No invasivo en 3D de visualización con la Sub-micron resolución mediante sincrotrón de rayos X de la tomografía
27 de mayo de 2008
Hemos utilizado sincrotrón de rayos X de tomografía en la Instalación Europea de Radiación Sincrotrón (ESRF) de forma no invasiva producir conjuntos de datos 3D tomográfica con un píxel de resolución de 0.7μm. El uso de software volumen renderizado, lo que permite la reconstrucción de las estructuras internas en su estado natural, sin los artefactos producidos por el corte histológico.
Hello.My nombre es Michelle Ov del Laboratorio de Murciélagos de la Universidad de Tubing, y en esta presentación quiero hablar sobre la visualización tridimensional no invasiva de la organización interna de las micro AHR utilizando tomografía de rayos X de sincrotrón con una resolución submicrónica. El sistema modelo con el que estamos trabajando es el ácaro orbitado Aus Long osis, una salida micro COLYER AHR de 800 micras a un milímetro de tamaño corporal. Esta es una foto tomada de toda la cultura de laboratorio donde se puede ver a los animales alimentándose de algas.
Para estudiar la organización interna de Argos, utilizamos radiación de rayos X de sincrotrón para producir datos tomográficos de VOX en el SRF y Grable. Aquí se ve una imagen del ESRF con el gran anillo de almacenamiento y en la esquina superior derecha se ve la sala experimental de ID 19, que se encuentra fuera del anillo Para las mediciones, las muestras se apuntaron críticamente a la derecha y se montaron en alfileres de plástico con superpegamento. Los experimentos se realizaron a 20,5 KEV y se tomaron 1.500 proyecciones para las reconstrucciones.
Aquí se ve la cámara con un chip CCD co-freelance, rango dinámico de 14 bits y cuatro megapíxeles. El simulador que se muestra en la parte inferior de esta imagen traduce los rayos X a la luz visible. Se trata de un primer plano del portamuestras y de la mesa de rotación.
La muestra se monta en el cabezal del medidor Goya para permitir una orientación adecuada de la muestra en el haz. Una descripción detallada de la configuración experimental se da en nuestro artículo de 2007 en el Journal of Microscopy. En esta presentación, me centraré en los analizadores de datos con respecto a la visualización tridimensional utilizando el software Fiji Studio Max.
Primero, le mostraré cómo eliminar los valores de gris del fondo para extraer la información de la muestra. En el histograma, se ve un pico grande, que pertenece principalmente a los valores de gris del fondo. Después de eliminar este pico del histograma, puede ver la muestra que sale del cubo gris.
A continuación, te mostraré cómo rotar el objeto usando el fotograma clave VG studio. Max tiene un conjunto de trayectorias de cámara predefinidas. Aquí utilizo el círculo XY para generar rotación alrededor de las X verticales, y esta es la animación final.
La gran estructura en la parte trasera del animal corresponde a la superficie del superpegamento. Ahora te voy a mostrar cómo configurar un plano de corte virtual para poder tener una visión tridimensional de la organización interna de la muestra. Hay tres orientaciones en las que se puede establecer un plano de corte frontal con celo real.
Aquí utilizo el plano frontal y encuentro una posición de corte en algún lugar en el centro del animal, en la región del, este plano de corte no tiene por qué ser estático. Nuevamente, usando el marco clave, se puede mover a lo largo de cualquier eje. En este ejemplo, utilizo el clip preestablecido Z para mover el plano de corte a lo largo de un eje longitudinal de la muestra, y así es como se ve la animación final paso a paso, puede ver y seguir la organización 3D de todas las estructuras internas con una resolución P de solo 0,7 micras.
Además de las trayectorias de cámara predefinidas, también es posible generar trayectorias de cámara específicas del usuario. Para hacer esto, elija el modo de mirada libre de la cámara y ajuste la cámara y la distancia focal de la lente virtual a cualquier posición deseada. Paso a paso, se pueden definir nuevas posiciones de cámara para seguir un camino individual de cualquier complejidad.
La ventana 3D en la parte superior izquierda muestra el efecto de todos los ajustes de la cámara en tiempo real. El último ejemplo te lleva en un vuelo virtual siguiendo todo el sistema digestivo a través del animal. Aquí se ven algunas partes de la gma, la mina de carbón, el labrum y la rotella.
Nos acercamos y entramos en la boca del animal. Aquí se pueden ver los PHNs en la parte dorsal. Ahora estamos pasando a través del esófago para entrar en los ventriculares.
Nuestros ácaros remachados tienen dos grandes ker. Se trata de estructuras similares con función digestiva. Entramos en el seum derecho.
A través de su pequeña abertura, se pueden ver numerosas celdas IDE. Estos juegan un papel importante en la digestión, aunque la función y el mecanismo completos aún no se comprenden completamente. Volviendo a los ventriculares, vemos una estructura particular, la válvula Isal a través de la cual entramos a los ventriculares hace un minuto, justo en el límite de los ventriculares y el colon.
Se puede ver un toro de comida, que está compactado y rodeado por una membrana atrófica. Detrás del bolo alimenticio, se ve una paleta fecal. Estamos volando a través de esta paleta de FE en este momento.
Después, pasamos el punto y coma corto y entramos en el post colon. Aquí se ve el gran y característico microbiano. Finalmente, aquí se puede ver la superficie interna de las placas de animales en particular, como una paleta de fe.
Salimos del sistema digestivo. Ahora tenemos una breve mirada final en el lado ventral exterior del animal y vemos las placas de un animal, las placas AAL y las placas genitales.
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Resumen
Este estudio presenta un método no invasivo para visualizar la organización interna de las salidas micro AHR mediante tomografía de rayos X de sincrotrón. La técnica permite obtener imágenes tridimensionales de alta resolución sin los artefactos asociados con los métodos histológicos tradicionales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Técnicas de imagen
- Microbiología
Antecedentes
- Las salidas de micro AHR son organismos pequeños que requieren un análisis interno detallado.
- Los métodos tradicionales de imagen pueden introducir artefactos que oscurecen las estructuras reales.
- La tomografía de rayos X de sincrotrón ofrece una solución con alta resolución.
- El estudio se centra en el ácaro orbiteado Aus Long osis como organismo modelo.
Objetivo del estudio
- Visualizar las estructuras internas de las muestras de micro AHR.
- Mostrar la eficacia de la tomografía de rayos X de sincrotrón.
- Proporcionar información sobre la organización de estos organismos pequeños.
Métodos Utilizados
- Tomografía de rayos X de sincrotrón en la Instalación Europea de Radiación de Sincrotrón (ESRF).
- Las muestras fueron secadas por punto crítico y montadas para la obtención de imágenes.
- La obtención de imágenes se realizó a 20,5 keV con 1.500 proyecciones tomadas.
- Se utilizó un software de renderizado volumétrico para la reconstrucción de datos.
Resultados Principales
- Se produjeron conjuntos de datos tomográficos 3D con una resolución de píxeles de 0.7µm.
- Las estructuras internas fueron reconstruidas en su estado natural.
- El método evitó con éxito los artefactos provenientes del corte histológico.
- Las visualizaciones proporcionaron nuevas perspectivas sobre la organización de las salidas micro AHR.
Conclusiones
- La tomografía de rayos X de sincrotrón es una herramienta poderosa para la obtención de imágenes no invasivas.
- La técnica mejora nuestra comprensión de estructuras biológicas pequeñas.
- Estudios futuros pueden aprovechar este método para diversas aplicaciones en biología.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La visualización tridimensional no invasiva con resolución submicrométrica permite un análisis estructural interno detallado de sistemas biológicos a microescala sin necesidad de seccionado destructivo. Este enfoque facilita la validación de objetivos y la reducción de riesgos mecanicistas en las fases iniciales del descubrimiento, al proporcionar datos morfológicos cuantitativos en estado nativo. El método mejora la confianza predictiva en ensayos fenotípicos y desarrollo de ensayos en modelos relevantes para enfermedades donde la histología tradicional falla debido al tamaño de la muestra o a artefactos de preparación.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la reconstrucción tridimensional de sistemas de órganos internos en modelos de microartrópodos.
- Valor operativo: Proporciona imágenes no destructivas para muestras únicas o limitadas, preservando el material para análisis posteriores.
- Valor predictivo: Facilita la reducción de riesgos biológicos al visualizar la anatomía funcional y la organización de los tejidos sin artefactos por seccionado.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera conjuntos de datos morfológicos cuantitativos con resolución de píxeles de 0,7 µm para fenotipado preciso y comparación estructural.
- Valor operativo: Permite flujos de trabajo estandarizados y reproducibles de representación volumétrica mediante trayectorias de cámara con fotogramas clave y planos de corte virtuales.
- Preparación para ensayos: Facilita la visualización de sistemas orgánicos completos (por ejemplo, el tracto digestivo) para orientar la selección de biomarcadores y el diseño de lecturas funcionales.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Permite el seguimiento longitudinal de estructuras internas en sistemas relevantes para enfermedades mediante visualización 3D animada.
- Reducción de Riesgos Mecanicistas: Revela características anatómicas ocultas (por ejemplo, estructuras intracelulares, mecanismos de válvulas) para aclarar las vías fisiopatológicas.
- Alineación Preclínica: Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo al proporcionar validación estructural libre de artefactos en diversos sistemas modelo.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano como un paso de imagen no destructivo tras la preparación de la muestra y anterior al desarrollo de ensayos funcionales, permitiendo un diseño iterativo de estudios de validación de dianas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al revelar la organización interna de sistemas biológicos a escala microscópica.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos en 3D adecuados para plataformas de cribado de alto contenido que requieren resolución subcelular.
- Análisis: Permite la extracción de puntos anatómicos morfométricos y mediciones volumétricas para comparaciones estadísticas entre diferentes condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Se conecta con la validación preclínica al proporcionar datos estructurales en estado nativo que se correlacionan con fenotipos funcionales.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad de imagen reutilizable para aplicaciones entre proyectos en sistemas modelo de microorganismos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza en la validación del objetivo al eliminar artefactos histológicos y preservar la ultraestructura nativa.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad mediante protocolos estandarizados de sincrotrón y tuberías de visualización impulsadas por software.
- Valor estratégico: Reduce el riesgo de fracaso en fases avanzadas al permitir la detección temprana de anomalías estructurales en modelos candidatos principales.
- Impacto en la cartera: Orienta las decisiones de continuar o descartar mediante datos estructurales cuantitativos confiables en micro-modelos relevantes para la enfermedad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en seguridad con radiación de sincrotrón, reconstrucción tomográfica y software de renderizado volumétrico (por ejemplo, Fiji, VG Studio Max).
- Depende del acceso a instalaciones de sincrotrón (por ejemplo, ESRF) con capacidades de línea de haz para imágenes de resolución submicrométrica a 20,5 keV.
- Necesita la estandarización entre equipos de la preparación de muestras (secado por punto crítico, montaje) y de los parámetros de imagen (1.500 proyecciones, protocolos de rotación).
- Implica consideraciones de adaptación para densidades de muestra variables, dureza del cutícula y medios de montaje en diferentes especies de microartrópodos.
- Limitado por restricciones de tamaño de muestra (<1 mm) y por la necesidad de especímenes estables a la radiación durante exposiciones prolongadas al haz.
Preguntas frecuentes sobre biofarmacia
Chapters in this video
0:18
Introduction
0:38
X-ray radiation tomographic measurements
2:08
Removing the background and extracting the sample information
2:38
Rotating the object using the keyframer
3:25
Setting the virtual plane
4:06
Moving the slice through the object using the keyframer
4:45
User specific camera paths
5:23
Following the digestive system through the whole animal
