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Cytogénétique est l’étude de la structure et les propriétés des chromosomes, ainsi que leur comportement pendant la division cellulaire et leur rôle dans l’hérédité. Un chromosome, qui est une molécule d’ADN et les protéines associées, peut-être être observé au microscope à l’aide de sondes et de colorants. Ces observations sont une approche puissante pour la détection des défauts dans la structure des chromosomes et le nombre, qui sont souvent associés à des maladies et des troubles.
Cette vidéo portera sur les principes de la cytogénétique, un protocole pour une technique largement utilisée mettre en évidence les caractéristiques chromosomiques spécifiques, appelées fluorescence in situ hybridation et certaines applications de cette technique.
Commençons par discuter de l’importance de la cytogénétique et les principes qui sous-tendent certaines techniques classiques et modernes dans le domaine.
Cytogénétique implique l’observation directe de la structure des chromosomes de la cellule et numéro, appelé son « caryotype ». Il peut être utilisé pour détecter les écarts par rapport à la normale diploïde ou jumelée, le nombre de chromosomes, qui est appelée aneuploïdie, mais aussi des défauts dans la structure des chromosomes.
Beaucoup de maladies et de troubles résultent d’anomalies chromosomiques. Par exemple, le chromosome de Philadelphie, qui résulte d’une translocation réciproque entre les parties des chromosomes 9 et 22, est associé à la leucémie myéloïde chronique. Un autre exemple est la trisomie 21, la cause la plus fréquente du syndrome de Down, dans lequel une copie supplémentaire du chromosome 21 est héritée.
Caryotypage est habituellement réalisée sur les cellules qui sont apprêtent à diviser, quand leurs chromosomes sont condensés et peuvent être facilement distinguées.
Chromosomes chez un caryotype peuvent être traitées avec des taches qui révèlent des profils de bandes distinctives. Teinté de chromosomes peuvent ensuite être arrangées en taille et la forme pour l’analyse du caryotype. Plusieurs colorants peuvent être appliqués pour mettre en évidence les caractéristiques chromosomiques spécifiques. Coloration au Giemsa ou bandes G, marque des, généralement pauvre en gènes des régions riches en bases A-T. R-le baguage est une coloration de Giemsa inverse qui met en valeur les régions chromosomiques riches en bases G-C. Des bandes C met en valeur les régions chromosomiques plus dense autour du centromère, la structure qui relie les moitiés identiques d’un chromosome dupliqué, tandis que des bandes T met en évidence les extrémités des chromosomes, ou des télomères.
Une autre technique, appelée hybridation de fluorescence in situ ou FISH, permet la détection de chromosomes spécifiques, régions de l’ADN ou l’ARN transcrits. Ceci est réalisé en incubant un échantillon avec sondes oligonucléotidiques très spécifiques qui sont étiquetés fluorescent. Parce que ces sondes peuvent être hybridées aspirée chromosomes dans les cellules non-divisant, poisson peut-être être appliquées plus largement que les méthodes classiques de caryotypage.
Enfin, les chercheurs ont également développé une méthode appelée hybridation génomique comparative à l’écran pour les régions chromosomiques manquantes ou une copie. L’ADN génomique d’un sujet de test et de contrôle sont isolés, fragmenté et étiquetés avec des fluorophores colorés différents. Les préparatifs génomiques fragmentés sont ensuite mélangés et competitivement hybridées à un chromosome normal se propager. Couleurs sur le caryotype qui en résulte indiquent si une région est dupliquée dans la prise d’essai, qui génère plus de fragments pour lier la propagation, ou si la région est supprimée, résultant en une liaison préférentielle pour les fragments de contrôle plus abondantes.
Maintenant que vous comprenez les principes de la cytogénétique, nous allons mettre en pratique et regarder de plus près à l’exécution de poissons.
Tout d’abord, isolées des tissus ou cellules sont traitées avec un fixateur comme la paraformaldéhyde à préserver l’intégrité et la morphologie des chromosomes. Ensuite, un chromosome propagation est préparée, par exemple en perturbant mécaniquement le matériel. Les chromosomes sont ensuite déshydratées dans une série de solution d’augmenter les concentrations d’éthanol et perméabilisées dans une solution de pepsine de rendre les séquences cibles plus accessibles pour les sondes. Chromosomes sont ensuite lavés et stabilisés avec un postfix, dénaturés avec du formamide, afin que l’ADN monocaténaire maintenant peut lier les sondes et déshydratés dans une seconde série de solutions éthanoliques de plus en plus concentré.
Sondes d’ADN marquées fluorescent, très spécifiques sont préparés et mélangés à des fragments d’ADN répétitifs sans étiquette pour bloquer les liaisons non spécifiques. La sonde est ensuite appliquée au chromosome spread, où il s’hybride à sa séquence cible, et la sonde non liée est enlevé avec une série de lavages.
Enfin, les chromosomes sont montés dans un milieu qui préserve l’échantillon et contient un contre-colorant ADN général, telles que DAPI étiquettes l’ADN génomique de fond, qu’un lamelle couvre-objet est appliqué. À ce stade, les échantillons peuvent être observées sous un microscope de fluorescence en utilisant que le filtre approprié définit pour visualiser l’ADN génomique et fonctionnalités spécifiques à la séquence.
Après avoir vu comment les poissons est effectué, nous allons étudier quelques applications de cette technique puissante.
POISSON peut être utilisé pour confirmer que le caryotype d’un embryon est normal avant l’implantation. Ici, une seule cellule, appelée un blastomère, était biopsie d’un embryon de trois jours après la fécondation, puis lysées et fixé directement sur une lame de microscope. La propagation de chromosome a été hybridée puis aux sondes spécialement sélectionnés pour identifier d’éventuelles anomalies chromosomiques. Dans ce cas, écarts par rapport à la configuration attendue des signaux d’hybridation indiquent des perturbations dans la structure ou de nombre de chromosomes.
Techniques novatrices ont également été développés pour étiqueter tous les chromosomes à partir d’un échantillon biologique unique. Une telle méthode implique l’appareil Octochrome, une lame de verre huit-loculaire préchargée avec des sondes fluorescentes. Tous les chromosomes de déterminants non sexuelle 22, appelés autosomes et les chromosomes deux sexuels ont été marqués par leur distribution parmi les huit fenêtres, chacune contenant trois fluorophores spécifiques des chromosomes. Ceci permettait à projection simultanée de tous les chromosomes d’une hybridation unique.
Enfin, plutôt que de séparer les sondes en différentes fenêtres sur une diapositive, tous les chromosomes peuvent être étiquetés et ensuite détecté ensemble en utilisant une approche appelée caryotype spectral ou ciel. Plusieurs sondes spécifiques des chromosomes avec différentes étiquettes fluorescentes ont été hybridées pour chaque chromosome, donnant à chacun une couleur spectrale unique. Des observations simultanées du mélange des chromosomes combinés sont particulièrement utiles pour identifier les anomalies du caryotype et peuvent être utilisées pour identifier l’aneuploïdie ainsi que des destructions chromosomiques et des translocations.
Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE sur cytogénétique. Dans cette vidéo, vous avez appris sur les principes de la cytogénétique, techniques telles que le caryotype et les poissons qui servent à mettre en évidence les caractéristiques chromosomiques spécifiques et les applications de ces techniques. Les progrès récents en cytogénétique ont augmenté leurs capacités dans les laboratoires de recherche et de la pathologie semblables, et ils continueront à trouver une utilisation généralisée à l’avant-garde de la recherche sur les maladies et les diagnostics. Merci de regarder !
