Citometría de flujo y análisis unicelular para caracterizar la activación de la microglía en el desarrollo temprano del cerebro de ratón posnatal

Nuestra investigación explora cómo la microglía influye en la reparación cerebral después de una lesión cerebral prenatal. Y nuestro objetivo es determinar si la modulación de la actividad de las células microgliales puede mejorar los resultados neurológicos a largo plazo. Creo que es la complejidad de las respuestas de las células microgliales y los desafíos de describir esas respuestas de la manera más precisa para representar respuestas y enfermedades fisiológicas, pero también patológicas.

Estamos utilizando diferentes modalidades, como la secuenciación de ARN unicelular y los experimentos de citometría de flujo, para caracterizar los estados y la función microgliales en el cerebro en desarrollo después de una lesión prenatal. Un desafío importante es preservar la viabilidad celular y la identidad microglial durante el aislamiento, especialmente en los momentos neonatales cuando el número de células cerebelosas es limitado. Plantea preguntas sobre cómo las agresiones cerebelosas en la vida temprana conducen a una alteración transcripcional en la subpoblación microglial y cómo las terapias dirigidas podrían modular estos cambios.

Para comenzar, disecciona la región específica del cerebro de los ratones según sea necesario. Con fórceps, transfiera el tejido a una pequeña placa de Petri que contenga un medio de cultivo de células microgliales colocado en hielo para mantener la viabilidad celular. Con una pipeta, retire el medio de cultivo de células microgliales de la placa de Petri.

Luego, con un bisturí, corte finamente el tejido cerebral en la misma placa de Petri. Transfiera el tejido cerebral homogeneizado a tubos de cinco mililitros para la digestión enzimática. Agregue dos mililitros de solución salina equilibrada de Hanks suplementada con colagenasa D y DNasa 1 a cada tubo y selle las tapas herméticamente con Parafilm.

Luego, incube los tubos en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 15 minutos, agitándolos cada cinco minutos. Para detener la digestión, coloque los tubos en hielo. Luego, pase el homogeneizado a través de un filtro de malla metálica de 140 micrómetros para eliminar los desechos grandes.

Con un mortero de vidrio, disocie suavemente las células restantes en el filtro. Lave el filtro de malla metálica varias veces con tres mililitros de medio de cultivo de células microgliales para cada lavado. Ahora, usando una pipeta de 10 mililitros, recolecte el filtrado y transfiéralo a un tubo de 15 mililitros.

Luego, centrifugar el tubo a 500 g durante siete minutos a cuatro grados centígrados. Luego, invierte con cuidado el tubo para desechar el sobrenadante. Con una rejilla, raspe suavemente el tubo para volver a suspender el gránulo.

Luego, agregue 10 mililitros de una solución de medio coloidal a base de sílice al 37% a las celdas resuspendidas. Centrifugar la solución a 500 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados con una fuerza de rotura mínima. Con una pipeta de 10 mililitros, aspire la capa de mielina de la parte superior de la solución.

Para lavar las células, agregue 10 mililitros de solución salina equilibrada de Hanks y centrifugue el tubo a 500 g durante siete minutos a cuatro grados centígrados. Después de desechar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento, agregue 10 mililitros de tampón de clasificación de células activado por fluorescencia al tubo. Después de la centrifugación, vuelva a suspender el pellet final en el tampón restante para aplicaciones posteriores.

Transfiera todas las células aisladas a una placa de 96 pocillos con fondo cónico. Centrifugar la placa a 500 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Invierta rápidamente la placa con un solo movimiento para desechar el sobrenadante.

Luego, vuelva a suspender el gránulo celular en 25 microlitros de solución de bloqueo e incube la placa a temperatura ambiente durante 15 minutos. Para preparar la mezcla de tinción de anticuerpos extracelulares, centrifugar los tubos de stock de anticuerpos a 10.000 g para eliminar los agregados. Sin alterar el sedimento, aspire el volumen requerido del sobrenadante.

Con un tampón de clasificación de células activado por fluorescencia, ajuste el volumen total a 25 microlitros. Ahora, agregue 25 microlitros de la mezcla de tinción de anticuerpos extracelulares a cada pocillo e incube la placa durante 20 minutos a temperatura ambiente. Sin mezclar, agregue 150 microlitros de tampón de clasificación de células activado por fluorescencia a cada pocillo.

Centrifugar la placa a 500 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Luego, invierta la placa rápidamente para eliminar el sobrenadante con un solo movimiento. Vuelva a suspender el sedimento celular en 200 microlitros de tampón de clasificación de células activado por fluorescencia y centrifugue como se demostró anteriormente.

Vuelva a suspender las células en 100 microlitros de tampón de saponina-paraformaldehído para fijar y permeabilizar las células. Luego, incube la placa durante 10 minutos a temperatura ambiente, protegida de la luz. Sin mezclar, agregue 100 microlitros de tampón de saponina a cada pocillo.

Centrifugar la placa a 500 g durante seis minutos a cuatro grados centígrados. Luego, invierta la placa para eliminar el sobrenadante en un solo movimiento y vuelva a suspender el sedimento celular en 200 microlitros de tampón de saponina. A continuación, prepare controles de compensación agregando 20 microlitros de perlas a 11 pocillos vacíos.

Para preparar la mezcla de tinción de anticuerpos intracelulares, centrifugar tubos de stock de anticuerpos a 10.000 g para eliminar posibles agregados. Sin alterar el sedimento, aspire el volumen requerido del sobrenadante. Ajuste el volumen a 50 microlitros con tampón de saponina.

Luego, vuelva a suspender el sedimento celular en 50 microlitros de mezcla de anticuerpos intracelulares. Agregue un microlitro de cada anticuerpo a los respectivos pocillos de perlas e incube la placa durante 30 minutos a temperatura ambiente. Sin mezclar, agregue 150 microlitros de tampón de saponina a cada pocillo que contenga muestras de células.

Agregue 100 microlitros de tampón de clasificación de células activado por fluorescencia a cada pozo de control de compensación para lavar las perlas. Una vez centrifugada la placa, se vuelve a suspender el sedimento celular y se controla en 200 microlitros de tampón de saponina y tampón de clasificación celular activado por fluorescencia, respectivamente. Centrifugar la placa a 500 g durante seis minutos a cuatro grados centígrados y retirar el sobrenadante.

Vuelva a suspender tanto las muestras de células como los controles de compensación en 200 microlitros de tampón de clasificación de células activado por fluorescencia. Transfiera las suspensiones a tubos de clasificación de células activadas por fluorescencia etiquetados. La secuenciación de ARN unicelular identificó un grupo microglial distinto separado de otros tipos de células cerebrales según los perfiles transcripcionales.

El análisis de expresión diferencial reveló genes significativamente regulados al alza en la microglía, incluidos Csf1r, Fcrls, Fyb, Adap2 y P2ry12. Las células microgliales se aislaron con éxito de muestras cerebrales vivas en función de su expresión distintiva de marcadores CD45 y CD11b. Se identificaron distintas subpoblaciones microgliales basadas en combinaciones de marcadores de activación, incluidos CD80, CD86, iNOS, CD206 y Arg1, CD86 y CD64, y CD163 con CD206.

La expresión génica del marcador de Ptprc e Itgam se localizó específicamente en el grupo microglial en la proyección umap, lo que confirma la identidad de estas células. El análisis del gráfico de violín mostró una menor expresión de marcadores antiinflamatorios, como Fcgr1 y Cd86, en la microglía tratada en comparación con el control del vehículo.