Cuantificación de la absorción de ácidos grasos endoteliales utilizando análogos de ácidos grasos fluorescentes

Los nutrientes transmitidos por la sangre, al igual que los ácidos grasos, deben atravesar una barrera endotelial capilar para entrar en el tejido metabólico mediante un mecanismo poco conocido. Aclarar estos procesos podría revelar nuevos objetivos terapéuticos para tratar enfermedades metabólicas, como la diabetes tipo 2. Así que descubrimos que tanto el músculo bisturí como el tejido adiposo regulan la captación y el transporte de lípidos endoteliales utilizando metabolitos paracrinos, también parcialmente controlados por el sistema endocrino.

Y también hemos comprobado que el ATP mitocondrial contribuye inesperadamente a la absorción de grasa endotelial a pesar de su conocida dependencia del ATP glicolítico. Utilizando el ensayo descrito en este protocolo, planeamos profundizar en los mecanismos moleculares subyacentes a la captación y transporte de ácidos grasos endoteliales, incluyendo cómo podrían ser regulados por otros tejidos. Para empezar, prepara una solución de gelatina al 0,1% añadiendo 25 mililitros de stock de gelatina al 2% a 475 mililitros de PBS.

Mezcla bien la solución de gelatina y esteriliza con filtros usando un filtro de vacío o autoclave de 0,2 micrómetros. Usando una pipeta, añade 100 microlitros de la solución de gelatina al 0,1% en cada pozo de una placa negra transparente de 96 pozos. Coloca el plato en una incubadora a 37 grados Celsius durante al menos 30 minutos o toda la noche.

Tras la incubación, retira el exceso de solución de gelatina de la placa prerecubierta de 96 pozos. Lava el plato con PBS una vez. Luego, pipetear 100 microlitros de la suspensión de la célula en cada pozo utilizando una densidad de siembra que permite a las células alcanzar la confluencia al día siguiente.

Preparar 20 soluciones milimolares de 3-hidroxiisobutirato y lactato como controles positivos. Para el control negativo, utilice una micromolar niclosamida. Luego, pipete las soluciones en una placa separada de 96 pozos.

Lava las células endoteliales una vez con PBS divalente precalentado, pipeteando en un ángulo pronunciado para evitar alterar las células recubiertas. Añade 50 microlitros por pozo del reactivo de tratamiento adecuado e incuba la placa a 37 grados Celsius durante 30 o 60 minutos. Para preparar el complejo de ácidos grasos BSA de BOBIPY, mezcla una solución de ácidos grasos BODIPY de 2 micromolares con 1 BSA libre de ácidos grasos micromolares en PBS.

Incuba la mezcla a temperatura ambiente en la oscuridad durante 10 minutos antes de usarla. A continuación, añade 50 microlitros del complejo de ácidos grasos BSA preparados de BODIPY a cada uno bien tratado e incuba la placa a 37 grados Celsius durante cinco minutos. Prepara una solución de 1 micromolar de BSA libre de ácidos grasos en PBS como tampón de lavado y precáldela a 37 grados Celsius.

Retira el complejo de ácidos grasos BSA de los pozos y lava toda la placa dos veces con 50 microlitros del tampón de lavado precalentado, realizando cada lavado durante 1,5 minutos. Luego, añade 50 microlitros de azul de tripán al 0,08% en cada pozo para calmar la fluorescencia extracelular. Utilizando un lector de microplacas, mide inmediatamente la fluorescencia intracelular.

Después de retirar la solución de trippan blue de los pozos, lava suavemente las células con PBS. Añade 4 microgramos por mililitro de tinte Hoechst diluido en medio al 10% a cada pozo. Incuba la placa a 37 grados Celsius durante 30 minutos.

Luego, lava el plato una vez con PBS para eliminar el exceso de tinte. Después de eso, añade PBS nuevo a cada pozo y mide la fluorescencia Hoechst usando un lector de microplacas. En ambas células, HUVEC y EA.hy926, la señal intracelular de BODIPY-C12 aumentó significativamente con mayores concentraciones de ácidos grasos BODIPY a un minuto, cinco minutos y diez minutos de incubación.

El tratamiento con lactato durante una hora aumentó la absorción de BODIPY-C12 de forma dependiente de la dosis a 5 milimolares y 20 milimolares. El tratamiento con 3-hidroxiisobutirato también aumentó significativamente la absorción de BODIPY-C12 de forma dependiente de la dosis, con la mayor captación observada en 20 milimolares. El tratamiento con 1 micromolar niclosamida durante 30 minutos condujo a una reducción significativa en la absorción de BODIPY-C12 en comparación con el control no tratado por DMSO.

Tras una incubación de cinco minutos con BODIPY-C16 en HUVEC, el tratamiento con lactato a 10 milimolares y 20 milimolares aumentó significativamente la absorción de forma dependiente de la dosis. El tratamiento con niclosamida micromolar redujo significativamente la captación de BODIPY-C16 en comparación con el control de DMSO no tratado.