Uso de R, Seurat y CellChat para analizar un conjunto de datos transcriptómicos unicelulares de la cicatrización de heridas en la piel del ratón

En nuestro laboratorio, utilizamos herramientas emergentes como la transcriptómica unicelular y espacial con enfoques de biología de sistemas y bioinformática para investigar la dinámica celular espacio-temporal de los resultados de curación diferenciales. En los últimos años, hemos visto una rápida adopción de la transcriptómica unicelular para el estudio de la cicatrización de heridas en humanos y en organismos modelo, como ratones. El análisis completo de conjuntos de datos unicelulares es prohibitivo para los científicos de banco con poca o ninguna experiencia en bioinformática. Esto significa que, con demasiada frecuencia, los científicos infrautilizan los conjuntos de datos unicelulares en el campo de la cicatrización de heridas. Este es el primer protocolo integral que asume que no tiene experiencia previa con bioinformática, lo que lleva al usuario desde la descarga del conjunto de datos hasta la salida de análisis relevantes en el contexto de la investigación de curación de heridas. Nuestro protocolo debería servir como plantilla para que los investigadores de curación de heridas analicen más a fondo sus propios conjuntos de datos unicelulares y puedan extraer nuevos conocimientos de los conjuntos de datos disponibles públicamente.

[Shalyn] Para comenzar, navegue a los archivos del conjunto de datos desde el repositorio ómnibus de expresión génica utilizando el número de acceso GSE204777. Haga clic en el primer conjunto de datos titulado GSM6190913. Desplácese hasta la parte inferior de la página de GSM6190913 y descargue los tres archivos enumerados utilizando los enlaces FTP o HTML. Usando el explorador de archivos de la computadora, mueva los archivos descargados a un directorio llamado b1, asegurándose de que se encuentre dentro del directorio de trabajo. Recupere la información de ruta de acceso del directorio para los archivos de secuenciación de una sola célula que se descargaron. Ahora, cargue los archivos de secuenciación de una sola célula en el entorno de trabajo. Luego, separe los datos de HTO de expresión génica y multiplexación del conjunto de datos de trabajo. Cree un objeto Seurat utilizando los datos de expresión génica mientras filtra los genes detectados en menos de cinco células y las células con menos de 200 genes. Para los conjuntos de datos que carecen de datos de HTO, cree el objeto Seurat con los mismos parámetros de filtrado y cambie al ensayo de expresión génica. Calcule el porcentaje de genes mitocondriales en cada célula y asigne este valor como una variable de metadatos. Visualice la distribución de los recuentos de genes, el ARN total y el porcentaje de genes mitocondriales en todas las células. Elimine las células con un contenido mitocondrial superior al 25% utilizando un umbral y visualice las distribuciones actualizadas después de filtrar estas células de baja calidad. Detecte posibles dobletes utilizando el método de búsqueda de dobletes SC. Ejecute la canalización del buscador de dobletes SC mediante los comandos y asigne las puntuaciones de doblete resultantes como una nueva variable de metadatos. Ahora, visualice la distribución de las puntuaciones dobletes en todas las celdas. Elimine todas las celdas con puntuaciones dobles superiores a 0,25 y guarde el objeto Seurat limpiado como un archivo RDS en el directorio de trabajo. Realice normalización de datos, escalado y análisis de componentes principales. Visualice la contribución de la varianza en los primeros 50 componentes principales. Agrupe las celdas utilizando los primeros 13 componentes principales y una resolución de agrupación de 0.1. Realice una aproximación y proyección de variedad uniforme, o una reducción UMAP en el análisis de vecinos, utilizando los primeros 13 componentes principales y establezca el número de semilla en 123. Ahora, visualice la agrupación de celdas en un gráfico UMAP, seguido de anotaciones de tiempo y espacio enrollado en un gráfico UMAP. A continuación, genere una tabla que asocie grupos de celdas con anotaciones de tiempo y espacio enrollados. Determine las identidades de los principales tipos de células después de calcular los genes expresados diferencialmente entre todos los grupos y asigne las listas DEG resultantes a una variable antes de guardarlas como un archivo de texto delimitado en el directorio de trabajo. Ahora, abra el archivo de marcadores de clúster del conjunto de datos en una aplicación de hoja de cálculo. Utilice el Asistente para importación de texto para establecer la coma como delimitador y dar formato a las columnas de nombres de genes como texto para evitar la conversión automática de nombres de genes en fechas. En una hoja de cálculo, clasifique la columna de FC de registro promedio de mayor a menor para ordenar las filas disminuyendo los valores de cambio de registro doble, seguidos de la columna de clúster de menor a mayor. Para ordenar las filas aumentando los números de clúster de Seurat, filtre la columna FC de registro promedio dos para incluir solo valores mayores o iguales que 2,5 y, a continuación, filtre la columna PCT 1 para incluir valores mayores o iguales que 0,4. A continuación, filtre la columna PCT 2 para incluir valores menores o iguales que 0,2. Por último, filtre la columna ajustada por valor P para incluir valores menores o iguales a 0,01. Ahora, abra la herramienta de análisis de enriquecimiento basada en web de Enrichr. Para cada grupo, copie la lista de genes expresados diferencialmente en una ventana de Enrichr independiente y haga clic en analizar. A continuación, haga clic en la pestaña de tipos de celda situada encima de la salida del análisis y concéntrese en los cinco enriquecimientos principales de las tres bases de datos de marcadores de celda seleccionadas. En función de los enriquecimientos principales del análisis de Enrichr, asigne identidades probables a los ocho clústeres. Combine los grupos dos y seis en una sola anotación etiquetada como fibroblastos y asigne estas anotaciones como una nueva variable de metadatos denominada tipos de células. Luego, visualice los tipos de células anotados en un gráfico UMAP y muestre la localización de los genes marcadores de clúster superior en negrita en una serie de gráficos UMAP. Visualice los genes marcadores de clúster superior expresados diferencialmente en un diagrama de puntos agrupados por números de grupo originales, y luego los genes marcadores superiores nuevamente en un diagrama de puntos, esta vez agrupados por tipos de células anotados. Para prepararse para el análisis de series temporales, elimine la anotación espacial y simplifique el conjunto de datos. Reasigne los metadatos de tiempo y espacio de la herida en una nueva variable llamada DPW para Days Post Wounding. Visualice las nuevas agrupaciones de cursos de tiempo de DPW en un gráfico UMAP y genere tablas que muestren el número de celdas de cada tipo dentro de cada grupo DPW. A continuación, convierta los recuentos de células en proporciones para evaluar los cambios relativos en la composición del tipo de célula durante la curación y visualice la proporción de cada categoría de DPW dentro de cada tipo de célula. Finalmente, visualice la proporción de cada tipo de celda dentro de cada grupo DPW y guarde el objeto Seurat final que contiene todas las anotaciones y filtros como un archivo RDS en el directorio de trabajo. Todas las celdas del conjunto de datos se agruparon claramente en los principales tipos de células codificadas por colores en el gráfico UMAP, lo que confirma una anotación exitosa basada en firmas de tipos de células enriquecidas. La alta expresión de los genes marcadores de grupos superiores se localizó dentro de sus respectivos grupos de tipos celulares en los gráficos UMAP. La visualización del diagrama de puntos confirmó que los niveles más altos de expresión de los genes marcadores de conglomerados estaban restringidos a sus principales tipos de células anotadas. El gráfico de barras apiladas reveló que los neutrófilos y los macrófagos eran dominantes el primer día después de la herida, mientras que los fibroblastos, las células epiteliales y endoteliales se volvieron más frecuentes en puntos de tiempo posteriores, lo que refleja la cascada celular conocida de cicatrización de heridas.