Spectrométrie de masse en tandem

La spectrométrie de masse en tandem relie plusieurs étapes de la spectrométrie de masse pour isoler d’abord une biomolécule, puis déterminer certains aspects de sa composition chimique. Les biomolécules ont des structures grandes et complexes, ce qui rend difficile la détermination de leur composition moléculaire. La spectrométrie de masse en tandem sélectionne une molécule d’intérêt qui est ensuite fragmentée en plusieurs sous-unités, ce qui peut aider à élucider son identification et sa séquence. Cette vidéo montrera les concepts de la spectrométrie de masse en tandem, une procédure générale, et certaines de ses utilisations en biochimie.

La spectrométrie de masse en tandem commence comme un instrument typique de spécification de masse : avec une source d’ions, qui convertit l’échantillon en ions, et un analyseur de masse, qui sépare les ions en fonction de leur rapport masse/charge. Un analyseur de masse commun, le quadripôle, ne laisse passer que les ions ayant un rapport spécifique, tandis que les autres s’écrasent sur les barres de l’appareil. L’espèce autorisée, appelée ion précurseur, est la biomolécule d’intérêt. L’ion se déplace dans une cellule de collision, généralement un autre quadripôle, où de l’énergie est appliquée pour fragmenter l’ion selon un schéma prévisible.

Ces fragments se déplacent dans un autre analyseur de masse, tel qu’un système de temps de vol, qui sépare ces « ions produits ». Les ions produits sont ensuite envoyés au détecteur, comme dans un instrument MS normal. Dans le cas d’une protéine inconnue, le spectre résultant contient de nombreux fragments qui se chevauchent, ce qui rend difficile la génération d’une séquence complète définitive de la biomolécule. Cependant, le motif spectral est unique pour une protéine donnée. Un logiciel d’analyse compare le spectre à une base de données de séquences peptidiques connues, élucidant la protéine inconnue à partir des fragments qui se chevauchent.

En fonction de l’échantillon et du degré de fragmentation souhaité, plusieurs méthodes de fragmentation sont possibles. Les modèles de fragmentation dépendent de la façon dont l’énergie est transférée, de sa quantité et de la façon dont elle est distribuée par l’ion précurseur. L’énergie peut être transférée via des particules neutres, des radiations ou des électrons. L’utilisation d’atomes neutres, un processus appelé dissociation induite par collision ou CID, clive principalement la liaison peptidique entre les acides aminés, idéale pour leur identification.

Maintenant que les bases de la technique ont été couvertes, examinons la spectrométrie de masse en tandem CID utilisée pour étudier un composant des enveloppes cellulaires bactériennes.

Comme pour toutes les expériences de spectrométrie de masse, la première étape consiste à ioniser l’échantillon. Pour les biomolécules, cela se fait généralement par désorption laser assistée par matrice ou ionisation par électronébulisation. Le signal ionique précurseur est ensuite optimisé par le réglage de l’optique ionique. Une fois cela fait, la cible est isolée et la méthode de fragmentation est choisie, comme le CID.

L’intensité d’une tension appliquée, qui accélère l’ion précurseur dans la cellule de collision, affecte le degré de fragmentation. Cette tension est augmentée jusqu’à ce que le précurseur ait une abondance d’environ 10 % par rapport à l’ion de production le plus élevé. Plusieurs spectres sont acquis et moyennés jusqu’à ce qu’un rapport signal/bruit suffisant soit atteint. Le nombre de balayages nécessaires dépend de l’intensité du signal de l’ion précurseur d’origine et peut varier de 3 à 300.

L’analyte de cet exemple, le lipide A d’Escherichia coli K-12, comportait 19 fragments principaux après CID. La structure générale du lipide A est bien connue, ce qui permet aux logiciels de reconstruire la composition spécifique de l’échantillon.

Maintenant que nous avons examiné la procédure, examinons certaines des façons dont la spectrométrie de masse en tandem est utilisée en biochimie.

Un mode de balayage courant en spectrométrie de masse en tandem est la surveillance de réaction sélectionnée, ou SRM. Dans le SRM, les deux analyseurs de masse sont fixés à un rapport masse/charge sélectionné, en se concentrant sur des précurseurs et des ions produits spécifiques. En raison du haut degré de sensibilité du SRM, les spectres des étalons peptidiques de concentration connue peuvent être utilisés et comparés à ceux des échantillons inconnus, ce qui permet de quantifier les protéines d’intérêt.

Les protéines sont généralement modifiées après la traduction, généralement par l’ajout de groupes fonctionnels tels que les groupes méthyle, les groupes phosphate ou les sucres, connus sous le nom de glycanes. Ceux-ci sont importants dans les processus de signalisation cellulaire, élucidant comment les cellules communiquent entre elles. Étant donné que la spectrométrie de masse en tandem fragmente les protéines en composants plus petits, il est possible de déterminer l’emplacement du PTM par rapport au fragment spécifique ou même à un acide aminé. Certaines modifications, telles que l’acétylation et la triméthylation, sont difficiles à différencier par la masse seule, de sorte que la séparation chromatographique est effectuée avant la spectrométrie de masse.

De nombreux analytes dans le sang du patient se trouvent à des concentrations inférieures à la limite de détection pour la spectrométrie de masse typique. Un autre avantage de la SRM est qu’elle élimine tous les ions produits sauf un, ce qui augmente la sensibilité et augmente la limite de détection inférieure jusqu’à 100 fois. Dans cet exemple, le médicament immunosuppresseur, le tacrolimus, a pu être détecté à des concentrations de 1 ng/mL.

Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur la spectrométrie de masse en tandem. Cette vidéo décrivait la théorie de l’instrument, passait en revue une procédure générale et expliquait certaines des façons dont la technique est actuellement utilisée. Merci d’avoir regardé !