Desarrollo y caracterización de

El objetivo general de este procedimiento es desarrollar un dispositivo microfluídico que permita a las células endoteliales crecer bajo flujo de cizallamiento fisiológicamente relevante y medir los cambios inducidos por agonistas en su producción de calcio y óxido nítrico. Este enfoque puede ayudar a impulsar el futuro de la investigación sobre microvasos, validando el modelo in vitro de microvasos y cerrando las brechas entre los estudios in vivo e in vitro. Las principales ventajas de esta técnica son el diseño versátil de los microcanales para imitar diversos tipos de vasculatura y la mejora del entorno de cultivo celular, que se asemeja más a las condiciones in vivo que al cultivo estático convencional de los cultivos originales.

Las personas que demostrarán los procedimientos serán Sulei y Xiang, los dos de mi laboratorio. Antes de comenzar, utilice la fotolitografía estándar para crear un molde maestro y la litografía suave para fabricar los dispositivos de microcanales de PDMS, tal como se describe en el protocolo escrito. Para preparar los dispositivos de microcanales, primero cubra la entrada y la salida con un trozo delgado de PDMS y coloque el dispositivo dentro de una placa de Petri con un tejido húmedo.

A continuación, envuelva el recipiente con Parafilm y esterilice el dispositivo bajo luz UV durante al menos tres horas. El siguiente paso es aplicar la fibronectina. Primero, coloque una gota de 30 a 50 microlitros de PBS en la entrada.

Cree un vacío en la salida para enjuagar el dispositivo. A continuación, coloque una gota de fibronectina de 100 microgramos por mililitro en la entrada. Cree un vacío en la salida para cargar la solución de fibronectina.

A continuación, cubra la entrada y la salida. Envuelva el recipiente con Parafilm nuevamente e incube el dispositivo durante la noche a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, enjuague manualmente el dispositivo con PBS tres veces.

Luego, cargue el dispositivo con 30 a 50 microlitros de medio de cultivo celular y caliente el dispositivo en una incubadora a 37 grados Celsius durante al menos 15 minutos. Comience mezclando las HUVECs en medio de cultivo para HUVECs con un ocho por ciento de Dextrano a una concentración de dos a cuatro millones de células por mililitro. El Dextrano es necesario para aumentar la viscosidad y, por lo tanto, mejorar la siembra celular.

A continuación, coloque de 10 a 20 microlitros de células sobre la entrada y introdúzcalas mediante gravedad o mediante acción capilar usando una pipeta Pasteur de vidrio en la salida. A continuación, incube el dispositivo durante 15 a 20 minutos. Luego, verifique el estado de siembra bajo un microscopio.

Si es necesario, cargue más células para alcanzar una densidad celular deseada. Una vez que se hayan cargado suficientes células, enjuague suavemente el dispositivo con medio de cultivo celular normal y tibio para eliminar la dextrana. A continuación, cultive el dispositivo sin perfusión de medio alguno durante seis horas.

A continuación, prepare las conexiones de tubo para la perfusión a largo plazo. Sujete el dispositivo a una placa de Petri con cinta adhesiva y luego conecte el tubo de entrada a una jeringa con aguja. Introduzca el tubo tanto en la entrada como en la salida del dispositivo.

Conecte el tubo de salida a un recolector de desechos. A continuación, coloque el plato y el recipiente para desechos en una incubadora. Conecte la jeringa con un tubo de entrada largo a una bomba de perfusión externa que atraviese la puerta de la incubadora.

A continuación, ajuste la tasa de perfusión según el diseño experimental. Con una perfusión bien controlada, el cultivo en la red de microvasos puede mantenerse hasta dos semanas. Por lo tanto, puede extenderse a estudios a más largo plazo que imiten el entorno celular y hemodinámico en diferentes condiciones fisiológicas y patológicas.

Para comenzar la inmunomarcación, como la etiquetación de VE-cadherina, primero fije las células perfundiendo con paraformaldehído al dos por ciento durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Después de una serie de perfusiones para bloquear, permeabilizar y teñir con anticuerpos, mantenga el dispositivo a cuatro grados Celsius hasta que se tomen las imágenes de las células. Para obtener imágenes de la concentración de calcio en las células, perfunda el dispositivo con 10 miligramos por mililitro de albúmina en solución de Ringer durante 15 minutos a 37 grados Celsius.

A continuación, perfunda el dispositivo con Fluo-4 AM a cinco micromolar durante 40 minutos a 37 grados Celsius. Luego, lave el Fluo-4 AM unido al lumen con Ringer albúmina durante 15 minutos a 37 grados Celsius. A continuación, encienda el sistema confocal para la obtención de imágenes del nivel de calcio intracelular con Fluo-4 AM. Adquiera imágenes de los microvasos cargados con Fluo-4.

Recolecte las imágenes basales durante 10 minutos. Luego, perfunda el dispositivo continuamente con ATP de 10 micromolar y registre los cambios en la intensidad de fluorescencia durante 20 minutos. Para obtener imágenes de la producción de óxido nítrico en las células, perfunda el dispositivo con Ringer albúmina durante 15 minutos a 37 grados Celsius.

A continuación, perfunda las células con DAF-2 DA a 5 micromolares durante aproximadamente 35 a 40 minutos a 37 grados Celsius. Luego, prepare el sistema de imágenes de fluorescencia para medir la producción de óxido nítrico inducida por ATP. Registre la línea base durante 5 minutos, luego perfunda el dispositivo con ATP a 10 micromolares y recoja las imágenes durante 30 minutos a intervalos de un minuto.

Para la medición de óxido nítrico en células, es importante comprender que el adaptador de desprendimiento para el perfil de intensidad representa una producción acumulada de óxido nítrico en el tiempo y no una concentración de óxido nítrico. Seleccione manualmente las regiones de interés a partir de las imágenes recopiladas a nivel celular individual. Cada ROI abarca el área de una célula individual, que puede indicarse mediante el contorno de fluorescencia.

Cuantifique los cambios inducidos por el ATP en el calcio endotelial y el óxido nítrico. Calcule los cambios en la intensidad de fluorescencia de Fluo-4, restando el fondo del tejido. Cuantifique la tasa de producción de óxido nítrico mediante la conversión diferencial inicial de la intensidad de fluorescencia de DAF-2 a lo largo del tiempo.

El patrón de microcanales en el dispositivo presenta una red de ramificación de tres niveles. Se realizó una simulación numérica tridimensional para estimar las distribuciones de tensión cortante bajo un caudal de 0,35 microlitros por minuto. Las células endoteliales se sembraron en la red según lo descrito.

Luego, se marcaron las fibras de actina F y los núcleos. De manera similar, también se tiñó la VE-cadherina. Los resultados fueron similares a la expresión de VE-cadherina en una vénula intacta.

A continuación, se examinaron los aumentos inducidos por ATP en el calcio intracelular y la producción de óxido nítrico. Los niveles de calcio se analizaron utilizando Fluo-4 AM, como se describe en la sección de protocolo. La producción de óxido nítrico se monitoreó utilizando DAF-2 DA, como se describe en la sección de protocolo.

Los resultados fueron comparables con los obtenidos mediante vénulas íntegras perfundidas individualmente. El método fue fácil y estuvo rigurosamente controlado en condiciones biológicas y en entornos fluidos dinámicos, lo cual no habría sido posible con técnicas convencionales de microcirugía. Después de ver este video, usted debería tener una buena comprensión de cómo fabricar el dispositivo y realizar mediciones de calcio y óxido nítrico.

Después de que esta técnica allanara el camino para que los investigadores no solo estudiaran los mecanismos subyacentes inducidos por agonistas, sino que también abrieran aplicaciones más amplias para la investigación biomédica.