Correlativa a la luz y microscopía electrónica de Uso de Quantum Dot nanopartículas

El objetivo general de este método es obtener datos de microscopía correlativa de luz y electrones, o CLEM, combinando información de inmunocitoquímica de fluorescencia con la morfología ultraestructural procedente de microscopía electrónica de transmisión en una única imagen. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunocitoquímica y la patología, como por ejemplo con qué estructura subcelular se asocia una proteína particular de interés. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza la misma sonda de nanopartículas de puntos cuánticos para obtener tanto la señal de microscopía en vivo del proteína diana como la localización estructural en microscopía electrónica.

Después de fijar, incluir y seccionar el tejido tumoral humano de somatostatinoma según el protocolo descrito, prepare una solución adhesiva para secciones colocando 20 centímetros de cinta adhesiva transparente en un frasco de cinco mililitros que contenga 2,0 mililitros de acetona y déjela reposar durante 10 minutos. Retire la cinta y sumerja una rejilla de níquel en la solución, luego saque la rejilla y déjela secar al aire. Una vez seca, utilice el lado mate de la rejilla para recoger una sección ultradelgada.

Es fundamental establecer el tiempo de ataque adecuado para la formulación de resina elegida. Treinta minutos funciona bien para esta formulación, pero puede ser necesario recalcularlo para formulaciones más duras o más blandas. Prepare un mililitro de solución fresca saturada de metaperiodato de sodio en agua destilada y coloque gotas de la solución sobre una superficie limpia de película de laboratorio.

Coloque rejillas completamente secas con secciones sobre las gotas e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego, transfiera las rejillas a gotas de agua destilada durante 60 segundos para lavarlas. Para realizar la marcación con anticuerpos y puntos cuánticos, o QD, sobre una superficie limpia de película de laboratorio, pipetee gotas de glicina 0,05 M y PBS.

Coloque las rejillas sobre las gotas e incube durante 10 minutos para bloquear el aldehído residual en las secciones. Para eliminar el bloqueo de aldehído, seque brevemente el borde de la rejilla. Luego coloque la rejilla sobre una gota de suero de cabra normal al uno por ciento, o NGS, y BSA-C al uno por ciento en PBS durante 10 minutos.

Prepare un mililitro de solución bloqueante añadiendo 10 microlitros de NGS y 100 microlitros de BSAC a 890 microlitros de PBS. A continuación, condicione las secciones colocándolas sobre una gota de diluyente de anticuerpos durante 10 minutos. Después, use el diluyente de anticuerpos para diluir el anticuerpo policlonal anti-somatostatina uno a 10, y coloque las rejillas sobre gotas de la solución.

Incubar en una cámara húmeda a temperatura ambiente durante una hora. Después de la incubación, eliminar el reactivo de anticuerpo mediante la absorción del borde de la rejilla. A continuación, lavar las secciones dos veces durante cinco minutos cada una con diluyente de anticuerpos.

Después de diluir el anticuerpo secundario uno a 10 y preparar gotas, incubar las rejillas sobre las gotas a temperatura ambiente durante una hora. Luego, eliminar la solución de anticuerpo y lavar las secciones dos veces. Diluir los puntos cuánticos conjugados con estreptavidina uno a 10 e incubar las muestras sobre gotas de la solución a oscuras, a temperatura ambiente durante una hora.

Luego, use diluyente de anticuerpos para lavar las rejillas dos veces, cada vez durante cinco minutos, y seque los bordes de las rejillas. A continuación, lave las rejillas con agua destilada durante dos minutos antes de secar los bordes. Coloque la sección de rejilla inmunomarcada en una gota de agua sobre un portaobjetos de vidrio y utilice un cubreobjetos de vidrio para cubrirla.

Para realizar microscopía de fluorescencia, inserte un cubo de filtros con las siguientes características y utilice iluminación con LED de 365 nanómetros. Coloque la sección inmunomarcada sobre la platina del microscopio de inmunofluorescencia. Utilice microscopía óptica para evaluar el patrón de marcado, el nivel de cualquier marcado no específico y para verificar que los controles negativos estén limpios.

A continuación, identifique las regiones de interés (ROI) en relación con las barras de la cuadrícula. Luego configure una cámara digital de color completo en color automático FL y ajuste el balance de blancos a 3.200 K. Configure la cámara en modo de exposición automática con un valor gamma entre 0,45 y 1,00 para optimizar la apariencia de las imágenes, y establezca la ganancia analógica en 1×. Haga clic en el icono de la cámara en la interfaz gráfica del software ZEN Two Light para activar la vista en vivo. A continuación, enfoque la imagen y haga clic en Capturar en la interfaz gráfica del software ZEN Two Light para guardar la imagen en el almacén de fotogramas.

Guarde las imágenes como archivos tf para evitar la compresión y la pixelación. Prepare una impresión que muestre la posición de la ROI en relación con las barras de la cuadrícula u otros puntos de referencia tisulares significativos. Luego, retire la cuadrícula del portaobjetos, lávelo con agua destilada y seque suavemente los bordes.

Para realizar microscopía electrónica de transmisión, transfiera la rejilla al microscopio para su examen utilizando un voltaje de aceleración de 100 kilovoltios. Comience con un aumento bajo de aproximadamente 1.400X para desplazarse por la rejilla y localizar las regiones de interés (ROI) identificadas mediante microscopía óptica. Observe los puntos cuánticos individuales a un aumento de 70.000X o superior.

Aparecerán como estructuras cristalinas irregulares con densidad electrónica moderada. Luego, utilizando una cámara digital con un sensor monocromático de 1.392 por 1.040 píxeles en la interfaz gráfica del software de imagen, haga clic en el icono de cámara para encenderlo y adquirir las imágenes. Mueva el icono de cámara a la posición apagado para almacenar la imagen en la memoria de cuadros.

Para realizar imágenes de CLEM, utilice una impresión de las imágenes de microscopía óptica para localizar las ROI correspondientes mediante TEM. Las características arquitectónicas del tejido son útiles para navegar por la sección. Capture una imagen de la ROI correspondiente mediante TEM.

A continuación, para preparar una imagen de CLEM, asegúrese de que la imagen de MET esté correctamente orientada y ampliada al mismo tamaño y resolución que la imagen del microscopio óptico, en este caso, 300 píxeles por pulgada. Amplíe el tamaño del lienzo de la imagen de microscopía óptica al doble de su tamaño original. Luego, copie y pegue la imagen de MET al lado de la imagen de fluorescencia.

Para crear una superposición de fluorescencia en Photoshop CS2, haga clic en la herramienta de selección rectangular, seleccione la imagen de fluorescencia y cree una capa duplicada a partir de ella. Ajuste las opciones de fusión del estilo de capa a una transparencia del 30 al 40 %. Luego, haga clic en la herramienta de mover y arrastre la capa de superposición de fluorescencia sobre la imagen correspondiente de microscopía electrónica de transmisión (TEM), y alinee las imágenes.

Después de alinear las imágenes, aplane la imagen para producir la superposición final. Luego, utilice la herramienta de selección rectangular para seleccionar la nueva imagen superpuesta y cópiela en un lienzo nuevo. Finalmente, guarde la imagen como un archivo tf.

En esta imagen de microscopía de fluorescencia, las células tumorales individuales de somatostatinoma contienen abundantes gránulos secretorios y fueron marcadas positivamente para la hormona somatostatina. Los núcleos aparecieron como orificios oscuros y, a baja magnificación, se observó una fluorescencia granular anaranjada de puntos cuánticos (QD) de intensidad variable en el citoplasma. La región de interés (ROI) elegida mediante microscopía óptica fue identificada y capturada mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) con referencia a una imagen de microscopía óptica de 20X, como se indica aquí.

Con mayor aumento, la célula muestra una fluorescencia brillante y una marcación intensa con puntos cuánticos en gránulos citoplasmáticos. La superposición de los datos de fluorescencia sobre las imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM), como en este ejemplo, sugiere que la marcación positiva fuerte corresponde a gránulos que contienen material moderadamente denso al electrón dentro de la membrana limitante de la vesícula. Finalmente, como se observa aquí con mayor aumento, los gránulos moderadamente densos al electrón mostraron una inmunomarcación intensa con nanocristales de puntos cuánticos.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en ocho horas si se lleva a cabo correctamente. Al intentar el procedimiento, es importante recordar manipular las rejillas con cuidado, solo por los bordes. Tocar la sección al recoger la rejilla puede despegar la sección de la rejilla.

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la inmunomarcación múltiple para responder preguntas adicionales, por ejemplo si su proteína de interés se co-localiza con otra proteína. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la patología exploraran la localización de proteínas en tejidos humanos archivados procesados para microscopía electrónica. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo combinar la información inmunocitoquímica de la microscopía de fluorescencia con la ultraestructura de la microscopía electrónica de transmisión.

No olvide que trabajar con tetraóxido de osmio puede ser extremadamente peligroso, y se deben tomar precauciones como usar equipo de protección, trabajar en una campana extractora y desechar adecuadamente los residuos durante la realización de este procedimiento.