también implementado un procedimiento de correlación precisa y fiable el uso de perlas de látex fluorescentes como marcadores fiduciales.

<table><tr><tbody><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>DMEM 4.5 g/L Glucosa con L-Glutamina</td><td>Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>F1141-1MG</td><td>Cultivo de células HeLa en rejillas EM</td></tr><tr><td>Rastreador de células</td><td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td><td>C34552</td><td>CMTPX</td></tr><tr><td>rojo Conjugados</td> <td>de oro de proteína ATed Pella, Inc., Redding, CA</td><td>15822-1</td><td>15 nm diámetro</td></tr><tr><td>0,2 &mu; m microesferas fluorescentes</td><td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td><td>F8811</td><td>Fluorescente amarillo-verde</td></tr><tr><td>Suero bovino de ternero fetal inactivado por calor</td><td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td><td>10082-139</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo con fondo de vidrio</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Buscador de oro quantifoil rejillas EM</td><td>Quantifoil Micro Tools, Jena, Alemania</td><td>R2/2 Au NH2 200 malla</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Dispositivo de descarga incandescente 100X</td><td>EMS, Hatfield, PA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio electrónico Tecnai Polara G2 con una pistola de emisión de campo</td><td>FEI, Hillsboro, OR</td><td></td><td>300 keV</td></tr><tr><td>Vitrobot Mark III</td><td>FEI, Hillsboro, OR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Olympus IX 71</td><td>Olympus America Inc., Center Valley, PA</td><td></td><td>LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (distancia de trabajo de 2.7-4 mm)</td></tr><tr><td>lente de objetivo Nikon TiE Microscopio</td><td>Nikon Instruments, Melville, NY</td><td></td><td>usando una lente de objetivo de inmersión en aceite de 60X/1.35 NA</td></tr><tr><td>Microscopio confocal de Sweptfield</td><td>Prairie Technologies, Middleton, WI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tokai Hit cámara de celda viva</td><td>Tokio, Japón</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etapa de muestra de criofluorescencia Hecho</td><td></td><td></td> en <td>casa Construido en casa por taller mecánico, consulte la referencia 15 para el diseño.</td></tr></tbody></table>

microscopía correlativa para el análisis estructural en 3d de interacciones dinámicas

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-tomografía electrónica (cryoET) permite la visualización 3D de las estructuras celulares con resolución molecular en un estado cercano al fisiológico 1. Sin embargo, la visualización directa de los complejos virales individuales en su ambiente celular del huésped con cryoET 2 es un reto, debido a la naturaleza poco frecuente y dinámica de la entrada viral, en particular en el caso de VIH-1. Mientras time-lapse de imágenes de células vivas ha dado una gran cantidad de información sobre muchos aspectos del ciclo de vida del VIH-1 3-7, la solución ofrecida por microscopia de células vivas es limitada (~ 200 nm). Nuestro trabajo tuvo como objetivo el desarrollo de un método de correlación que permite la visualización directa de los eventos tempranos de la infección por VIH-1 mediante la combinación de células vivas microscopía de luz fluorescente, la crio-microscopía fluorescente y cryoET. De esta manera, las señales de células en vivo y crio-fluorescente se pueden utilizar para guiar con precisión la toma de muestras en cryoET. Por otra parte, la información estructural obtenida de cryoET puede be complementado con los datos funcionales dinámicas adquirida a través de imágenes de células vivas de fluorescente diana marcada. En este artículo de vídeo, ofrecemos métodos y protocolos detallados para la investigación estructural de VIH-1 y las interacciones de la célula huésped utilizando correlativa de imágenes de células vivas 3D de alta velocidad y alta resolución cryoET análisis estructural. Células HeLa infectadas con partículas de VIH-1 se caracterizan por primera vez por microscopía confocal de células vivas, y la región que contiene la misma partícula viral se analizaron a continuación por crio-tomografía de electrones para los detalles estructurales 3D. La correlación entre dos conjuntos de datos de imágenes, proyección de imagen óptica y electrónica de imágenes, se logró mediante una etapa microscopía óptica crio-fluorescencia de fabricación casera. El enfoque detallado aquí será de gran valor, no sólo para el estudio de las interacciones de células virus-huésped, sino también para aplicaciones más amplias en la biología celular, tales como señalización, tráfico de receptor de membrana celular, y muchos otros procesos celulares dinámicos. &lt;/ P&gt;

Para caracterizar el comportamiento dinámico de las partículas de virus, las células HeLa infectadas con el VIH-1 se obtuvieron imágenes de alta velocidad por microscopía confocal de células en vivo y los movimientos de partículas se analizaron mediante el rastreo de partículas 3D automatizado (Figura 1). Para evitar que el lapso de tiempo de varios minutos que se pueden producir entre la recolección de la última imagen de células vivas confocal y sumergirse de congelación (que puede ser lo suficienteme...

Se describe un método de microscopía correlativa que combina alta velocidad de microscopía de luz fluorescente de células vivas 3D y la crio-tomografía electrónica de alta resolución. Se demuestra la capacidad del método correlativo por imágenes dinámicas, pequeñas partículas de VIH-1 que interactúan con las células HeLa de acogida.

Microscopía correlativa para el análisis estructural en 3D de Interacciones Dinámicas

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar el uso del método correlativo de microscopía de fluorescencia y microscopía electrónica criogénica mediante la obtención de imágenes de partículas pequeñas y dinámicas del VIH-1 que interactúan con células huésped HeLa. Esto se logra primero sembrando y cultivando células HeLa sobre una rejilla EM con marcador de posición dorado en una placa de cultivo con fondo de vidrio, e infectando las células HeLa con partículas del VIH-1 marcadas con GFP. El segundo paso consiste en obtener imágenes confocales en 3D de células vivas infectadas con VIH-1, con captura rápida y de lapso de tiempo, y analizar las imágenes mediante seguimiento automatizado de partículas en 3D para estudiar la dinámica individual de partículas tras la vitrificación.La muestra, las mismas partículas virales de los datos de microscopía de fluorescencia en células vivas, se localizan en imágenes criofluorescentes para un análisis posterior mediante tomografía electrónica criogénica 3D de alta resolución. El paso final consiste en recopilar series de proyecciones criogénicas con inclinación para todas las posiciones identificadas que contienen partículas de VIH-1 y

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Cuatro dimensiones (4D) de formación de imágenes se utiliza para estudiar el comportamiento y las interacciones entre los dos tipos de endosomas en los terminales nerviosos de vertebrados vivían. Movimiento de estas pequeñas estructuras se caracteriza en tres dimensiones, permitiendo la confirmación de eventos tales como la fusión endosoma y la exocitosis.

Visualización de la Dinámica en Endosoma Vivir terminaciones nerviosas con imágenes de fluorescencia en cuatro dimensiones

Aquí, presentamos un método, cocem3D, para revelar la ultraestructura de una célula específica en su tejido nativo mediante la combinación de microscopía electrónica de barrido confocal y serial de cara de bloque.

Correlativa confocal y microscopía electrónica de 3D de una célula sensorial específica

Para investigar las velocidades de flujo y la direccionalidad de la actina filamentosa en la sinapsis inmunológica de las células T, se combinan imágenes de superresolución de células vivas con fluorescencia de reflexión interna total y se cuantifican con espectroscopía de correlación de imágenes espacio-temporales.

Cortical de actina de flujo en células T cuantificados por espacio-temporal de correlación Imagen Espectroscopia de Estructurado Iluminación Microscopía de datos

Aquí, presentamos un protocolo para obtener datos smFRET tricolor y su análisis con un conjunto 3D modelo de Markov ocultos. Con este enfoque, los científicos pueden extraer información cinética de sistemas complejos de la proteína, incluyendo cooperatividad o interacción correlacionadas.

Uso del traste de una sola molécula a estudiar la correlación de las interacciones proteína

Este protocolo explica cómo preparar y montar muestras bacterianas para imágenes tridimensionales en vivo y cómo reconstruir la forma tridimensional de E. coli a partir de esas imágenes.

Imagen tridimensional de células bacterianas para representaciones celulares precisas y localización precisa de proteínas

El presente protocolo describe un método para visualizar y medir anillos de actina y otros componentes del esqueleto periódico de membrana del segmento inicial del axón utilizando neuronas del hipocampo de rata cultivadas y microscopía de iluminación estructurada en 3D (3D-SIM).

Medición de las propiedades del esqueleto periódico de membrana del segmento inicial del axón mediante microscopía de iluminación estructurada en 3D (3D-SIM)

Aquí, se presenta un ensayo de reconstitución in vitro basado en microscopía TIRF para cuantificar y comparar simultáneamente la dinámica de dos poblaciones de microtúbulos. Se describe un método para ver simultáneamente la actividad colectiva de múltiples proteínas asociadas a microtúbulos en haces de microtúbulos reticulados y microtúbulos individuales.

Visualización simultánea de la dinámica de microtúbulos reticulados y únicos in vitro mediante microscopía TIRF

Presentamos un protocolo para implementar la microscopía de interferencia-reflexión y la microscopía de reflexión-fluorescencia interna-total para la obtención simultánea de imágenes de microtúbulos dinámicos y proteínas asociadas a microtúbulos marcadas fluorescentemente.

Reflexión de interferencia simultánea y microscopía de fluorescencia de reflexión interna total para imágenes de microtúbulos dinámicos y proteínas asociadas

La microscopía dinámica diferencial (DDM) combina características de dispersión dinámica de luz y microscopía. Aquí, se presenta el proceso de uso de DDM para caracterizar redes de citoesqueletos reconstituidos mediante la cuantificación de la dinámica subdiffusiva y enjaulada de partículas en redes de vimentina y el movimiento balístico de compuestos activos de actina-microtúbulos impulsados por miosina.

Cuantificación de la dinámica del citoesqueleto mediante microscopía dinámica diferencial

Este protocolo es una guía para visualizar actina dinámica y microtúbulos utilizando un ensayo de microscopía de fluorescencia interna total (TIRF) in vitro .

Visualización de la dinámica de acoplamiento de actina y microtúbulos in vitro mediante microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF)

Este protocolo describe en detalle cómo construir un microscopio de fluorescencia de hoja de luz de un solo objetivo y su uso para visualizar redes de citoesqueletos.

Diseño y construcción de un microscopio de fluorescencia de lámina de luz personalizable de un solo objetivo para la visualización de redes de citoesqueletos

Aprende microscopía correlativa de fluorescencia y crioelectrón para analizar partículas dinámicas de HIV-1 en células HeLa. Este método integra imágenes 3D de alta velocidad con tomografía de alta resolución.

Microscopía correlativa para el análisis estructural en 3D de Interacciones Dinámicas

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