Correlativa a la luz y microscopía electrónica de Uso de Quantum Dot nanopartículas

El objetivo general de este método es obtener datos correlativos de microscopía óptica y electrónica, o CLEM, combinando información inmunocitoquímica de fluorescencia con morfología ultraestructural de la microscopía electrónica de transmisión en una sola imagen. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunocitoquímica y la patología, como con qué estructura subcelular está asociada una proteína particular de interés. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza la misma sonda de nanopartículas de puntos cuánticos para obtener tanto la señal de microscopía en vivo de la proteína diana como la localización estructural de la microscopía electrónica.

Después de fijar, incrustar y seccionar el tejido tumoral del somatostatinoma humano de acuerdo con el protocolo de texto, prepare una solución adhesiva de sección colocando 20 centímetros de cinta adhesiva transparente en una botella de cinco mililitros que contenga 2.0 mililitros de acetona y déjela reposar durante 10 minutos. Retire la cinta y sumerja una rejilla de níquel en la solución, luego retire la rejilla y deje que se seque al aire. Una vez seco, usa el lado opaco de la rejilla para recoger una sección ultra delgada.

Es fundamental establecer el tiempo de grabado correcto para la formulación de resina elegida. 30 minutos funciona bien para esta formulación, pero es posible que deba recalcularse para formulaciones más duras o más blandas. Prepare un mililitro de solución de grabado de metaperiodato de sodio saturado fresco en agua destilada y coloque las gotas de la solución sobre una superficie de película de laboratorio limpia.

Coloque rejillas completamente secas con secciones sobre las gotas e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego, transfiera las rejillas a gotas de agua destilada durante 60 segundos para lavarlas. Para llevar a cabo el marcaje de anticuerpos y puntos cuánticos, o QD, en una superficie de película de laboratorio limpia, pipetea gotas de gliceno 0,05 molar y PBS.

Coloque las rejillas en las gotas e incube durante 10 minutos para bloquear el aldehído residual en las secciones. Para eliminar el bloque de aldehído, seque brevemente el borde de la rejilla. A continuación, coloque la rejilla sobre una gota de suero de cabra normal al uno por ciento, o NGS, y un 1 por ciento de BSAC en PBS durante 10 minutos.

Prepare un mililitro de solución de bloqueo agregando 10 microlitros de NGS y 100 microlitros de BSAC a 890 microlitros de PBS. A continuación, acondiciona las secciones colocándolas sobre una gota de diluyente de anticuerpos durante 10 minutos. A continuación, use diluyente de anticuerpos para diluir el anticuerpo policlonal anti-somatostatina del uno al 10 y coloque las rejillas en las gotas de la solución.

Incubar en una cámara húmeda a temperatura ambiente durante una hora. Después de la incubación, retire el reactivo de anticuerpos secando el borde de la rejilla. Luego use diluyente de anticuerpos para lavar las secciones dos veces durante cinco minutos cada una.

Después de diluir el anticuerpo secundario del uno al 10 y preparar las gotas, incube las rejillas en las gotas a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, retira la solución de anticuerpos y lava las secciones dos veces. Diluir los QD conjugados con estreptavidina del uno al 10 e incubar las muestras en gotas de la solución en la oscuridad, a temperatura ambiente durante una hora.

Luego use diluyente de anticuerpos para lavar las rejillas dos veces, cada vez durante cinco minutos, y seque el borde de las rejillas. A continuación, lave las rejillas en agua destilada durante dos minutos antes de secar los bordes. Coloque la sección de rejilla inmunoteñida en una gota de agua en un portaobjetos de vidrio y use un cubreobjetos de vidrio para cubrirla.

Para realizar microscopía de luz de fluorescencia, inserte un cubo de filtro con las siguientes características y utilice iluminación LED de 365 nanómetros. Coloque la sección inmunoteñida en la platina del microscopio de inmunofluorescencia. Utilice la microscopía óptica para evaluar el patrón de etiquetado, el nivel de cualquier etiquetado no específico y para establecer que los controles negativos son claros.

A continuación, identifique el ROI en relación con las barras de la cuadrícula. A continuación, configure una cámara digital a todo color en color automático FL y ajuste el balance de blancos en 3, 200 K.Configure la cámara en modo de exposición automática con un ajuste de gamma entre 0,45 y 1,00 para optimizar la apariencia de las imágenes, y la ganancia analógica ajustada a una X.Haga clic en el icono de la cámara en la interfaz gráfica del software ZEN Two Light para vivir. A continuación, concéntrese en la imagen y haga clic en Ajustar en la interfaz gráfica del software ZEN Two Light para capturar la imagen en la tienda de marcos.

Guarde las imágenes como archivos tf para evitar la compresión y la pixelación. Prepare una impresión que muestre la posición del ROI en relación con las barras de la cuadrícula u otros puntos de referencia significativos del tejido. A continuación, retire la rejilla del portaobjetos, lávela con agua destilada y seque suavemente los bordes.

Para llevar a cabo la microscopía electrónica de transmisión, transfiera la rejilla al microscopio para su examen utilizando un voltaje de aceleración de 100 kilovoltios. Comience con un aumento bajo de aproximadamente 1.400X para navegar por la cuadrícula y encontrar los ROI con los que se encuentran con la microscopía óptica. Observe QD individuales con un aumento de 70, 000X o más.

Aparecerán como estructuras cristalinas irregulares con una densidad de electrones moderada. A continuación, utilizando una cámara digital con un sensor monocromático de 1.392 x 1.040 píxeles en la interfaz gráfica del software de imágenes, haga clic en el icono de la cámara para activar y adquirir imágenes. Mueva el icono de la cámara a la posición de apagado para almacenar la imagen en el almacén de marcos.

Para llevar a cabo la obtención de imágenes CLEM, utilice una impresión de la microscopía óptica para localizar las ROI correspondientes por TEM. Las características arquitectónicas de tejido son útiles para la navegación por la sección. Captura una imagen del ROI correspondiente por TEM.

A continuación, para preparar una imagen CLEM, asegúrese de que la imagen TEM esté correctamente orientada y ampliada al mismo tamaño y resolución que la imagen del microscopio óptico, en este caso, 300 píxeles por pulgada. Amplíe el tamaño del lienzo de imagen de microscopía óptica para duplicar su tamaño. A continuación, copia y pega la imagen TEM junto a la imagen de fluorescencia.

Para crear una superposición de fluorescencia en Photoshop CS2, haz clic en la herramienta de marco rectangular, selecciona la imagen fluorescente y crea una capa duplicada a partir de ella. Ajuste las opciones de fusión de estilo de capa a 30 a 40% de transparencia. A continuación, haz clic en la herramienta de movimiento y arrastra la capa de superposición de fluorescencia sobre la imagen TEM correspondiente, y alinea las imágenes.

Después de alinear las imágenes, aplana la imagen para producir la superposición final. A continuación, utiliza la herramienta de marco rectangular para seleccionar la nueva imagen de superposición y copiarla en un nuevo lienzo. Finalmente, guarde la imagen como un archivo tf.

En esta imagen de microscopía de fluorescencia, las células tumorales individuales de somatostatinoma contienen abundantes gránulos secretores y se marcaron positivamente para la hormona somatostatina. Los núcleos aparecieron como agujeros oscuros y, a bajo aumento, se observó una fluorescencia QD granular naranja intensa y variable en el citoplasma. El ROI elegido por microscopía óptica se reconoció y se obtuvo mediante TEM haciendo referencia a una imagen de microscopía óptica de 20X, como se indica aquí.

A mayor aumento, la célula muestra una fluorescencia brillante y un intenso marcaje QD en gránulos citoplasmáticos. La superposición de datos de fluorescencia en imágenes TEM, como en este ejemplo, sugiere que un marcado positivo fuerte corresponde a gránulos que contienen material moderadamente denso en electrones dentro de la membrana limitante de vesículas. Finalmente, como se ve aquí con mayor aumento, los gránulos moderadamente densos en electrones mostraron un intenso inmunomarcaje de nanocristales QD.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en ocho horas si se realiza correctamente. Al intentar el procedimiento, es importante recordar que debe manipular las cuadrículas con cuidado, solo por los bordes. Al tocar la sección mientras se recoge la cuadrícula, es posible que se separe la sección de la cuadrícula.

Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el inmunomarcaje múltiple, para responder preguntas adicionales, como si la proteína de interés se colocaliza con otra proteína. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la patología exploraran la localización de proteínas en el proceso de archivo de tejidos humanos para la microscopía electrónica. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo combinar la información inmunocitoquímica de la microscopía de luz de fluorescencia con la ultraestructura de la microscopía electrónica de transmisión.

No olvide que trabajar con tetróxido de osmio puede ser extremadamente peligroso, y se deben tomar precauciones como el uso de equipo de protección, trabajar en una campana extractora y la eliminación adecuada de desechos mientras se realiza este procedimiento.