Desarrollo y caracterización de In Vitro Red de microvasos y mediciones cuantitativas de endotelial [Ca ²⁺] _i Y la producción de óxido nítrico

El objetivo general de este procedimiento es desarrollar un dispositivo microfluídico que permita a las células endoteliales crecer bajo un flujo de cizallamiento fisiológicamente relevante y medir los cambios inducidos por el agonista en su producción de calcio y óxido nítrico. Este mensaje puede ayudar a avanzar en el futuro de la investigación de microvasos, validando el modelo de microvasos in vitro y cerrando las brechas entre los estudios in vivo e in vitro. Las principales ventajas de esta técnica son el diseño versátil de los microcanales para imitar varias vasculaturas y mejoran el entorno de cultivo celular que está más cerca del in vivo que el condicional estático a los cultivos originales.

Los demostradores de los procedimientos serán Sulei y Xiang, los dos de mi laboratorio. Antes de comenzar, utilice la fotolitografía estándar para crear un molde maestro y la litografía suave para fabricar los dispositivos de microcanal PDMS como se describe en el protocolo de texto. Para preparar los dispositivos de microcanales, primero cubra la entrada y la salida con una pieza delgada de PDMS y coloque el dispositivo dentro de una placa de Petri con un pañuelo húmedo.

Luego, envuelva el plato con Parafilm y esterilice el dispositivo bajo una luz ultravioleta durante al menos tres horas. El siguiente paso es aplicar la fibronectina. Primero, coloque una gota de 30 a 50 microlitros de PBS en la entrada.

Cree una aspiradora en la salida para enjuagar el dispositivo. A continuación, coloque una gota de 100 microgramos por mililitro de fibronectina en la entrada. Cree un vacío en la salida para cargar la solución de fibronectina.

A continuación, cubra la entrada y la salida. Vuelva a envolver el plato con Parafilm e incube el dispositivo durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, enjuague manualmente el dispositivo con PBS tres veces.

Luego, cárguelo con 30 a 50 microlitros de medios de cultivo celular y caliente el dispositivo en una incubadora a 37 grados centígrados durante al menos 15 minutos. Comience mezclando HUVEC en medios de cultivo HUVEC con un ocho por ciento de dextrano a dos a cuatro millones de células por mililitro. El dextrano es necesario para aumentar la viscosidad y así mejorar la siembra de las células.

A continuación, coloque de 10 a 20 microlitros de células sobre la entrada e introdúzcalas por gravedad o por capilaridad de una pipeta pasteur de vidrio en la salida. A continuación, incube el dispositivo durante 15 a 20 minutos. Luego, verifique el estado de siembra bajo un microscopio.

Si es necesario, cargue más celdas para lograr la densidad de celdas deseada. Una vez que se hayan cargado suficientes células, enjuague suavemente el dispositivo con un medio de cultivo celular normal y tibio para eliminar el dextrano. A continuación, cultive el dispositivo sin ninguna perfusión de medios durante seis horas.

A continuación, configure las conexiones de los tubos para la perfusión a largo plazo. Pegue el dispositivo a una placa de Petri y luego conecte el tubo de entrada a una jeringa con una aguja. Inserte el tubo tanto en la entrada como en la salida del dispositivo.

Conecte el tubo de salida a un colector de residuos. Ahora, coloque el plato y el contenedor de desechos en una incubadora. Conecte la jeringa con un tubo de entrada largo a una bomba de perfusión externa que pasa a través de la puerta de la incubadora.

Luego, ajuste la tasa de perfusión de acuerdo con el diseño experimental. Con una perfusión bien controlada, el cultivo en la red de microvasos puede mantenerse hasta dos semanas. Por lo tanto, puede extenderse a estudios a más largo plazo que imiten el entorno celular y hemodinámico en las diferentes condiciones fisiológicas y patológicas.

Para comenzar la inmunotinción, como el marcaje de VE-cadherina, primero fije las células mediante una perfusión con paraformaldehído al dos por ciento durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Después de una serie de perfusiones para bloquear, permeabilizar y teñir con anticuerpos, mantenga el dispositivo a cuatro grados centígrados hasta que se obtengan imágenes de las células. Para obtener una imagen de la concentración de calcio en las células, perfunda el dispositivo con 10 miligramos por mililitro de albúmina en solución de Ringer durante 15 minutos a 37 grados centígrados.

A continuación, perfunda el dispositivo con cinco micromolares Fluo-4 AM durante 40 minutos a 37 grados centígrados. A continuación, lave el Fluo-4 AM unido a lúmenes con anillos de albúmina durante 15 minutos a 37 grados centígrados. A continuación, ponga en marcha el sistema confocal para la obtención de imágenes del nivel de calcio intercelular con Fluo-4 AM. Adquirir imágenes de los microrecipientes cargados con Fluo-4.

Recoja las imágenes de referencia durante 10 minutos. A continuación, perfunda el dispositivo de forma continua con 10 micromolares de ATP y registra los cambios de intensidad de fluorescencia durante 20 minutos. Para obtener una imagen de la producción de óxido nítrico en las células, perfunda el dispositivo con anillos de albúmina durante 15 minutos a 37 grados centígrados.

A continuación, perfunde las células con 5 micromolares DAF-2 DA durante unos 35 a 40 minutos a 37 grados centígrados. A continuación, configure el sistema de imágenes de fluorescencia para medir la producción de óxido nítrico inducida por ATP. Registre la línea de base durante 5 minutos, luego perfunda el dispositivo con ATP de 10 micromolares y recopile las imágenes durante 30 minutos a intervalos de un minuto.

Para la medición de óxido nítrico celular, es importante comprender que el adaptador de separación para el perfil de intensidad representa una producción acumulada de óxido nítrico con el tiempo y no una concentración de óxido nítrico. Seleccione manualmente la región de interés de las imágenes recopiladas a nivel de celda individual. Cada ROI cubre el área de la célula de un individuo, lo que se puede indicar mediante el contorno de floresense.

Cuantificar los cambios inducidos por el ATP en el calcio endotelial y el óxido nítrico. Al calcular los cambios en la intensidad de Fluo-4, menos el fondo tisular. Cuantificar la tasa de producción de óxido nitroso realizando la primera conversión diferencial de la intensidad de floresense de DAF-2 a lo largo del tiempo.

El patrón de microcanal en el dispositivo tiene una red de ramificación de tres niveles. Se realizó una simulación numérica en 3D para estimar las distribuciones de esfuerzos cortantes bajo el caudal de 0,35 microlitros por minuto. Las células endoteliales se estaban sembrando en la red como se describe.

A continuación, se marcaron la F-actina y los núcleos. Del mismo modo, la VE-cadherina también se tiñó. Los resultados fueron similares a la expresión de VE-cadherina en una vénula intacta.

A continuación, se examinaron los aumentos inducidos por ATP en la producción intracelular de calcio y óxido nítrico. Los niveles de calcio se examinaron con Fluo-4 AM como se describe en la sección de protocolo. La producción de óxido nítrico se monitorizó mediante DAF-2 DA, tal y como se describe en la sección de protocolo.

Los resultados fueron comparables a los obtenidos con vénulas intactas perfundidas individualmente. El avanzado era fácil y estrictamente controlado en condiciones biológicas y en entornos dinámicos de fluidos, lo que no habría sido posible con las técnicas convencionales de microhabilidad. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo fabricar el dispositivo y realizar mediciones de calcio y óxido nítrico.

Después de esto, esta técnica allanó el camino para los investigadores, no solo para investigar el agonista subyacente inducido, sino también para abrir aplicaciones más amplias para la investigación biomédica.