La chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP)

1. rendre la Phase Mobile

1. Préparer la phase mobile en ajoutant 400 mL d’acétonitrile à environ 1,5 L d’eau purifiée de DI.
2. Ajouter avec précaution 2,4 mL d’acide acétique glacial à cette solution.
3. Diluer la solution d’un volume total de 2.0 L dans une fiole jaugée avec de l’eau purifiée DI. La solution obtenue doit avoir un pH entre 2,8 à 3,2.
4. Ajuster le pH à 4,2 en ajoutant 40 % d’hydroxyde de sodium, titration à l’aide d’un pH-mètre numérique calibré. Ajouter très lentement lorsque le pH atteint 4.0. Cela devrait prendre environ 50 gouttes d’accomplir.
5. Filtrer la phase mobile à travers un filtre de membrane de Nylon 66 0,47 µm sous vide pour dégazer la solution et pour éliminer les solides qui pouvaient brancher la colonne chromatographique. Il est important de dégazer la phase mobile pour éviter d’avoir une bulle, ce qui pourrait provoquer un vide dans la phase stationnaire à l’entrée de la colonne ou faire son chemin dans la cellule du détecteur, causant l’instabilité avec l’absorbance UV.

2. créer les Solutions composant

Les trois composantes qui doivent être apportées sont la caféine (0,8 mg/mL), benzoate de potassium (1,4 mg/mL) et l’aspartame (ester méthylique de L-aspartyl-L-phénylalanine) (6,0 mg/mL). Ces concentrations, une fois diluées de la même façon, mettent les normes aux niveaux trouvés dans les échantillons de soude.

1. Ajouter 0,40 g de caféine dans une fiole jaugée de 500 mL, puis diluer à la marque 500 mL avec de l’eau distillée.
2. Ajoutez 0,70 g de benzoate dans une fiole jaugée de 500 mL, puis diluer à la marque 500 mL avec de l’eau distillée.
3. Ajouter 0,60 g d’aspartame dans une fiole jaugée de 100 mL, puis diluer à la marque de 100 mL avec l’eau distillée. Place cette solution dans un réfrigérateur pour éviter la décomposition pendant l’entreposage.

3. rendre les Solutions Standard 7

Tous les trois composantes ont des coefficients de distribution différents, qui influe sur la manière dont chacun interagit avec tous les deux des phases. Plus le coefficient de distribution, le temps plus que le composant passe dans la phase stationnaire, ce qui entraîne une rétention plus longue fois pour atteindre le détecteur.

1. Suivant le tableau dans le tableau 1, pipette une quantité suffisante de chaque composant dans une fiole jaugée de 50 mL.
2. Diluer chaque solution stock à la marque 50 mL sur les fioles jaugées avec la phase mobile.
3. Versez chaque solution étalon dans étiquetées petites fioles dans un rack d’échantillon.
4. Rangez les grilles des échantillons dans un réfrigérateur, ainsi que les autres solutions dans les fioles jaugées de 50 mL.

4. vérifier les paramètres initiaux du système HPLC

1. Confirmer que la conduite d’écoulement est dans un conteneur à déchets et n’est pas recyclage dans la phase mobile.
2. Vérifiez que le débit de la phase mobile est défini sur 0,5 mL/min. C’est suffisamment élevé pour permettre tous les pics à éluer à moins de 5 min et ralentir suffisamment pour permettre une résolution agréable.
3. Vérifier que la pression minimale et maximale et la vitesse d’écoulement sont définies pour les valeurs correctes sur le panneau avant du système solvant (la pompe).
   1. Réglage de la pression minimale : 250 lb/po2 (c’est à l’arrêt de la pompe, si une fuite se produit).
   2. Réglage de la pression maximale : 4 000 lb/po2 (c’est pour protéger la pompe contre la rupture, si une forme de sabot).
4. Appuyez sur « zéro » sur la façade du détecteur afin de mettre à l’essai à blanc (le blanc est la phase mobile pure).
5. Rincez une seringue de 100 µL d’eau déionisée, puis avec plusieurs volumes d’un étalons de travail pour être analysés et remplissez la seringue avec cette solution. Commencez avec les 3 échantillons mono-composant, qui permet d’identifier le pic de chaque composant d’intérêt.

5. manuellement par injection de l’échantillon et la collecte de données

1. Avec le stylo injecteur dans la position de chargement, injecter lentement 100 µL de solution via le port de la cloison.
2. Vérifiez que le programme de collecte de données est défini pour recueillir des données pour 300 s, ce qui permet de suffisamment de temps pour tous les 3 pics à éluer à travers le détecteur.
3. Lorsque vous êtes prêt à commencer le procès, tourner la manivelle d’injecteur au poste inject (qui injecte l’échantillon dans la phase mobile) et cliquez sur « Commencer le procès » sur le programme de collecte de données ordinateur immédiatement. Pour les normes 1-3, seul les trois pics séquentielles apparaissent sur l’écran pendant la course (Figure 1).
4. Une fois 300 s ont passé, la collecte de données envoie une invite à enregistrer le fichier de données. Enregistrer les données sous un nom de fichier approprié (par exemple, STD #1).
5. Remarque la durée en secondes pour le sommet de chaque essai, qui est utilisé pour identifier ce composant.
6. Retirer la seringue de la cloison et répétez le processus pour toutes les normes de travail restant, en utilisant le même temps par le chromatogramme comme déterminé à partir de la première manche.

Figure 1. Le chromatogramme des 3 composants. De gauche à droite, ils sont la caféine, l’aspartame et le benzoate.

6. les échantillons de boissons gazeuses diète

Diet Coke et Pepsi diète Coke Zero sont les « inconnues ». Ils ont été laissés dans des conteneurs ouverts toute la nuit pour se débarrasser de la carbonatation, comme les bulles ne sont pas bonnes pour le système de CLHP. Suffisamment, il se débarrasse de tout le gaz dans les échantillons.

1. Attirer environ 2 mL de soda de la diète dans une seringue en plastique.
2. Fixez l’extrémité du filtre à la seringue par l’intermédiaire de Luer-Lok en le tournant en place.
3. Pousser le liquide dans la seringue à travers le filtre et dans un flacon de verre. Il se débarrasse des particules indésirables qui pourraient potentiellement bloquer la colonne de séparation.
4. Diluer chaque échantillon avec une quantité égale de l’eau distillée, afin qu’ils soient à 50 % de pureté.
5. Injecter 100 µL de l’échantillon dans la boucle d’échantillonnage et exécuter des essais avec les mêmes paramètres que pour les standards.

7. les calculs

1. D’après les concentrations des solutions composant, calculer la concentration de tous les composants dans les normes, basés sur les dilutions qui ont été faites pour les 7 échantillons.
2. Déterminer des pics sur les chromatogrammes pour chaque étalon et les échantillons inconnus par la méthode triangulaire, ce qui équivaut à périodes de hauteur, la largeur à ½ hauteur (Figure 2). Après avoir déterminé quel pic correspond à chaque composant basé sur le temps que nécessaire pour chaque composant montrer leur apogée respectif, entrer dans ces domaines de pointe dans un tableur informatique.
3. Créer des courbes d’étalonnage de la surface du pic vs concentration (mg/L) dans les normes pour chacune des trois composantes.
4. Définir les méthode des moindres carrés pour chaque courbe d’étalonnage.
5. Calculer la concentration de chaque composante dans les boissons gazeuses diète de la montré dans les essais de la CLHP pour les échantillons de surface des pics. N’oubliez pas que le soda diète a été dilué par un facteur de 2 avant l’injection dans le système de CLHP.
6. Calculer la quantité, en mg/L, de chaque composante dans les boissons gazeuses diète.
7. Selon les résultats, calculer la milligrammes de chaque composant dans une canette de 12 onces de soude. Supposons que 12 oz = 354,9 mL.

La figure 2. Un exemple de base d’une courbe hauteur et largeur, qui doivent être multipliés (hauteur du pic fois largeur à ½ de la hauteur).