Name: Desarrollo y caracterización de In Vitro Red de microvasos y mediciones cuantitativas de endotelial Ca 2+ i Y la producción de óxido nítrico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Aprende a desarrollar una red de microvasos in vitro con células endoteliales HUVEC en dispositivos microfluídicos. Este método permite medir cambios en calcio intracelular y producción de óxido nítrico en tiempo real.

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Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del Corazón, Pulmón y la Sangre otorga HL56237, Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales Instituto DK97391-03, la Fundación Nacional de Ciencia (NSF-1227359 y EPS-1003907).

1. La fabricación de dispositivos de microfluidos <ol><li> La fabricación estándar de fotolitografía de un SU-8 maestro molde 50 <ol><li> Limpiar la oblea de silicio antes de spin-coating. Enjuagar una oblea de silicio de 2 pulgadas desnudo con acetona durante 15 min seguido de alcohol isopropílico (IPA) para 15 min. Deshidratar la oblea colocándolo en una placa caliente a 150 ° C durante 1 hr. Después de la deshidratación, enfriar la oblea a temperatura ambiente. </li><li> Spin-capa de la oblea de silicio con SU-8 fotoprotector. Añadir 2 ml SU-8 fotoprotector sobre la oblea. Rampa de la oblea a 500 rpm a 100 rpm de aceleración / s durante 10 s, seguido de 1.000 rpm a 300 rpm / seg aceleración para 30 seg. (Ver Suplementario vídeo 1) </li><li> Pre-hornear la oblea en una placa caliente a 65 ° C durante 10 minutos, luego horneado suave a 95 ° C durante 30 minutos. </li><li> Utilice la exposición UV para transformar el patrón diseñado a partir de una máscara de película a la fotoprotección spin-revestido. Imprimir el patrón sobre una fina película transparente como una máscara de película. Coloque la máscara de la película en la parte superior de lamediante revestimiento por centrifugación fotorresistente y exponer a los rayos UV con una dosis de 300 mJ / cm 2. (Ver Suplementario vídeo 2) Nota: En este protocolo, el patrón de red de microcanales (159 micras de ancho madre canales de derivación en cuatro canales de 100 micras de ancho hija) está diseñado con el software de CAD. El patrón en la película muestra como un campo claro y el resto de la película está cubierta por la tinta de color negro. Debido SU-8 es un fotorresistente negativo, la parte de la resina fotosensible que se expone a los rayos UV se pueden reticular y convertirse en insoluble al disolvente durante el desarrollo del molde (etapa 1.1.6). Después del desarrollo, esta porción insoluble se replicará el patrón de red diseñado y servir como un molde maestro. </li><li> Post-hornear la oblea expuesta sobre una placa caliente a 65 ° C durante 1 min, luego 95 ° C durante 10 min. </li><li> Desarrollar el molde maestro. Uso SU-8 desarrollador como disolvente para eliminar la resina fotosensible no reticulado. Sumergir la oblea en el SU-8 revelador durante 3 minutos y enjuagar con IPApara 1 min. </li><li> Repita este ciclo de desarrollo de 2-3 veces hasta que no hay formación de estrías de color blanco (residuo de resina fotosensible no curada) después del enjuague IPA. secar suavemente la oblea con gas nitrógeno y examinar las pequeñas características del patrón con un microscopio. Repetir los ciclos de desarrollo adicionales si es necesario. </li><li> Duro hornear la oblea en una placa caliente a 150 ° C durante 15 minutos. </li></ol></li><li> La litografía blanda <ol><li> mezclar manualmente las dos partes (base y agente de curado) de polidimetilsiloxano de elastómero (PDMS) en un peso. relación de 10: 1. </li><li> De-gas la mezcla de PDMS con un desecador de vacío conectado con una casa de 15 min. Reparto de la solución de PDMS en el molde maestro fotoprotector. El espesor de la PDMS tiene que ser mayor de 3 mm para proporcionar una sujeción estable de la tubería de entrada / salida. De-gas el PDMS de nuevo durante 15 min, y eliminar las burbujas de aire que quedan con gas nitrógeno, si es necesario. Curar el PDMS fundidos en un horno a 65 ° C durante 3 horas. </li><li> Limpiar la superficie deel cubreobjetos de vidrio con una cinta adhesiva y un limpiador de plasma (tratamiento con plasma de 30 segundos). Spin-capa de PDMS ONU-curado (0,5 ml) sobre el cubreobjetos de vidrio por el aumento gradual a 4.000 rpm a velocidad de aceleración / seg a 500 rpm durante 30 segundos. Curar el cubreobjetos recubierto spin-PDMS en un horno a 65 ° C durante al menos 30 min. </li><li> Cortar y liberar el PDMS curado del molde maestro. A continuación, cree una entrada y una salida con una perforadora 1 mm de diámetro en el extremo distal de los canales madre. </li><li> Unir el dispositivo a la cubreobjetos de vidrio recubiertos-spin PDMS. Oxidar la superficie de los PDMS y el cubreobjetos con un limpiador de plasma para 1 min. Después del tratamiento con plasma de oxígeno, colocar una gota de agua desionizada (agua DI) en la superficie de unión, y colocar las dos piezas juntas. Hornear el dispositivo en un horno a 65 ° C durante 30 min para lograr una unión permanente. </li></ol></li></ol><img alt="Suplementario de vídeo 1" src="/files/ftp_upload/54014/54014movie1.jpg"/&gt; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54014/Supplemental_video_1.mp4" target="_blank">Suplementario de vídeo 1 (Haga clic derecho para descargar).</a> <img alt="Suplementario Video 2" src="/files/ftp_upload/54014/54014movie2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54014/Supplemental_video_2.mp4" target="_blank">Suplementario Video 2 (Haga clic derecho para descargar).</a> 2. endotelial siembra de células y Cultura <ol><li> La esterilización de dispositivos y fibronectina Revestimiento <ol><li> Preservar la propiedad hidrófoba de la superficie de PDMS alrededor de la entrada / salida de la oxidación. Cubrir la superficie de PDMS alrededor de la entrada y la salida con pequeñas tiras de cinta adhesiva para evitar la oxidación. Este procedimiento puede evitar que el agua DI se propague por toda la superficie superior del dispositivo durante la etapa de llenado (2.1.3). </li><li> Se trata el dispositivo de PDMS con plasma de oxígeno for 5 min para cambiar la superficie para que sea hidrófila, de este modo facilitar el flujo de fluido a través del microcanal y prevenir la burbuja atrapando en el procedimiento de llenado (2.1.3). </li><li> Utilice una jeringa con una aguja unida o una pipeta para llenar el dispositivo con agua DI desde la entrada. Continuar el relleno hasta que hay una gota de agua DI (30-50 l) acumulada en la salida. Examine el dispositivo bajo un microscopio para verificar si hay burbujas atrapadas en el interior del microcanal. Eliminar la gotita de agua excesiva en la entrada y la salida con un pañuelo de papel. </li><li> Esterilizar el dispositivo en una placa de Petri con UV durante un mínimo de 3 horas en una campana de bioseguridad laminar. Para evitar la evaporación, cubra la entrada / salida con una fina pieza de PDMS, poner un pañuelo de papel húmedo en el interior del plato, y envolver el plato con Parafilm. </li><li> Recubrir el dispositivo con fibronectina. Enjuague el dispositivo por primera vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS), a continuación, cubrir con 100 mg / ml de fibronectina durante la noche en un refrigerador (4 ° C). Coloque una gota de la solución en la entrada, y luego crear una presión negativa en la salida con un vacío de la casa, una jeringa con una aguja o una pipeta. </li><li> Complete el dispositivo con medios de cultivo celular. Enjuague el dispositivo con PBS manualmente por 3 veces antes de cargar el medio de cultivo celular. Calentar el dispositivo en una incubadora a 37 ° C. </li></ol></li><li> EC Siembra y la perfusión a largo plazo Nota: En comparación con la cultura 2D CE estática convencional, el modelo de red de microvasos in vitro con perfusión continua hizo que el ambiente de cultivo celular más cerca de las condiciones in vivo. El vitro red de microvasos en demostrado en este protocolo se puede mantener hasta dos semanas. La perfusión bien controlada va a reponer los nutrientes de forma continua, eliminar los desechos y evitar el exceso de confluencia de la monocapa CE. Por lo tanto, se puede extender a unos estudios a largo plazo, imitando el entorno celular y hemodinámica bajo diferentes physiological y condiciones patológicas. <ol><li> Mezclar HUVECs primarias en medios de cultivo de HUVEC (MCDB 131) con 8% de dextrano (peso molecular 70.000). El dextrano se utiliza para aumentar la viscosidad de los medios de carga y lograr un mejor resultado la siembra de células. La densidad celular recomendada es de alrededor de 2-4 x 10 6 células / ml. </li><li> Sembrar las células en el dispositivo. Coloque una gota de 10-20 l de células sobre la entrada. Introducir un flujo suave ya sea por la inclinación del dispositivo, o la acción capilar usando una pipeta Pasteur de vidrio en la salida. La clave para el éxito de carga de las células es el control de la velocidad de flujo de menos de 1 mm / s dentro de los canales más pequeños. </li><li> Compruebe la siembra de células. Después de la siembra inicial, incubar el dispositivo durante 15-20 min (atmósfera humidificada de 5% de CO2 a 37 ° C) antes de comprobar el estado de la siembra en el microscopio. Si es necesario, realizar la carga celular adicional para alcanzar una densidad celular deseada. </li><li> Enjuague suavemente el dispositivo con medio de cultivo celular (37° C) para eliminar el dextrano. Cultura del dispositivo en ausencia de flujo para la primera 6 h en una incubadora (5% de CO2 a 37 ° C). </li><li> Configurar la conexión de tubos para la perfusión a largo plazo. Tape el dispositivo en una placa de Petri para evitar el movimiento. Crear pequeños agujeros en la tapa de la placa de Petri para las inserciones de entrada y tubo de salida. Conectar el tubo de entrada a una jeringa con una aguja para la perfusión medios de cultivo celular. Conecte el tubo de salida a un colector de residuos. Nota: Coloque el dispositivo y el colector de residuos en una incubadora de cultivo de células, mientras que la colocación de una bomba de perfusión fuera de la incubadora y conectarlo con el dispositivo por el tubo de entrada de largo. La tasa de perfusión se determina por el diseño experimental. En el presente dispositivo, utilice una velocidad de perfusión de 0,35 l / min y un rango de tensiones de cizallamiento entre 1-2 dinas / cm 2. Bajo esta condición de perfusión, las HUVECs alcanzan la confluencia en aproximadamente 3-4 días. </li></ol></li></ol> 3. ILa tinción mmunofluorescent <ol><li> Fijar el ECs en el dispositivo por perfusión de paraformaldehído al 2% durante 30 min a 4 ° C, seguido de 1x PBS enjuague a temperatura ambiente durante 15 min, y el bloqueo de 30 min 1% de BSA. Utilice una velocidad de perfusión que es el mismo que el utilizado para el cultivo celular. </li><li> Permeabilizar las ECs fijo para la tinción de anticuerpo con 0,1% Triton X-100. Perfundir el dispositivo con Triton de 5-7 minutos a la etiqueta VE-cadherina, y 3 minutos a la etiqueta de F-actina. </li><li> Cargar los anticuerpos en el dispositivo. Perfundir el dispositivo con 1x PBS durante 15 min para lavar las soluciones anteriores. cargar manualmente el anticuerpo primario contra cadherina VE (anti-cabra) en el dispositivo a la concentración de 2 mg / ml (el volumen total es de 20 a 50 l). Mantenga el dispositivo en un refrigerador a 4 ° C durante la noche. Perfundir el anticuerpo secundario (de burro anti-cabra) por una bomba de jeringa a una concentración de 7 g / ml durante 45-60 min. </li><li> Etiqueta CE F-actina con faloidina. Perfundir el dispositivo con PBS 1x for 15 min antes de cargar manualmente faloidina (10 mg / ml) durante 7-10 min. </li><li> Etiqueta núcleos CE (véase la Lista de Materiales). </li><li> Enjuague el dispositivo con 1x PBS, y mantenerla a 4 ° C hasta que la imagen. </li></ol> 4. Obtención de imágenes de fluorescencia endotelial [Ca2 +] i <ol><li> Perfundir el dispositivo con la albúmina (10 mg / ml) la solución de -Ringer durante 15 min a 37 ° C. Utilizar la misma tasa de perfusión que el utilizado para el cultivo celular. Las concentraciones de todos los componentes de la solución de albúmina-Ringer se describen en la Lista de materiales. </li><li> Establecer un sistema confocal para EC [Ca2 +] i la formación de imágenes con fluo-4 PM. Utilice un sistema de microscopio confocal para obtener imágenes de Ca 2+. Utilizar un láser de argón (488 nm) para la excitación y ajustar la banda de emisión como 510-530 nm. Recoger las imágenes con un objetivo 25X (inmersión en agua, NA: 0,95) a 512 x 512 formato de exploración. Use un z-escalón de 2 my un intervalo de exploración para cada pila de imagos de 20 seg. </li><li> Perfundir el dispositivo con fluo-4 de AM (5 M) durante 40 minutos a 37 ° C, y luego lavar el lumen fluo-4 AM con la solución de albúmina-Ringer. </li><li> Adquirir imágenes de microvasos fluo-4 cargado. Recoger las imágenes de línea de base durante 10 minutos. Perfundir el dispositivo con ATP (10 mM) y registrar los cambios de intensidad de fluorescencia (FI) para 20 min. </li></ol> 5. Obtención de imágenes de fluorescencia producción de óxido nítrico <ol><li> Perfundir el dispositivo con la solución de albúmina-Ringer durante 15 min. Utilice una velocidad de perfusión que es el mismo que el utilizado para el cultivo celular. </li><li> Configurar el sistema de imágenes de fluorescencia para medir la producción de óxido nítrico inducida por ATP. Use un microscopio equipado con una cámara CCD digital de 12 bits y un obturador controlado por ordenador para la medición de óxido nítrico. Utilice una lámpara de xenón de 75 W como fuente de luz. Nota: Seleccionar la excitación y emisión de longitudes de onda para DAF-2 DA por un filtro de interferencia (480/40 nm) y un espejo dicroico(505 nm) con una barrera de paso de banda (535/50 nm). Use un lente objetivo de 20X (NA: 0,75) para recoger las imágenes. Para minimizar photobleaching, coloque un filtro de densidad neutra (0,5 N) delante del filtro de interferencia y limitar el tiempo de exposición a 0,12 seg. </li><li> Cargar las células con DAF-2 DA (5 M). Perfundir el dispositivo con DAF-2 DA durante aproximadamente 35-40 minutos a 37 ° C. Grabar la línea de base de DAF-2 intensidad de fluorescencia (FI DAF) después de la carga inicial. Nota: DAF-2 DA está continuamente presente en el perfundido durante todo el experimento 7. </li><li> Recoger DAF-2 imágenes. Grabar la línea de base de FI DAF durante 5 min. Perfundir el dispositivo con ATP (10 mM) y recoger las imágenes durante 30 minutos con intervalos de 1 min. Recoge todas las imágenes de un mismo grupo de células en el mismo plano focal. </li></ol> Análisis 6. Datos <ol><li> seleccionar manualmente la región de interés (ROI) de las imágenes recogidas a nivel de células individuales. CadaRetorno de la inversión cubre la superficie de una célula individual que puede ser indicada por el contorno de fluorescencia. </li><li> Restar la fluorescencia de fondo y calcular la media de cada FI ROI. </li><li> Medir los cambios inducidos por el ATP en CE [Ca2 +] i y la producción de NO. Cuantificar los cambios inducidos por el ATP en CE [Ca2 +] i mediante el cálculo de los cambios en el Fluo-4 FI (FI / FI 0 * 100, donde 0 es la FI FI basal media durante la perfusión de albúmina-Ringer antes de añadir ATP) menos la medida fondo. NO cuantificar la tasa de producción mediante la realización de la primera conversión diferencial de la FI DAF con el tiempo. Nota: El curso temporal de FI DAF representa una producción de NO acumulado con el tiempo. Por lo tanto, NO tasa de producción se calcula en base al perfil de FI DAF bajo tanto basal como estimulada condiciones ATP. Los detalles de análisis de datos y procedimientos experimentales se han descrito en una publicación anterior 7. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen intereses en competencia o intereses en conflicto a revelar.

<html> En este artículo, se presentan los protocolos detallados para el desarrollo de la red de microvasos culta, la caracterización de los cruces de la CE y el citoesqueleto de actina F de distribución, y las mediciones cuantitativas de la CE [Ca2 +] i y la producción de NO usando un dispositivo de microfluidos. El dispositivo de microfluidos perfundido proporciona un modelo in vitro que permite un cierre de simulación de las geometrías microvasculares in vivo y las condiciones de...

Las células endoteliales (EC) que recubren las paredes de los vasos sanguíneos in vivo están constantemente expuestos a fluir, pero ECs cultivadas a menudo se cultivan en condiciones estáticas y exhiben un fenotipo pro-inflamatoria 1,2. La tecnología microfluídica permite un fluido controlada con precisión a través de una microescala geométricamente limitados (sub-milímetro) los canales 3, lo que proporciona la oportunidad para que las células cultivadas, especialmente para ECs vascular, creciendo bajo condiciones de flujo deseadas. Estas características hacen que las condiciones de cultivo celular in vivo más cerca de que los cultivos convencionales, estáticas 2D celulares. Son extremadamente importante cuando los dispositivos de microfluidos se utilizan para modelar los diferentes tipos de vasculatures y para estudiar las respuestas de las CE a estímulos mecánicos y / o químicos. A pesar de las ventajas demostradas por la red de microcanales a través de un cultivo de células estático, la adaptación y aplicación de la microfluídica en la f biomédicaield siguen siendo limitados. Informado por una revisión reciente, la mayoría de las publicaciones de este campo (85%) se encuentran todavía en revistas de ingeniería 4. El rendimiento de los dispositivos de microfluidos no ha sido lo suficientemente convincente como para la mayoría de los biólogos para pasar de las técnicas actuales, tales como el ensayo Transwell y la macro-escala de diapositivas placa de cultivo / vidrio para este dispositivo miniaturizado. Microfluídica es un campo multidisciplinario, que requiere la colaboración interdisciplinaria para progresar en este campo. El objetivo de este artículo técnico es reducir las brechas de conocimiento entre disciplinas y realizar los procedimientos de fabricación comprensible por los biólogos, mientras que proporciona la aplicación biológica y validación funcional de los microvasos de microfluidos. Los protocolos experimentales visualizados incluyen la fabricación de ambos dispositivos de microfluidos y sus utilidades biológicas, lo que supone una estrecha colaboración entre los ingenieros y biólogos. Recientemente hemos informado de algunosaplicaciones biológicas que utilizan la red de microvasos in vitro con dispositivo de microfluidos 5. Con el fin de diseñar apropiadamente las dimensiones de la red de microcanales y aplicar la tensión de corte deseado, un modelo numérico fue construido con el software de dinámica de fluidos computacional para estimar estrechamente el perfil de flujo. Las células primarias humanas endoteliales de vena umbilical (HUVEC) que fueron sembradas en los microcanales alcanzaron la confluencia, es decir, cubiertas las superficies interiores enteras del microcanal, en 3-4 días con perfusión continua. La formación de la barrera adecuada se demostró por tinción VE-cadherina y en comparación con los formados en condiciones de cultivo de células estáticos y en microvasos intactas. Mediante la aplicación de los protocolos experimentales desarrolladas en microvasos intactas perfundidos individualmente 6-8, que mide cuantitativamente los cambios en la CE [Ca2 +] i y el óxido nítrico (NO) en respuesta a la adenosina trifosfato (ATP) con fluorescente inindicadores y confocal y microscopía de fluorescencia convencional. Los aumentos inducidos por agonistas en CE [Ca2 +] i y la producción de NO se han reportado como señales intracelulares necesarias para inflamatorias mediador aumentos inducidos en la permeabilidad microvascular 6-15. Aunque algunos estudios anteriores mostraron imágenes de dispositivos de microfluidos DAF-2 DA cargados 16,17, resolución y los datos apropiados análisis todavía no había alcanzado 18. Para nuestro conocimiento, este estudio demuestra las primeras mediciones cuantitativas de cambio dinámico inducida por el agonista en endotelial i y la producción de NO utilizando microfluidos sistema basado en [Ca 2 +]. Técnicas de microfabricación tienen la flexibilidad para fabricar microcanales a unas pocas micras y permitir el desarrollo de patrones complejos para imitar las geometrías de la microvasculatura en vivo. Aquí presentamos una red de microcanales típico con tres niveles de ramificación. Estala red se fabrica mediante la combinación de fotolitografía que se realiza en una sala limpia de microfabricación y litografía blanda.

<table><tbody><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Fisher Scientific</td><td>A929</td><td></td></tr><tr><td>Punzón de biopsia</td><td>Miltex</td><td>33-31 AA</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina bovina</td><td>MP Biomedicals 810014</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extracto de cerebro bovino (BBE)</td><td>Lonza</td><td>CC-4098</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542C</td><td></td></tr><tr><td>DAF-2 DA</td><td>Calbiochem</td><td>251505</td><td></td></tr><tr><td>Dextrano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31390</td><td></td></tr><tr><td>Burro anti-Cabra IgG (H+L) Anticuerpo secundario</td> Life <td>technologies</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, sin calcio, sin magnesio</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5 (tinción de núcleos)&nbsp;</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>4084</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento de crecimiento de células endoteliales (ECGS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2759-15MG</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Gibco</td><td>PHE0023</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life technologies</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina de piel porcina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina (50 mg/ml)</td><td>Gibco</td><td>15750-078</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548B</td><td></td></tr><tr><td>Pippette de vidrio Pasteur</td><td>VWR</td><td>14672</td><td></td></tr><tr><td>Sal sódica de heparina de mucosa intestinal porcina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393-10KU</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Solución salina tamponada</td><td>Lonza</td><td>CC-5024</td><td></td></tr><tr><td>Células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC)</td><td>Lonza</td><td>CC-2517</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol isopropílico (IPA)</td><td>VWR</td><td>89125</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Solución de Ringer de Mamífero Ingrediente</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl (132 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl (4.6 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 &middot; 2H2O (2.0 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 &middot; 7H2O (1,2 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa (5,5 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP350-1</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3 (5,0 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Salt (9,1 mM)</td><td>Research Organics</td><td>6007H</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Acid (10,9 mM)</td><td>Research Organics</td><td>6003H</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 131 Tecnologías de vida del medio de cultivo</td><td></td><td>10372-019</td><td></td></tr><tr><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>con paraformaldehído</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Faloidina (tinción con f-actina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>Polidimetilsiloxano (PDMS)</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí</td><td>Exel Int</td><td>29552</td><td></td></tr><tr><td>Cinta adhesiva</td><td></td><td>3M 34-8711-3070-3</td><td></td></tr><tr><td>Oblea de silicio</td><td>VWR</td><td>14672</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 fotorresistente</td><td>MicroChem</td><td>SU-8 2050 Y111072</td><td></td></tr><tr><td>Revelador SU-8</td><td>MicroChem</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>matraces de cultivo de tejidos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z707503-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Chemical Book</td><td>T6878</td><td></td></tr><tr><td>Solución neutralizadora de tripsina</td><td>Gibco</td><td>R-002-100</td><td></td></tr><tr><td>Solución de tripsina/EDTA (TE)</td><td>Gibco</td><td>R-001-100</td><td></td></tr><tr><td>Tubo</td><td>Cole-Parmer</td><td>Tubo de microperforación de PTFE, 0.012" de diámetro interno x 0.030" de diámetro exterior</td><td></td></tr><tr><td>VE-cadherin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-6458</td><td></td></tr><tr><td>Nombre del equipo</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios/Descripción</td></tr><tr><td>Biosafety Campana laminar</td><td>NuAire</td><td>NU-425 Clase II, Tipo A2</td><td></td></tr><tr><td>Cámara CCD</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Leica</td><td>TCS SL</td><td></td></tr><tr><td>Desecador</td><td>Bel-Art</td><td>F42022</td><td></td></tr><tr><td>Placa calefactora</td><td>Wenesco</td><td>HP-1212</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Forma Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Horno Isotemp</td><td>Barnstead</td><td>3608-5</td><td></td></tr><tr><td>Litografía banco</td><td>Karl Suss</td><td>MA6 Contacto Litografía</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio óptico</td><td>Nikon</td><td>L200 ND & Diaphod 300</td><td></td></tr><tr><td>Obturador para la cámara CCD</td><td>Sutter Instrument Lambda</td><td>10-2</td><td></td></tr><tr><td>Limpiador</td> de <td>plasma PVA TePla/Harrick plasma</td><td>M4L/PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Recubrimiento por centrifugado</td><td>Brewer Science</td><td>Cee 200X</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de bomba de jeringa</td><td>Harvard Apparatus 703005</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nombre del software</td><td> Empresa</td><td>Número de catálogo</strong</td><td>>Comments/Description</td></tr><tr><td>CAD software de simulación Autodesk</td><td>AutoCAD</td><td>2015</td><td></td></tr><tr><td>CFD</td><td>COMSOL COMSOL</td><td>Multiphysics 4.0.0.982</td><td></td></tr><tr><td>Adquisición y análisis de imágenes para la producción de NO&nbsp;</td><td>Imagen universal</td><td>Metafluor</td><td></td></tr></tbody></table>

desarrollo y caracterización de<em&gt; in vitro</em&gt; red de microvasos y mediciones cuantitativas de endotelial [ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; y la producción de óxido nítrico

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Las células endoteliales (EC) que recubren las paredes de los vasos sanguíneos in vivo están constantemente expuestos a fluir, pero ECs cultivadas a menudo se cultivan en condiciones estáticas y exhiben un fenotipo pro-inflamatoria. Aunque el desarrollo de dispositivos de microfluidos ha sido abrazado por los ingenieros de más de dos décadas, sus aplicaciones biológicas siguen siendo limitados. Un modelo in vitro de microvasos fisiológicamente más relevantes en validada por aplicaciones biológicas es importante para avanzar en el campo y salvar las diferencias entre in vivo e in vitro estudios. A continuación, presentamos los procedimientos detallados para el desarrollo de la red de microvasos cultivan utilizando un dispositivo de microfluidos con una capacidad de perfusión a largo plazo. También demuestran sus aplicaciones para mediciones cuantitativas de los cambios inducidos por agonistas en EC I y el óxido nítrico (NO) [Ca 2+] en tiempo real utilizando confocal y microscopía de fluorescencia convencional. La red de microvasos formadotrabajo con perfusión continua mostró uniones bien desarrollados entre los CE. VE-cadherina distribución estaba más cerca de la observada en los microvasos intacto que monocapas CE estáticamente cultivadas. ATP-indujo aumentos transitorios en la CE [Ca2 +] i y la producción de NO se midió cuantitativamente en los niveles de células individuales, que haya validado la funcionalidad de los microvasos cultivadas. Este dispositivo de microfluidos permite ECs para crecer bajo un bien controlado, el flujo fisiológicamente relevante, lo que hace que el entorno de cultivo celular más cercano a in vivo que el de los cultivos 2D convencionales, estáticas. El diseño de la red de microcanales es altamente versátil, y el proceso de fabricación es simple y repetible. El dispositivo se puede integrar fácilmente en el sistema microscópico confocal o convencional que permite imágenes de alta resolución. Lo más importante, ya que la red de microvasos cultivadas puede estar formado por ECs humanos primarios, este enfoque servirá como una herramienta útil para investigar cómopatológicamente componentes sanguíneos alterados a partir de muestras de pacientes humanos afectan a los EC y dar una idea de los problemas clínicos. También puede ser desarrollado como una plataforma para la detección de drogas.

Esta sección muestra algunos de los resultados obtenidos con la red de microvasos cultivaron desarrollado con este protocolo. El patrón de microcanales es una red de ramificación de tres niveles (Figura 1A). En este diseño, unas 159 micras de ancho ramas del canal madre en dos canales de 126 micras de ancho, y las ramas de nuevo en cuatro canales de 100 micras de ancho hija. Una simulación numérica 3D se realizó para estimar la distribución de esfuerzo cortante bajo el c...

Las células endoteliales primarias de la vena umbilical humana (HUVECs) se cultivaron hasta la confluencia dentro de un dispositivo de red microfluídica. Se ilustró la unión de las células endoteliales y las distribuciones de F-actina, y se cuantificaron en tiempo real los cambios en la concentración de calcio intracelular y la producción de óxido nítrico en respuesta al trifosfato de adenosina (ATP) a nivel de células individuales.

Desarrollo y caracterización de<em&gt; In Vitro</em&gt; Red de microvasos y mediciones cuantitativas de endotelial [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Y la producción de óxido nítrico

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

El objetivo general de este procedimiento es desarrollar un dispositivo microfluídico que permita a las células endoteliales crecer bajo flujo de cizallamiento fisiológicamente relevante y medir los cambios inducidos por agonistas en su producción de calcio y óxido nítrico. Este enfoque puede ayudar a impulsar el futuro de la investigación sobre microvasos, validando el modelo in vitro de microvasos y cerrando las brechas entre los estudios in vivo e in vitro. Las principales ventajas de esta técnica son el diseño versátil de los microcanales para imitar diversos tipos de vasculatura y la mejora del entorno de cultivo celular, que se asemeja más a las condiciones in vivo que al cultivo estático convencional de los cultivos originales.Las personas que demostrarán los procedimientos serán Sulei y Xiang, los dos de mi laboratorio. Antes de comenzar, utilice la fotolitografía estándar para crear un molde maestro y la litografía suave para fabricar los dispositivos de microcanales de PDMS, tal como se describe en el protocolo escrito. Para preparar los dispositivos de microcanales, primero cubra la entrada y la salida con un trozo delgado de PDMS y coloque el dispositivo dentro de una placa de Petri con un tejido húmedo.A continuación, envuelva el recipiente con Parafilm y esterilice el dispositivo bajo luz UV durante al menos tres horas. El siguiente paso es aplicar la fibronectina. Primero, coloque una gota de 30 a 50 microlitros de PBS en la entrada.Cree un vacío en la salida para enjuagar el dispositivo. A continuación, coloque una gota de fibronectina de 100 microgramos por mililitro en la entrada. Cree un vacío en la salida para cargar la solución de fibronectina.A continuación, cubra la entrada y la salida. Envuelva el recipiente con Parafilm nuevamente e incube el dispositivo durante la noche a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, enjuague manualmente el dispositivo con PBS tres veces.Luego, cargue el dispositivo con 30 a 50 microlitros de medio de cultivo celular y caliente el dispositivo en una incubadora a 37 grados Celsius durante al menos 15 minutos. Comience mezclando las HUVECs en medio de cultivo para HUVECs con un ocho por ciento de Dextrano a una concentración de dos a cuatro millones de células por mililitro. El Dextrano es necesario para aumentar la viscosidad y, por lo tanto, mejorar la siembra celular.A continuación, coloque de 10 a 20 microlitros de células sobre la entrada y introdúzcalas mediante gravedad o mediante acción capilar usando una pipeta Pasteur de vidrio en la salida. A continuación, incube el dispositivo durante 15 a 20 minutos. Luego, verifique el estado de siembra bajo un microscopio.Si es necesario, cargue más células para alcanzar una densidad celular deseada. Una vez que se hayan cargado suficientes células, enjuague suavemente el dispositivo con medio de cultivo celular normal y tibio para eliminar la dextrana. A continuación, cultive el dispositivo sin perfusión de medio alguno durante seis horas.A continuación, prepare las conexiones de tubo para la perfusión a largo plazo. Sujete el dispositivo a una placa de Petri con cinta adhesiva y luego conecte el tubo de entrada a una jeringa con aguja. Introduzca el tubo tanto en la entrada como en la salida del dispositivo.Conecte el tubo de salida a un recolector de desechos. A continuación, coloque el plato y el recipiente para desechos en una incubadora. Conecte la jeringa con un tubo de entrada largo a una bomba de perfusión externa que atraviese la puerta de la incubadora.A continuación, ajuste la tasa de perfusión según el diseño experimental. Con una perfusión bien controlada, el cultivo en la red de microvasos puede mantenerse hasta dos semanas. Por lo tanto, puede extenderse a estudios a más largo plazo que imiten el entorno celular y hemodinámico en diferentes condiciones fisiológicas y patológicas.Para comenzar la inmunomarcación, como la etiquetación de VE-cadherina, primero fije las células perfundiendo con paraformaldehído al dos por ciento durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Después de una serie de perfusiones para bloquear, permeabilizar y teñir con anticuerpos, mantenga el dispositivo a cuatro grados Celsius hasta que se tomen las imágenes de las células. Para obtener imágenes de la concentración de calcio en las células, perfunda el dispositivo con 10 miligramos por mililitro de albúmina en solución de Ringer durante 15 minutos a 37 grados Celsius.A continuación, perfunda el dispositivo con Fluo-4 AM a cinco micromolar durante 40 minutos a 37 grados Celsius. Luego, lave el Fluo-4 AM unido al lumen con Ringer albúmina durante 15 minutos a 37 grados Celsius. A continuación, encienda el sistema confocal para la obtención de imágenes del nivel de calcio intracelular con Fluo-4 AM. Adquiera imágenes de los microvasos cargados con Fluo-4.Recolecte las imágenes basales durante 10 minutos. Luego, perfunda el dispositivo continuamente con ATP de 10 micromolar y registre los cambios en la intensidad de fluorescencia durante 20 minutos. Para obtener imágenes de la producción de óxido nítrico en las células, perfunda el dispositivo con Ringer albúmina durante 15 minutos a 37 grados Celsius.A continuación, perfunda las células con DAF-2 DA a 5 micromolares durante aproximadamente 35 a 40 minutos a 37 grados Celsius. Luego, prepare el sistema de imágenes de fluorescencia para medir la producción de óxido nítrico inducida por ATP. Registre la línea base durante 5 minutos, luego perfunda el dispositivo con ATP a 10 micromolares y recoja las imágenes durante 30 minutos a intervalos de un minuto.Para la medición de óxido nítrico en células, es importante comprender que el adaptador de desprendimiento para el perfil de intensidad representa una producción acumulada de óxido nítrico en el tiempo y no una concentración de óxido nítrico. Seleccione manualmente las regiones de interés a partir de las imágenes recopiladas a nivel celular individual. Cada ROI abarca el área de una célula individual, que puede indicarse mediante el contorno de fluorescencia.Cuantifique los cambios inducidos por el ATP en el calcio endotelial y el óxido nítrico. Calcule los cambios en la intensidad de fluorescencia de Fluo-4, restando el fondo del tejido. Cuantifique la tasa de producción de óxido nítrico mediante la conversión diferencial inicial de la intensidad de fluorescencia de DAF-2 a lo largo del tiempo.El patrón de microcanales en el dispositivo presenta una red de ramificación de tres niveles. Se realizó una simulación numérica tridimensional para estimar las distribuciones de tensión cortante bajo un caudal de 0,35 microlitros por minuto. Las células endoteliales se sembraron en la red según lo descrito.Luego, se marcaron las fibras de actina F y los núcleos. De manera similar, también se tiñó la VE-cadherina. Los resultados fueron similares a la expresión de VE-cadherina en una vénula intacta.A continuación, se examinaron los aumentos inducidos por ATP en el calcio intracelular y la producción de óxido nítrico. Los niveles de calcio se analizaron utilizando Fluo-4 AM, como se describe en la sección de protocolo. La producción de óxido nítrico se monitoreó utilizando DAF-2 DA, como se describe en la sección de protocolo.Los resultados fueron comparables con los obtenidos mediante vénulas íntegras perfundidas individualmente. El método fue fácil y estuvo rigurosamente controlado en condiciones biológicas y en entornos fluidos dinámicos, lo cual no habría sido posible con técnicas convencionales de microcirugía. Después de ver este video, usted debería tener una buena comprensión de cómo fabricar el dispositivo y realizar mediciones de calcio y óxido nítrico.Después de que esta técnica allanara el camino para que los investigadores no solo estudiaran los mecanismos subyacentes inducidos por agonistas, sino que también abrieran aplicaciones más amplias para la investigación biomédica.

development-characterization-vitro-microvessel-network-quantitative

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

La retina murino neonatal proporciona un modelo bien caracterizado fisiológica de la angiogénesis, que permite que las investigaciones de las funciones de los diferentes genes o fármacos que modulan la angiogénesis en...

Todo el montaje de la tinción de inmunofluorescencia del Neonatal ratón Retina de investigar Angiogénesis<em&gt; En vivo</em

Una plataforma de micro-canales-on-a-chip fue desarrollado por la combinación de la técnica de fotolitografía reflowable fotosensible, litografía blanda, y microfluidos. La plataforma de microcanales endotelizado imita la geometría tridimensional (3D) de microvasos in vivo, se ejecuta bajo flujo de perfusión continua controlada, permite la formación de imágenes de alta calidad y en tiempo real y se puede aplicar para la investigación microvascular.

Procedimiento para el Desarrollo de la Multi-profundidad Circular transversal endotelizado microcanales-on-a-chip

El ensayo de formación de tubo es un método rápido, cuantificable para medir la angiogénesis in vitro. Las células endoteliales se combinan con los medios condicionados y se sembraron en extracto de membrana basal. La formación del tubo se produce dentro de horas y los túbulos recién formadas cuantificarse fácilmente.

Ensayo de formación de tubos de células endoteliales para la<em&gt; In Vitro</em&gt; Estudio de la angiogénesis

La función de las células vasculares depende de la actividad de los mensajeros intracelulares.  Aquí se describe un método de imagen ex vivo de dos fotones que permite la medición de los niveles intracelulares de calcio y óxido nítrico en respuesta a estímulos fisiológicos y farmacológicos en células endoteliales y musculares lisas individuales de una aorta aislada.

De dos fotones de imágenes de Ca intracelular<sup&gt; 2 +</sup&gt; Manejo y producción de óxido nítrico en el endotelio y las células del músculo liso de la aorta de rata aislada

Demostrado aquí son protocolos para el aislamiento (1) recién endoteliales cerebrales intactos "tubos" y mediciones (2) simultáneas de calcio endotelial y la membrana potencial durante la hiperpolarización derivados del endotelio. Además, estos métodos permiten ajuste farmacológico de calcio de la célula endotelial y señalización eléctrica como variables experimentales individuales o interactivas.

Medidas simultáneas de calcio intracelular y el potencial de membrana en el endotelio Cerebral de ratón recién aislado e intacto

Los progenitores endoteliales derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC-EP) tienen el potencial de revolucionar los tratamientos de enfermedades cardiovasculares y permitir la creación de modelos de enfermedades cardiovasculares más fieles. En este documento, se describe la encapsulación de iPSC-EPs en microambientes tridimensionales de colágeno (3D) y un análisis cuantitativo del potencial vasculogénico de estas células.

Un modelo 3D In Vitro y una tubería computacional para cuantificar el potencial vasculogénico de los progenitores endoteliales derivados de iPSC

Aquí, proporcionamos un chip microfluídico y un sistema microfluídico de circulación automáticamente controlado y altamente eficiente que recapitula el microambiente inicial de neovascularización, permitiendo que las células endoteliales (ECs) sean estimuladas por un alto estrés esquilar luminal, nivel fisiológico de flujo transendotelial y diversa distribución del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) simultáneamente.

Modelo microfluídico para imitar el evento inicial de neovascularización

Este ensayo utiliza células madre embrionarias de ratón diferenciadas en cuerpos embrioides cultivados en gel de colágeno 3D para analizar los procesos biológicos que controlan la angiogénesis germinada in vitro. La técnica se puede aplicar para probar medicamentos, modelar enfermedades y estudiar genes específicos en el contexto de deleciones que son embrionariamente letales.

In vitro Ensayo de germinación tridimensional de angiogénesis utilizando células madre embrionarias de ratón para el modelado de enfermedades vasculares y pruebas de fármacos

La preparación intensiva de "tubos" endoteliales cerebrales intactos de ratón de las arteriolas del parénquima cerebral se ilustra para estudiar la regulación del flujo sanguíneo cerebral. Además, demostramos las fortalezas experimentales de este modelo de estudio endotelial para imágenes de fluorescencia y medición electrofisiológica de vías clave de señalización celular, incluidos los cambios en el [Ca2+] intracelular y el potencial de membrana.

Aislamiento y análisis funcional del endotelio arteriolar del parénquima cerebral de ratón

Este protocolo detalla un ensayo in vitro para medir la captación de lípidos celulares en células endoteliales tras la estimulación con BODIPY-C12 y BODIPY-C16 , análogos fluorescentes de ácidos grasos saturados de cadena larga y cadena muy larga. Este método es eficiente y adaptable a otros tipos de células, ofreciendo un enfoque útil para estudiar el metabolismo de los lípidos.

Cuantificación de la absorción de ácidos grasos endoteliales utilizando análogos de ácidos grasos fluorescentes

Aprende a desarrollar una red de microvasos in vitro con células endoteliales HUVEC en dispositivos microfluídicos. Este método permite medir cambios en calcio intracelular y producción de óxido nítrico en tiempo real.

Desarrollo y caracterización de In Vitro Red de microvasos y mediciones cuantitativas de endotelial Ca 2+ i Y la producción de óxido nítrico (Video) | JoVE Journal

Desarrollo y caracterización de

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