Flujo de trabajo de imágenes y análisis de alto rendimiento para evaluar los fenotipos de las células de la piel y los estados de proliferación en muestras de tejido

La combinación de blanqueo iterativo-extendido-multiplexidad (IBEX) y un ensayo comercial de etiquetado de nucleótidos (Click-iT EdU) permite la detección y categorización de tipos de células en división en procesos altamente dinámicos en secciones fijas de tejido murino congelado. Además, una novedosa canalización de procesamiento de imágenes de código abierto proporciona adquisición y análisis de imágenes de alto rendimiento.

Este protocolo combina el método de imágenes ópticas multiplex, el etiquetado IBEX y Click-iT EDU para detectar y categorizar tipos de células en división en procesos altamente dinámicos, como la reparación de la piel. Además, proporcionamos una novedosa canalización de procesamiento de imágenes de código abierto para la adquisición y el análisis de imágenes de alto rendimiento. Cubra la placa de 24 pocillos con 200 microlitros de gelatina de cromo y aluminio e incube la placa durante 15 minutos en una coctelera basculante.

Luego retire completamente la gelatina y seque los pocillos recubiertos durante 60 minutos en un horno a 40 grados. Corte el tejido incrustado en OCT con un grosor de 15 a 30 micrómetros en el criostato y transfiéralo rápidamente a un pocillo recubierto que contenga dos mililitros de PBS. Retire con cuidado el PBS con una pipeta de un mililitro con el objetivo de mantener la sección de tejido centrada en el pocillo.

Para hacer esto de manera efectiva, aspire lentamente el PBS desde los bordes del pocillo, ajustando la posición de la pipeta según sea necesario para evitar que el tejido se mueva. Seque las secciones de tejido durante una hora en un horno a 37 grados centígrados. Rehidratar con un mililitro de PBS durante cinco minutos.

Permeabilizar el tejido con 500 microlitros de Tritón al 0,5% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Lave el pañuelo brevemente dos veces con PBS y realice la reacción Click-iT durante 30 minutos a temperatura ambiente. Mantenga las muestras protegidas de la luz.

Lave el pañuelo brevemente dos veces con PBS. Bloquee durante una hora con un tampón de bloqueo a temperatura ambiente. Agregue los anticuerpos primarios para el primer ciclo.

E incube la placa durante la noche a cuatro grados centígrados. Lavar con PBS tres veces. Realice la tinción secundaria de anticuerpos.

Para el primer ciclo, aplique los anticuerpos secundarios para los anticuerpos primarios desacoplados junto con una contratinción nuclear. Incubar las muestras protegidas de la luz durante 60 minutos a temperatura ambiente. Lave el pañuelo tres veces con un mililitro de PBS durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Deje unos 500 microlitros de PBS en cada pocillo y lleve la placa al microscopio. En el software Meta Express, haz clic en Selección y luego en Configuración de adquisición. Haga clic en el botón Expulsar.

Limpie la parte inferior de la placa con etanol al 70% e inserte la placa en el microscopio. Haga clic en el botón Cargar placa. En la pestaña Objetivo y cámara, seleccione la ampliación deseada.

Como modo de adquisición, seleccione el modo de hendidura confocal de 51 micrómetros. En la pestaña Placa, seleccione el modelo de placa. Vaya a la pestaña Visitas a sitios de placas.

En Opciones del sitio, haga clic en número fijo de sitios. Establezca el número de columnas y filas de modo que se cubra aproximadamente todo el pozo. Haga clic en los sitios de superposición 10%Seleccione solo el primer pozo para la adquisición haciendo clic derecho en el pozo correspondiente en el mapa de placas.

Vaya a la pestaña Enfoque automático de adquisición. Para el enfoque automático de pocillo a pocillo, seleccione la opción de placa y fondo de pocillos. Para el enfoque automático del sitio, seleccione la opción Todos los sitios.

Vaya a la pestaña Longitudes de onda y elija el número de tintes que se van a fotografiar en el ciclo actual. Vaya a la primera pestaña de longitud de onda. Elija un láser con desplazamiento Z para el posicionamiento Z y haga clic en el botón Calcular desplazamiento para establecer la altura de imagen correcta.

Elija la imagen en la que la muestra esté mejor enfocada. Presione el botón Focus. Se muestra una imagen enfocada del tejido.

Establezca la potencia de iluminación en 50%Establezca la intensidad máxima objetivo en 2000 y presione Exposición automática. Para la serie Z, elija la serie Z y la imagen de proyección 2D, y para la corrección de sombreado, elija solo sombreado FL. Repita los pasos para otras longitudes de onda, pero en lugar de láser con desplazamiento Z, elija desplazamiento Z de W1 y elija cero.

Vaya al paso de la serie Z e introduzca el tamaño de paso deseado. Haga clic en el botón Enfoque. Arrastre la flecha de posición actual hasta llegar a la parte inferior del tejido y haga clic en el botón Establecer B.

Arrastre la flecha de posición a la parte superior del tejido y haga clic en el botón Establecer T. Haga clic en F2, Detener, presione Iniciar en vivo nuevamente. Asegúrese de que la etapa esté en el primer pozo haciendo clic izquierdo sobre él.

Encuentre el borde del tejido y marque todos los sitios que contienen tejido para su adquisición haciendo clic con el botón derecho. Vaya a la pestaña Ejecutar y escriba el nombre de la placa. Haga clic en Guardar protocolo.

Configure la región de adquisición para todos los demás pozos. Ejecute Control, Diario, inicie la grabación y luego inmediatamente Control, Diario, detenga la grabación. Guarde el diario creado y ábralo nuevamente a través de Control, Diario, Editar diario.

En el panel izquierdo, vaya a Adquisición de placas, cargue el protocolo desde el archivo y haga clic en Adquisición de placas para agregar esos pasos al diario. Haga doble clic en Editar adquisición de placas, cargue el protocolo desde el archivo y elija el protocolo guardado para el primer pocillo. Repita los pasos para cada pozo a adquirir, asegurándose de cargar siempre el protocolo respectivo.

Haga clic en Ejecutar diario para iniciar la adquisición. 30 minutos antes del final del diario, comience a preparar el reactivo blanqueador. Disuelva 10 miligramos de borohidruro de litio en 10 mililitros de H2O de doble destilación y pase por un filtro de 0,22 micrómetros.

Dejar actuar durante 10 minutos. La solución debería comenzar a formar burbujas. Para garantizar un blanqueo eficaz, utilice el reactivo blanqueador dentro de las cuatro horas posteriores a la preparación.

Agregue la solución blanqueadora a las muestras e incube durante 15 minutos mientras mantiene las muestras expuestas a la luz ambiental. Deben aparecer pequeñas burbujas en el tejido. Lave las muestras blanqueadas tres veces con un mililitro de PBS durante cinco minutos, cada una a temperatura ambiente.

Agregue los anticuerpos primarios para el siguiente ciclo e incube durante la noche a cuatro grados centígrados. Las imágenes IBEX multiplexadas combinadas con el etiquetado Click-iT EDU revelan diferentes estructuras y tipos de células proliferantes en la piel herida. El marcado de EDU en muestras criopreservadas muestra ser similar cuando se realiza el marcado de inmunofluorescencia de anticuerpos para KI-67 en secciones de tejido incluidas en parafina, así como cuando se marcan células con KI 67 mediante citometría de flujo.

El uso de este protocolo permite una detección precisa de la proliferación celular en procesos biológicos complejos. Además, la canalización de procesamiento de imágenes de código abierto no requiere ninguna experiencia en programación y genera archivos que se pueden procesar con software no comercial, como Fiji y quPath. Además, este protocolo no requiere ningún equipo costoso y, por lo tanto, se puede realizar en la mayoría de los entornos de investigación.