Name: Citometría de flujo y análisis unicelular para caracterizar la activación de la microglía en el desarrollo temprano del cerebro de ratón posnatal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-03T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Aprende citometría de flujo y análisis unicelular para caracterizar la activación de la microglía en cerebelo de ratón posnatal. Este método revela la heterogeneidad celular y contribuye al estudio del desarrollo cerebral.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Berardi, N., Sale, A., Maffei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+structural+and+functional+development%3A+Genetics+and+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Med+Child+Neurol%22%5BJournal%5D)">Brain structural and functional development: Genetics and experience.</a> Dev Med Child Neurol. 57 (Suppl 2), 4-9 (2015).</li>
<li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+functional+alteration+and+increased+diversity+in+the+challenged+brain%3A+Insights+into+novel+targets+for+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun+Health%22%5BJournal%5D)">Microglial functional alteration and increased diversity in the challenged brain: Insights into novel targets for intervention.</a> Brain Behav Immun Health. 16, 100301(2021).</li>
<li>Salter, M. W., Beggs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublime+microglia%3A+Expanding+roles+for+the+guardians+of+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sublime microglia: Expanding roles for the guardians of the CNS.</a> Cell. 158 (1), 15-24 (2014).</li>
<li>Michell-Robinson, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+microglia+in+brain+development%2C+tissue+maintenance+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Roles of microglia in brain development, tissue maintenance and repair.</a> Brain. 138 (Pt 5), 1138-1159 (2015).</li>
<li>Nayak, D., Roth, T. L., Mcgavern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia development and function.</a> Annu Rev Immunol. 32, 367-402 (2014).</li>
<li>Mehl, L. C., Manjally, A. V., Bouadi, O., Gibson, E. M., Tay, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+brain+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Microglia in brain development and regeneration.</a> Development. 149 (8), dev200425(2022).</li>
<li>Mastenbroek, L. J. M., Kooistra, S. M., Eggen, B. J. L., Prins, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microglia+in+early+neurodevelopment+and+the+effects+of+maternal+immune+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">The role of microglia in early neurodevelopment and the effects of maternal immune activation.</a> Semin Immunopathol. 46 (1-2), 1(2024).</li>
<li>Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+dynamics+during+human+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglial dynamics during human brain development.</a> Front Immunol. 9, 1014(2018).</li>
<li>Srakocic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposed+practical+protocol+for+flow+cytometry+analysis+of+microglia+from+the+healthy+adult+mouse+brain%3A+Systematic+review+and+isolation+methods%27+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Proposed practical protocol for flow cytometry analysis of microglia from the healthy adult mouse brain: Systematic review and isolation methods' evaluation.</a> Front Cell Neurosci. 16, 1017976(2022).</li>
<li>Akhmetzyanova, E. R., Rizvanov, A. A., Mukhamedshina, Y. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+methods+for+the+microglia+isolation%3A+Overview+and+comparative+analysis+of+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Current methods for the microglia isolation: Overview and comparative analysis of approaches.</a> Cell Tissue Res. 395 (2), 147-158 (2024).</li>
<li>Walker, D. G., Lue, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+phenotypes+of+microglia+in+human+neurodegenerative+disease%3A+Challenges+to+detecting+microglial+polarization+in+human+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimers+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Immune phenotypes of microglia in human neurodegenerative disease: Challenges to detecting microglial polarization in human brains.</a> Alzheimers Res Ther. 7 (1), 56(2015).</li>
<li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+states+and+nomenclature%3A+A+field+at+its+crossroads%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads.</a> Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).</li>
<li>Hammond, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+of+microglia+throughout+the+mouse+lifespan+and+in+the+injured+brain+reveals+complex+cell-state+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing of microglia throughout the mouse lifespan and in the injured brain reveals complex cell-state changes.</a> Immunity. 50 (1), 253-271.e6 (2019).</li>
<li>Bernier, L. P., York, E. M., Macvicar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunometabolism+in+the+brain%3A+How+metabolism+shapes+microglial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Immunometabolism in the brain: How metabolism shapes microglial function.</a> Trends Neurosci. 43 (11), 854-869 (2020).</li>
<li>Butovsky, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+unique+TGF-%CE%B2-dependent+molecular+and+functional+signature+in+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification of a unique TGF-β-dependent molecular and functional signature in microglia.</a> Nat Neurosci. 17 (1), 131-143 (2014).</li>
<li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environment+drives+selection+and+function+of+enhancers+controlling+tissue-specific+macrophage+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Environment drives selection and function of enhancers controlling tissue-specific macrophage identities.</a> Cell. 159 (6), 1327-1340 (2014).</li>
<li>Chometon, T. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+rapid+monocyte+isolation+and+generation+of+singular+human+monocyte-derived+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A protocol for rapid monocyte isolation and generation of singular human monocyte-derived dendritic cells.</a> PLoS One. 15 (4), e0231132(2020).</li>
<li>Skog, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+enzymatic+digestion+on+cultured+epithelial+autografts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">The effect of enzymatic digestion on cultured epithelial autografts.</a> Cell Transplant. 28 (5), 638-644 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>140 &micro; M Filtro de malla metálica&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3895</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de 15 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de 5 ml</td><td>Sarstedt</td><td>55.526.006</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos con fondo cónico</td><td>Sarstedt</td><td>82.1583.001</td><td></td></tr><tr><td>Arginasa 1 - Conjugado Pecy7 - Clon: A1exF5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25-3697-82</td><td></td></tr><tr><td>Reactivos fluorescentes estables en la mesa</td><td>Invitrogen</td><td>A49905</td><td></td></tr><tr><td>CD11b - Conjugado Fitc - Clon: M1/70</td><td>BD Pharmingen</td><td>553310</td><td></td></tr><tr><td>CD163 - Conjugado SB600 - Clon: TNKUPJ</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>63-1631-82</td><td></td></tr><tr><td>CD206 - APC conjugado - Clon: C068C2</td><td>BioLeyenda</td><td>141708</td><td></td></tr><tr><td>CD45 - Conjugado A700 - Clon: 30-F11</td><td>BD Pharmingen</td><td>560510</td><td></td></tr><tr><td>CD64 - Conjugado PerCP-eF710 - Clonar : X54-5/7.1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-0641-82</td><td></td></tr><tr><td>CD80 - Conjugado SB436 - Clon: 16-10A1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62-0801-82</td><td></td></tr><tr><td>CD86 - Conjugado Pe - Clon : GL-1</td><td>BioLeyenda</td><td>105008</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa D</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>ADNasa I</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Sigma&ndash; Aldrich&nbsp;</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (solución salina equilibrada de Hank) 10x</td><td>Wisent Bioproducts&nbsp;</td><td>311506CL</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>vwr internacional</td><td>82030-470</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Wisent Bioproducts&nbsp;</td><td>330.050.EL</td><td></td></tr><tr><td>iNOS - Conjugado PE- eF610 - Clonar : CXNFT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61-5920-82</td><td></td></tr><tr><td>Kcl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Amcyan vivo / muerto</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>Medios de cultivo de células microgliales</td><td>Tecnologías de la vida</td><td>A12475-01</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehido</td><td>Sigma&ndash; Aldrich&nbsp;</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Antirata antiratón CD16/CD32</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma&ndash; Aldrich&nbsp;</td><td>S7900</td><td></td></tr><tr><td>Bibliotecas scRNAseq</td><td>Genómica 10X</td><td>1000121</td><td></td></tr><tr><td>Medio coloidal a base de sílice</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>45001747</td><td></td></tr><tr><td>Azida sódica</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP922I-500</td><td></td></tr><tr><td>Azul de tripano</td><td>Gibco</td><td>1525006</td><td></td></tr></tbody></table>

citometría de flujo y análisis unicelular para caracterizar la activación de la microglía en el desarrollo temprano del cerebro de ratón posnatal

Flow Cytometry and Single-Cell Analysis for Characterizing Microglia Activation in Early Postnatal Mouse Brain Development

Este protocolo utiliza eficazmente la citometría de flujo para caracterizar las poblaciones de células microgliales en muestras de cerebro de ratón, basándose en la expresión de marcadores de superficie e intracelulares seleccionados. Las siguientes secciones detallan los resultados obtenidos de los pasos clave del flujo de trabajo, destacando la distribución y heterogeneidad de los subconjuntos de microglía en respuesta a las condiciones experimentales.
Validación de la estrategia de compensación y cierre Se utilizaron perlas de compensación para calibrar las señales de fluorescencia y corregir la superposición espectral entre fluorocromos. Las poblaciones positivas y negativas para cada fluorocromo se separaron claramente, lo que permitió una generación precisa de matrices de compensación. Los umbrales de activación se validaron inicialmente utilizando el control Fluorescence Minus One (FMO) durante la optimización del panel para distinguir la señal real del fondo, particularmente para marcadores deficientes o superpuestos. Estos umbrales se reutilizaron posteriormente en experimentos utilizando el mismo panel de tinción y la misma configuración del citómetro para garantizar la consistencia. Se incluyeron controles de isotipo para monitorear la posible unión no específica, particularmente para marcadores intracelulares, pero no se utilizaron para tomar decisiones de compuerta.
Identificación de células microgliales La estrategia de activación de células vivas/muertas (Amcyan) excluyó con éxito las células muertas. La estrategia de activación aisló eficazmente las poblaciones de células microgliales basadas en la expresión de CD45 (AF700) y CD11b (FITC). Los parámetros de dispersión directa (FSC) y dispersión lateral (SSC) se optimizaron (FSC = 300, SSC = 200) para centrar la población de microglía dentro del diagrama de puntos (Figura 5).
Fenotipado de células microgliales El análisis de diagrama de puntos permitió la identificación de subpoblaciones de microglía basadas en la expresión diferencial de marcadores de superficie e intracelulares. Utilizando estrategias de activación específicas en el software FlowJo, se identificó un subconjunto de células microgliales que expresan CD80 (Super Bright 436), CD86 (PE) e iNOS (PE-eFluor 610) (Figura 6A). También se utilizó la doble compuerta para definir subconjuntos que expresan CD206 (APC) y Arg1 (PE-Cy7) (ver Figura 6B). Las poblaciones adicionales se caracterizaron por la coexpresión de CD86 (PE) y CD64 (PerCP-eFluor 710), así como CD163 (Super Bright 600) y CD206 (APC) (Figura 6C, D). Estos perfiles fenotípicos reflejan la heterogeneidad definida por marcadores dentro de la población de microglía y demuestran la capacidad de este protocolo para distinguir múltiples subconjuntos transcripcionales e inmunológicamente distintos sin inferir estados funcionales fijos.
Análisis unicelular de microglía Se utilizó la aproximación y proyección de variedades uniformes (UMAP) para visualizar la heterogeneidad celular e identificar los grupos de células microgliales entre otros tipos de células cerebrales. Cada punto representa una sola célula y el grupo está codificado por colores según la similitud transcripcional (Figura 2).
Se realizó un análisis de expresión diferencial dentro del grupo de microglía para identificar genes modulados en condiciones experimentales. Los genes con un valor de p ajustado ≤ 0,05 se consideraron expresados diferencialmente.
Se generó un gráfico de volcán para visualizar estos genes expresados diferencialmente de las células microgliales, destacando aquellos con alto cambio de pliegue y significación estadística (Figura 4).
Para comparar el resultado de estas células individuales con los datos de citometría de flujo, se examinó la expresión de los marcadores de microglía CD45 y CD11b (Ptprc e Itgam). Un UMAP muestra su expresión dentro de diferentes poblaciones celulares (Figura 7).
Finalmente, se evaluó la expresión de marcadores relacionados con el sistema inmunitario seleccionados para caracterizar la heterogeneidad transcripcional entre las células microgliales. Un gráfico de violín muestra la expresión de genes como CD80 y NOS-, así como Mrc1, Arg1, Fcgr1 y CD163 a nivel de una sola célula (Figura 8). Estos patrones de expresión de marcadores permiten la comparación con perfiles basados en citometría de flujo y resaltan la diversidad molecular de los subconjuntos microgliales en condiciones experimentales.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig1.jpg"> 
Figura 1: Control de calidad de datos transcriptómicos unicelulares. (A) Distribución del contenido de ARN mitocondrial a través de las células. Se excluyeron las células con &gt;30% de ARN mitocondrial para eliminar las células potencialmente estresadas o moribundas. (B) Las células con un log10GenesPerUMI &gt; 0,75 se filtraron para garantizar una relación gen-UMI consistente y reducir el ruido de las bibliotecas de baja complejidad. (C) Las células con menos de 500 transcripciones detectadas (nUMI) o más de 300 genes detectados (nGENE) también se excluyeron para eliminar células múltiples o de mala calidad. (D) Gráfico de correlación de NUMI versus nGene que ilustra el impacto de los umbrales de filtrado. Se eliminaron los dobletes detectados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig2.jpg"> 
Figura 2: Visualización UMAP de transcriptomas unicelulares. Gráfico UMAP que muestra la distribución de células individuales basadas en perfiles transcriptómicos obtenidos de dos animales individuales. Cada punto representa una celda, codificada por colores por identidad de clúster. El grupo de células microgliales se identifica entre otras poblaciones celulares. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig3.jpg"> 
Figura 3: Curva ROC del clasificador de Random Forest evaluado mediante validación cruzada. Curva de características operativas del receptor (ROC) que ilustra el rendimiento del modelo de bosque aleatorio utilizado para distinguir la microglía de otros tipos de células cerebrales en función de los perfiles de expresión génica. El modelo se entrenó en un conjunto de ~ 1000 celdas con etiquetas conocidas y se evaluó mediante validación cruzada de 10 veces. Entre los cinco modelos estadísticos probados (Random Forest, regresión logística, Bayes ingenuo, máquina de vectores de soporte y árbol de decisión), el modelo Random Forest logró el mayor rendimiento de clasificación. El área bajo la curva (AUC) refleja la precisión del modelo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig4.jpg"> 
Figura 4: Análisis diferencial de expresión génica en células microgliales. Gráfico de volcán que representa el cambio log2 de pliegues frente al valor P ajustado para genes expresados diferencialmente en microglía entre los dos grupos experimentales (control frente a lesión cerebral cerebelosa). El gen regulado al alza se expresa más en el grupo de interés (ident.1), y los genes regulados a la baja muestran una expresión reducida en comparación con el grupo de referencia (ident.2). Los genes clave expresados significativamente diferencialmente están etiquetados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig5.jpg"> 
Figura 5: Estrategia de activación para la identificación de microglía mediante citometría de flujo. (A) Estrategia de activación aplicada a células cerebelosas de un ratón de control postnatal de día 3 (P3). (B) Se seleccionaron camisetas sin mangas para excluir dobletes. (C) Las células viables se identificaron utilizando un tinte de viabilidad; se excluyeron los eventos con bajo FSC-A para eliminar los desechos y garantizar el análisis de las células intactas. (D) La microglía se identificó como CD45+ y CD11b+ con dos poblaciones distintas: CD45 low-CD11bint para microglía inactiva y CD45int -CD11balto para microglía activada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig6.jpg"> 
Figura 6. Caracterización de perfiles de expresión de marcadores de microglía mediante citometría de flujo. (A) Activación secuencial de células CD45+ CD11b+ basada en la expresión de CD80, CD86 e iNOS. (B) Identificación de un subconjunto que expresa CD206, seguido de una activación basada en la expresión de Arg1. (C) Identificación de un subconjunto que expresa CD86, seguido de una activación basada en la expresión de CD64. (D) Identificación de un subconjunto que expresa CD163, seguido de una activación basada en la expresión de CD206. Estas estrategias de activación ilustran la heterogeneidad fenotípica de las poblaciones de microglía basadas en la expresión de marcadores de superficie e intracelulares. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig7.jpg"> 
Figura 7: Confirmación de la identidad de la microglía mediante la expresión de Itgam y Ptprc en datos de secuenciación de ARN unicelular. UMAP muestra el paisaje transcripcional de las células cerebelosas en P15, con la expresión génica de Itgam y Ptprc superpuesta a través de grupos. La coexpresión de estos marcadores mieloides canónicos apoya la identificación de poblaciones de microglía y se alinea con los marcadores utilizados en citometría de flujo, proporcionando una validación cruzada entre los análisis transcriptómicos y a nivel de proteína. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig8.jpg"> 
Figura 8: Perfiles de expresión de genes relacionados con el sistema inmunitario seleccionados en células microgliales identificadas mediante secuenciación de ARN unicelular. Los gráficos de violín muestran la distribución de la expresión génica para CD80, NOS2, Mrc1, Arg1, Fcgr1 y CD163 en células microgliales individuales. Estos marcadores se asocian comúnmente con procesos relacionados con el sistema inmunológico e ilustran la heterogeneidad transcripcional observada dentro de la población microglial. Se muestran datos para las condiciones de control y lesión cerebral cerebelosa (CBI). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1: Composición de las soluciones utilizadas para el aislamiento y la tinción de células neurales. Esta tabla proporciona una composición detallada de las soluciones necesarias para el aislamiento y la tinción celular, incluidas sus respectivas concentraciones y componentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/Table%201.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla 2: Concentraciones de mezcla de anticuerpos para tinción extracelular. Esta tabla detalla las concentraciones de anticuerpos y la solución viva/muerta utilizada para la tinción extracelular, especificando los volúmenes y diluciones requeridos para cada anticuerpo en la mezcla de tinción para una muestra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/Table%202.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla 3: Concentraciones de mezcla de anticuerpos para tinción intracelular. Esta tabla detalla las concentraciones de anticuerpos utilizados para la tinción intracelular, especificando los volúmenes y diluciones requeridos para cada anticuerpo en la mezcla de tinción para una muestra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/Table%203.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>

Citometría de flujo y análisis unicelular para caracterizar la activación de la microglía en el desarrollo temprano del cerebro de ratón posnatal

Microglia, the brain's resident immune cells, exhibit region and context-specific transcriptional profiles during development and disease. This protocol ...

Nuestra investigación explora cómo la microglía influye en la reparación cerebral después de una lesión cerebral prenatal. Y nuestro objetivo es determinar si la modulación de la actividad de las células microgliales puede mejorar los resultados neurológicos a largo plazo. Creo que es la complejidad de las respuestas de las células microgliales y los desafíos de describir esas respuestas de la manera más precisa para representar respuestas y enfermedades fisiológicas, pero también patológicas.Estamos utilizando diferentes modalidades, como la secuenciación de ARN unicelular y los experimentos de citometría de flujo, para caracterizar los estados y la función microgliales en el cerebro en desarrollo después de una lesión prenatal. Un desafío importante es preservar la viabilidad celular y la identidad microglial durante el aislamiento, especialmente en los momentos neonatales cuando el número de células cerebelosas es limitado. Plantea preguntas sobre cómo las agresiones cerebelosas en la vida temprana conducen a una alteración transcripcional en la subpoblación microglial y cómo las terapias dirigidas podrían modular estos cambios.Para comenzar, disecciona la región específica del cerebro de los ratones según sea necesario. Con fórceps, transfiera el tejido a una pequeña placa de Petri que contenga un medio de cultivo de células microgliales colocado en hielo para mantener la viabilidad celular. Con una pipeta, retire el medio de cultivo de células microgliales de la placa de Petri.Luego, con un bisturí, corte finamente el tejido cerebral en la misma placa de Petri. Transfiera el tejido cerebral homogeneizado a tubos de cinco mililitros para la digestión enzimática. Agregue dos mililitros de solución salina equilibrada de Hanks suplementada con colagenasa D y DNasa 1 a cada tubo y selle las tapas herméticamente con Parafilm.Luego, incube los tubos en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 15 minutos, agitándolos cada cinco minutos. Para detener la digestión, coloque los tubos en hielo. Luego, pase el homogeneizado a través de un filtro de malla metálica de 140 micrómetros para eliminar los desechos grandes.Con un mortero de vidrio, disocie suavemente las células restantes en el filtro. Lave el filtro de malla metálica varias veces con tres mililitros de medio de cultivo de células microgliales para cada lavado. Ahora, usando una pipeta de 10 mililitros, recolecte el filtrado y transfiéralo a un tubo de 15 mililitros.Luego, centrifugar el tubo a 500 g durante siete minutos a cuatro grados centígrados. Luego, invierte con cuidado el tubo para desechar el sobrenadante. Con una rejilla, raspe suavemente el tubo para volver a suspender el gránulo.Luego, agregue 10 mililitros de una solución de medio coloidal a base de sílice al 37% a las celdas resuspendidas. Centrifugar la solución a 500 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados con una fuerza de rotura mínima. Con una pipeta de 10 mililitros, aspire la capa de mielina de la parte superior de la solución.Para lavar las células, agregue 10 mililitros de solución salina equilibrada de Hanks y centrifugue el tubo a 500 g durante siete minutos a cuatro grados centígrados. Después de desechar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento, agregue 10 mililitros de tampón de clasificación de células activado por fluorescencia al tubo. Después de la centrifugación, vuelva a suspender el pellet final en el tampón restante para aplicaciones posteriores.Transfiera todas las células aisladas a una placa de 96 pocillos con fondo cónico. Centrifugar la placa a 500 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Invierta rápidamente la placa con un solo movimiento para desechar el sobrenadante.Luego, vuelva a suspender el gránulo celular en 25 microlitros de solución de bloqueo e incube la placa a temperatura ambiente durante 15 minutos. Para preparar la mezcla de tinción de anticuerpos extracelulares, centrifugar los tubos de stock de anticuerpos a 10.000 g para eliminar los agregados. Sin alterar el sedimento, aspire el volumen requerido del sobrenadante.Con un tampón de clasificación de células activado por fluorescencia, ajuste el volumen total a 25 microlitros. Ahora, agregue 25 microlitros de la mezcla de tinción de anticuerpos extracelulares a cada pocillo e incube la placa durante 20 minutos a temperatura ambiente. Sin mezclar, agregue 150 microlitros de tampón de clasificación de células activado por fluorescencia a cada pocillo.Centrifugar la placa a 500 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Luego, invierta la placa rápidamente para eliminar el sobrenadante con un solo movimiento. Vuelva a suspender el sedimento celular en 200 microlitros de tampón de clasificación de células activado por fluorescencia y centrifugue como se demostró anteriormente.Vuelva a suspender las células en 100 microlitros de tampón de saponina-paraformaldehído para fijar y permeabilizar las células. Luego, incube la placa durante 10 minutos a temperatura ambiente, protegida de la luz. Sin mezclar, agregue 100 microlitros de tampón de saponina a cada pocillo.Centrifugar la placa a 500 g durante seis minutos a cuatro grados centígrados. Luego, invierta la placa para eliminar el sobrenadante en un solo movimiento y vuelva a suspender el sedimento celular en 200 microlitros de tampón de saponina. A continuación, prepare controles de compensación agregando 20 microlitros de perlas a 11 pocillos vacíos.Para preparar la mezcla de tinción de anticuerpos intracelulares, centrifugar tubos de stock de anticuerpos a 10.000 g para eliminar posibles agregados. Sin alterar el sedimento, aspire el volumen requerido del sobrenadante. Ajuste el volumen a 50 microlitros con tampón de saponina.Luego, vuelva a suspender el sedimento celular en 50 microlitros de mezcla de anticuerpos intracelulares. Agregue un microlitro de cada anticuerpo a los respectivos pocillos de perlas e incube la placa durante 30 minutos a temperatura ambiente. Sin mezclar, agregue 150 microlitros de tampón de saponina a cada pocillo que contenga muestras de células.Agregue 100 microlitros de tampón de clasificación de células activado por fluorescencia a cada pozo de control de compensación para lavar las perlas. Una vez centrifugada la placa, se vuelve a suspender el sedimento celular y se controla en 200 microlitros de tampón de saponina y tampón de clasificación celular activado por fluorescencia, respectivamente. Centrifugar la placa a 500 g durante seis minutos a cuatro grados centígrados y retirar el sobrenadante.Vuelva a suspender tanto las muestras de células como los controles de compensación en 200 microlitros de tampón de clasificación de células activado por fluorescencia. Transfiera las suspensiones a tubos de clasificación de células activadas por fluorescencia etiquetados. La secuenciación de ARN unicelular identificó un grupo microglial distinto separado de otros tipos de células cerebrales según los perfiles transcripcionales.El análisis de expresión diferencial reveló genes significativamente regulados al alza en la microglía, incluidos Csf1r, Fcrls, Fyb, Adap2 y P2ry12. Las células microgliales se aislaron con éxito de muestras cerebrales vivas en función de su expresión distintiva de marcadores CD45 y CD11b. Se identificaron distintas subpoblaciones microgliales basadas en combinaciones de marcadores de activación, incluidos CD80, CD86, iNOS, CD206 y Arg1, CD86 y CD64, y CD163 con CD206.La expresión génica del marcador de Ptprc e Itgam se localizó específicamente en el grupo microglial en la proyección umap, lo que confirma la identidad de estas células. El análisis del gráfico de violín mostró una menor expresión de marcadores antiinflamatorios, como Fcgr1 y Cd86, en la microglía tratada en comparación con el control del vehículo.

flow-cytometry-single-cell-analysis-for-characterizing-microglia

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

La microglía se macrófagos residentes que proporcionan la primera línea de defensa y de vigilancia inmune del sistema nervioso central. Los microARN son moléculas reguladoras que juegan un papel importante en muchos procesos fisiológicos, incluida la activación y diferenciación de los macrófagos. En este artículo se describe el método para la medición de los microRNAs en la microglía.

La detección de microARNs en la microglía por PCR en tiempo real en el SNC normal y durante la neuroinflamación

Una clave para el éxito de la investigación de la biología microglial es la preservación de immunofunction microglial ex vivo durante el aislamiento del tejido del SNC. Aislar microglia mediante agitación rotatoria resultados en cultivos de células de alta pureza y inmunofuncional según la evaluación de imágenes fluorescentes, inmunocitoquímica y ELISA después de la activación microglia con el lipopolisacárido estímulos proinflamatorias (LPS) y Pam 3 CSK 4 (Pam).

Aislamiento de cortical Microglia con Inmunofenotipo Conservas y funcionalidad de murinos Neonatos

La activación de la microglia y microgliosis son respuestas clave a la neurodegeneración crónica. A continuación, presentamos los métodos para in vivo, visualización a largo plazo de la retina células microgliales CX3CR1-GFP + por oftalmoscopía confocal y de umbral y los análisis morfométricos para identificar y cuantificar su activación. Hacemos un seguimiento de los cambios microgliales durante las primeras etapas del glaucoma relacionada con la edad.

En Vivo Dinámica de Retina Microglial Activación Durante Neurodegeneración: Confocal oftalmoscópico Imaging y Morfometría celular en el ratón Glaucoma

Este protocolo proporciona un análisis de las subpoblaciones de macrófagos en el sistema nervioso central del ratón adulto mediante citometría de flujo y es útil para el estudio de múltiples marcadores expresados ​​por estas células.

Análisis de microglia y macrófagos derivados de monocitos del sistema nervioso central por citometría de flujo

Se presenta un protocolo para el aislamiento de primaria microglia del cerebro murino. Esta técnica ayuda a promover la comprensión actual de condiciones neurológicas. Centrifugación de gradiente de densidad y separación magnética se combinan para producir suficiente rendimiento de una muestra muy pura. Además, describiremos los pasos para la caracterización de la microglia.

Caracterización y aislamiento de Microglia primarios de ratón por centrifugación de gradiente de densidad

Los cultivos primarios de microglía se utilizan comúnmente para evaluar nuevas moléculas antiinflamatorias. El presente protocolo describe un método reproducible y relevante para aislar magnéticamente la microglía de cachorros neonatos.

Aislamiento magnético de células microgliales de ratones neonatos para cultivos celulares primarios

Aquí, presentamos un protocolo para aislar y purificar la microglía primaria en modelos animales de enfermedades desmielinizantes, utilizando la clasificación de células activadas magnéticamente columnares.

Aislamiento de la microglía primaria del ratón mediante clasificación celular activada magnéticamente en modelos animales de desmielinización

En este trabajo se describe un protocolo para la cuantificación de modificaciones globales de histonas mediante citometría de flujo intranuclear en microglía cerebral aislada. El trabajo también contiene el protocolo de aislamiento de microglía que se utilizó para la recolección de datos.

Cuantificación de las modificaciones postraduccionales globales de histonas mediante citometría de flujo intranuclear en microglía cerebral de ratón aislada

Aquí presentamos dos protocolos para cuantificar el envolvimiento microglial de sinapsis positivas para vGLUT1 y sinaptosomas crudos marcados con pHRodo Red mediante citometría de flujo.

Cuantificación de la envolvimiento microglial de material sináptico mediante citometría de flujo

El presente protocolo describe cómo aislar y purificar la microglía primaria del hipocampo de ratones adultos, seguido de instrucciones para realizar registros de patch-clamp de células completas en estas células agudamente aisladas.

Aislamiento y registro de microglía del hipocampo de ratones adultos

Aprende citometría de flujo y análisis unicelular para caracterizar la activación de la microglía en cerebelo de ratón posnatal. Este método revela la heterogeneidad celular y contribuye al estudio del desarrollo cerebral.

Citometría de flujo y análisis unicelular para caracterizar la activación de la microglía en el desarrollo temprano del cerebro de ratón posnatal (Video) | JoVE Journal

Citometría de flujo y análisis unicelular para caracterizar la activación de la microglía en el desarrollo temprano del cerebro de ratón posnatal

Explorar más videos