Etiquetado y hESCs hMSCs con nanopartículas de óxido de hierro para no invasivo en el seguimiento in vivo mediante RM

Para la evaluación de nuevas terapias con células madre es importante no invasiva vía las células inyectadas en vivo. Este video le mostrará cómo etiquetar células madre mesenquimales humanas embrionarias y con los agentes de contraste basados ​​en óxido de hierro en vivo para su posterior RM en vivo.

Bienvenidos al laboratorio del Dr.Haiku Dal Link. Nos gustaría agradecer al Instituto de Medicina Regenerativa de California por financiar este proyecto para la evaluación de nuevas terapias con células madre. Es importante realizar un seguimiento no invasivo de las células inyectadas in vivo.

Esto es posible mediante el marcaje de las células in vitro con agentes de contraste específicos o multifuncionales para la RM o la imagen óptica. Este video le mostrará cómo etiquetar células madre mesenquimales humanas y embrionarias humanas para imágenes in vivo posteriores. Hola, soy Tobias Henning, del Grupo de Investigación de Agentes de Contraste del Centro de Imágenes Moleculares y Funcionales del Departamento de Radiología de la Universidad de California en San Francisco.

Hoy les voy a mostrar los procedimientos para el marcaje in vitro de células madre mesenquimales humanas con périco, carón, y de células madre embrionarias humanas con óxidos de fem. Esta técnica es útil para localizar células inyectadas in vivo o para obtener información sobre su estado funcional. Los procedimientos para el marcaje celular con agente consciente de resonancia magnética varían para las células madre embrionarias y mesenquimales, pero ambas técnicas implican los siguientes pasos, preparación del cultivo celular que es la siembra de células tal como se adhieren a los cultivos celulares, preparación del etiquetado, marcaje de los medios de las células mediante tripsina de incubación simple de células madre y lavado del agente consciente libre, evaluación de la eficiencia del etiquetado y la viabilidad celular.

Así que comencemos y etiquetemos algunas celdas. Ahora comencemos con el etiquetado de células madre mesenquimales con Theo Carbatrol. En primer lugar, mostraré la técnica para marcar células madre mesenquimales humanas con theo carron y un agente de contraste a base de óxido de hierro para la resonancia magnética.

Para comenzar, colocamos las células de 18 a 24 horas antes del procedimiento de etiquetado en matraces T 75 a una confluencia del 80%De lo contrario, si usa una placa de cultivo diferente que equivale a aproximadamente 10, 000 células por centímetro cuadrado al día siguiente, comenzamos con la preparación del medio de etiquetado agregando 30 microlitros de reservista a ocho mililitros de medio libre de suero. Esto etiquetará un T 75 FLA con una cofluidez del 80% y corresponde a una concentración de cien microgramos de hierro por mililitro de medio. Ahora retiramos los medios de cultivo y lavamos las células una vez con PBS o medios sin suero.

Hacemos esto para deshacernos de las proteínas séricas residuales y otros constituyentes del medio que podrían unirse a los agentes de contraste e influir en la eficiencia del etiquetado. Añada el medio de etiquetado al matraz y vuelva a introducirlo en la incubadora. Después de dos horas, agregue dos ml de FCS para lograr una concentración final del 20% de FCS.

Hacemos esto para asegurarnos de que las células no reciban ningún estímulo para diferenciar que está muerta en su entorno familiar. Ahora incubamos las células durante 18 horas. Al día siguiente enjuagamos las células con PBS y luego las trituramos de acuerdo con los protocolos de cultivo estándar para deshacernos del agente de contraste libre.

Una vez que Tryps está inizado, la suspensión de la célula se lava tres veces centrifugando a 400 RCF durante cinco minutos, y reus suspendiendo en PBS. Eso es todo. La célula P final se puede resuspender y está lista para nuevos experimentos.

Ahora contamos las celdas, ya que es posible que hayamos perdido algunas durante los pasos de lavado anteriores. También realizamos pruebas de viabilidad en este punto utilizando el ensayo de exclusión de azul trippin y tomamos algunas muestras para el análisis espectrométrico para medir la eficiencia del etiquetado. Ahora déjame mostrarte cómo etiquetar células madre embrionarias humanas con óxidos de fem.

Para empezar, colocamos las células madre embrionarias humanas en platos de 10 centímetros. Como de costumbre, estos platos están precodificados con gelatina y tienen células alimentadoras irradiadas en ellos. También puede utilizar este protocolo para cultivos libres de alimentadores.

Dejamos que las células madre embrionarias humanas se adhieran y crezcan durante aproximadamente tres o cuatro días para que formen colonias de tamaño mediano. Durante este tiempo, nos aseguramos de que las colonias no crezcan demasiado porque las colonias más grandes son más difíciles de romper. Más tarde, las células diferenciadas pueden contaminar estos cultivos.

Entonces, dependiendo de la limpieza de las colonias, es posible que tengamos que deshacernos de los cultivos diferenciados por disección. Ahora preparamos el medio de marcaje que consiste en óxidos de teorema a una concentración de cien microgramos de hierro por mililitro y medios de células madre embrionarias humanas completas. Para ello, mezclamos 89 microlitros, óxidos de phem y 10 mililitros de sustrato completo.

En cuanto a las células madre mesenquimales, lavamos el plato una vez con medios completos para deshacernos de las células muertas o los desechos. A continuación, añadimos 10 mililitros de rotulador por placa e incubamos las células durante cuatro horas. Ahora el etiquetado está completo.

En el siguiente paso, debemos lavar las células y obtener una suspensión de una sola célula. Para un uso posterior Para esto, primero enjuagamos el plato con PBS. Ahora reemplazamos el PBS con cinco mililitros de tripsina al 0,25% e incubamos durante cinco minutos en la incubadora o hasta que las células se desprendan.

Es útil golpear el plato con frecuencia, ya que las células se han desprendido. Ten en cuenta que si el plato contenía colonias más grandes, podrían quedar algunos grumos para deshacerse de ellos. Mezclamos bien toda la suspensión pipeteando hacia arriba y hacia abajo, usando una pipeta serológica, y luego la dejamos reposar durante otros dos minutos.

En la tripsina. No utilizamos una pipeta eppendorf, ya que el pipeteo repetido de las células a través de la punta fina puede romper las membranas celulares si todo ha funcionado correctamente. Ahora tenemos una suspensión de una sola célula que está mezclada con una gran cantidad de desechos que se originan en la gelatina que recubre la matriz de células madre embrionarias y las células muertas.

Ahora podemos deshacernos de los grumos o complejos restantes pasando las células a través de un colador de células de 40 micrómetros. Ahora necesitamos aislar las células madre embrionarias humanas de las células alimentadoras irradiadas. Esto se puede hacer de manera eficiente colocando la suspensión celular en un plato recubierto de gelatina.

Si no manipulamos el plato, todas las células se sedimentarán, pero los comederos se adherirán más rápido que las células madre embrionarias humanas. Por lo tanto, si retiramos la SUP natin después de 45 minutos, debe contener principalmente células madre embrionarias humanas, mientras que los comederos deben estar principalmente adheridos al plato. De esta manera, obtenemos una suspensión unicelular de células madre embrionarias humanas marcadas magnéticamente que se puede utilizar para experimentos posteriores como en el protocolo anterior.

En este punto, debe contar las celdas y tomar muestras para evaluar la viabilidad y medir la eficiencia del etiquetado. Así que esto termina los protocolos que quería mostrarles hoy. Ahora echemos un vistazo a cómo podemos rastrear células madre marcadas in vivo.

Esta diapositiva muestra células madre marcadas con OC Carone. Después de haber sido inyectados en el cerebro de un ratón, reutilizamos 20.000 células en un volumen de 75 nanolitros y las inyectamos en la zona subventricular. El óxido de hierro en las células implantadas causa un artefacto de susceptibilidad que se puede ver en la resonancia magnética. Imágenes.

Acabamos de mostrarte cómo etiquetar células madre embrionarias y mesenquimales. El seguimiento in vitro con agentes Mr.Contrast de células madre mesenquimales y embrionarias in vivo tiene un enorme potencial para evaluar nuevas terapias con células madre. Así que eso es todo.

Gracias por mirar y buena suerte con el etiquetado de sus células.