Monitoring plantenhormonen tijdens stress Reacties

Summary

Een eenvoudige methode is voorzien die het mogelijk maakt voor de snelle extractie en analyse van veelvoudige plantaardige hormonen uit kleine weefselmonsters. De procedure maakt gebruik van dampfase extractie als de plechtige zuiveringsstap. Monsters worden geanalyseerd door GC / MS met chemische ionisatie, die voornamelijk produceert (M +1) + ionen.

Abstract

Plantenhormonen en verwante verbindingen signalering speelt een belangrijke rol in de regulatie van plant reacties op de verschillende prikkels uit de omgeving en benadrukt. Een van de meest ernstige spanningen insecten herbivorie, pathogeen infectie, en droogte stress. Voor elk van deze spanningen een specifieke set van hormonen en / of combinaties daarvan is bekend dat fine-tunen van de reacties, waarbij het waarborgen van de plant overleven. De belangrijkste hormonen die betrokken zijn bij de regulering van deze reacties zijn jasmonzuur (JA), salicylzuur (SA), en abscisinezuur (ABA). Om beter inzicht in de rol van de individuele hormonen, alsook hun mogelijke interactie tijdens deze reacties is het noodzakelijk om veranderingen in hun overvloed in een temporele als in een ruimtelijke manier te controleren. Voor de eenvoudige, gevoelige en reproduceerbare kwantificering van deze en andere signalisatie compounds ontwikkelden we een methode gebaseerd op de damp-fase-extractie en gaschromatografie / massaspectrometrie (GC / MS) analyse (1, 2, 3, 4). Na het extraheren van deze stoffen uit de plant weefsel door zure waterige 1-propanol gemengd met dichloormethaan het carbonzuur-bevattende verbindingen zijn gemethyleerd, vervluchtigd onder hitte, en verzameld op een polymeer absorberend. Na elutie in een monsterflesje de analyten worden gescheiden door middel van gaschromatografie en gedetecteerd door chemische ionisatie massaspectrometrie. Het gebruik van de juiste interne normen kan vervolgens om de eenvoudige kwantificering van de in verband piekoppervlakten van analyt en de interne standaard.

Protocol

1. Moeten we eerst de 2 ml schroefdop flesjes voor te bereiden op extractie: Voeg 400ul extractiebuffer (1-propanol: H2O: geconcentreerde HCl 2:1:0.002 vol / vol / vol) en 10 ul van de respectievelijke interne standaard (10ng/μl ) om een ​​flesje. Freeze in vloeibare stikstof en voeg dan de keramische kralen.
2. Voeg de plantmateriaal (tussen 50 en 200 mg), terwijl de injectieflacons zijn nog steeds geplaatst in de vloeibare stikstof. Merk op dat het gewicht van de toegevoegde plantaardig materiaal moet geschat worden voor verdere verwerking naar later toe voor de exacte kwantificering, die is gebaseerd op de verse gewicht.
3. Zorg ervoor dat alle vloeibare stikstof is verdampt voordat stevig sluiten van de flacon met een dop. Merk op dat de dop dient te beschikken over een rubberen afdichting om morsen van oplosmiddelen en dus onttrokken verbindingen te voorkomen tijdens de homogenisering.
4. Homogeniseren het weefsel in een FastPrep of Precellys kraal grinder homogenisator met een snelheid van 6000 (voor Precellys) gedurende 30 sec.
5. Verwijder de flacons uit homogenisator individueel, voorzichtig de dop en voeg 1 ml dichloormethaan aan elk monster. Sluit flacons weer strak en homogeniseren weer voor 10-15sec in 6000 (Precellys).
6. Overdracht flacons met een tafelblad centrifuge en scheiden de organische fase van de waterige fase bij 10.000xg voor 60sec.
7. Na de scheiding van de fasen overdracht van de onderste groene laag (organische fase, bevat de hormonen en de interne standaarden) van individuele flacons op een schoon 4ml glazen flacon. Voorkomen dat de overbrenging van water (bovenste fase). Als alternatief kan ethylacetaat in plaats van dichloormethaan worden gebruikt. In dat geval zal de ethyacetate fase zal de bovenste laag (groen) worden en is nu makkelijker te verwijderen en overgebracht naar een verse 4ml glazen flacon. Net als voorheen, vermijd de overbrenging van water.
8. Blaas het oplosmiddel af met lucht door middel van een verzamelleiding voor ongeveer 10-25 minuten (afhankelijk van de steekproef), controleren met een luchtstroom tip indien uit de monsters droog zijn (voorzichtig). Niet Kreukherstellend monsters, kan oorzaak voor dit verlies van verbindingen.
9. Zodra de monsters worden gedroogd kunnen we beginnen met de methylering van het carbonzuur-bevattende verbindingen in onze monsters. Eerst worden 100 ul van een diethyether / methanol mengsel (09:01 vol / vol) toegevoegd aan elke flacon, gevolgd door 4μl van een 2M trimethylsilyldiazomethane oplossing (in hexaan, Sigma Aldrich). Flacons zijn direct afgesloten met een open-top schroefdop voorzien van een Teflon beklede siliconen septum. Schud voorzichtig en incuberen bij RT voor 25 tot 30 minuten.
10. Na het afronden van stap 9, zet op een verwarmings-blok en ingesteld op de gewenste collectie temperatuur. De volatiliteit van de gemethyleerde verbindingen is afhankelijk van hun grootte, maar ook op andere, meer polaire groepen zoals = O,-OH, en-NH. Voor jasmonzuur en salicylzuur methylesters een verzameling temperaturen van rond de 80 ° C voldoende, terwijl voor bijvoorbeeld andere verbindingen zoals C18-vetzuren, jasmonzuur-aminozuur conjugaten, coronatine, en 12-oxo-phytodienoic acid methyl ester nodig temperatuur tussen 180-200 ° C om effectief te vervluchtigen.
11. Na een 30min incubatie van de methylatie reactie moet worden gestopt om ongewenste secundaire reactie te vermijden. Dit wordt gedaan door het toevoegen van 4 pi van een 2M azijnzuur-oplossing (in hexaan) aan elke flacon. Na het sluiten van de flesjes met dopjes en een korte vortexen, worden de monsters mogen incuberen voor een andere 30min.
12. De filters worden gebruikt voor deze damp-fase-extractie zijn handgemaakt en in de gepresenteerde vorm niet commercieel beschikbaar. Ze bestaan ​​uit een buitenste Teflon buis (ongeveer 7-8cm lang), waarin de ene kant een goed passende glazen buis van ongeveer 4cm lengte is geplaatst. Aan de andere kant van de Teflon buis een roestvrij stalen schijf wordt gedrukt in de buis tot aan de binnenste glazen buis en op dat ongeveer 20-30mg van adsorbens (hetzij SuperQ 80/100 (uit) of HayeSep ® Q80/100) worden toegevoegd. Nog een roestvrij stalen gaas schijf is geplaatst en tot slot een glas tip is duwt in de teflon buis, waardoor zorgvuldig te drukken op de roestvrij stalen gaas schijf op de absorberende. Een gedetailleerd beeld van een filter is weergegeven in figuur 1.
    
    Figuur 1.
13. Tijdens de incubatietijd van stap 11, de filters voor het verzamelen van de gemethyleerde en dus, vluchtige plantaardige hormonen, moeten worden gewassen het gebruik van eerste 200ul van methanol, en vervolgens 2 wassen met 200ul dichloormethaan elk. Oplosmiddel nog in de filters wordt dan weggeblazen door de lucht. De filters kan nu worden gebruikt voor de vangst van vluchtige hormonen door de damp-phase extractie.
14. Na 30min van incubatie de rubber septa van de 4ml afwipdopjes worden gesneden met een scalpel. Naar de fabriek hormonen te verzamelen door damp-fase-extractie de gereinigde filters zijn aangesloten op de individuele vacuüm lijnen met een debiet van ongeveer 800ml/min. De filters worden vervolgens ingebracht in de injectieflacon door het snijden septa. Een kleine pipet tip is ook opgenomen om te fungeren als een luchtinlaat. Tijdens dit eerste deel van de procedure de flesjes met de geplaatste filters moeten worden gehoudenin een rechtopstaande positie op een van de vloeistof in de flacon te vermijden om in contact te komen met de filtertip, die vervuilen het filter en vervolgens ook de GC / MS. De flesjes worden vervolgens in handen van de hand totdat alle vloeistof is verdampt door het filter. Dan is de flacons met de bijbehorende filters zijn geplaatst op de verwarmings-blok en warmte-verdampt verbindingen verzameld voor 3 minuten. Het principe componenten van het systeem en de setup zijn afgebeeld in figuur 1. Na deze laatste damp-fase-extractie stap van de flacons met de filters nog aan worden geplaatst op een rek en laten afkoelen.
15. Wanneer de filters hebben op kamertemperatuur weer bereikt zijn ze geëlueerd met 150 ml dichloormethaan in een 1,5 ml GC-flacon voorzien van een insert. Alter uitblazen van het resterende oplosmiddel van het filter de flacons zijn afgedekt en geanalyseerd met behulp van GC / MS.

Een gaschromatograaf uitgerust met een split / splitless injector (splitless mode 250 ° C, injectie volume 1μ), gekoppeld aan een massaspectrometer gebruikt in de chemische ionisatie mode (CI) moet worden gebruikt voor de analyse). Verbindingen zijn gescheiden op HP-1MS kolom (30 x 0,25 mm x 025μm) gehouden op 40 ° C voor 1 minuut na de injectie, en dan de temperatuur geprogrammeerd bij 15 ° C / min tot 250 ° C (10min), met helium als de vervoerder gas (constante stroom 0.7ml/min). Voor de MS-analyse zowel een quadropole (bijv. Agilent HP5973) en een ion trap-op basis van (bijv. Varian Saturnus 2200) massaspectrometer kan worden gebruikt. Als een CI gas ofwel isobutaan (komt in gas-tanks) of methanol (dampen van een vloeistof reservoir worden gebruikt) kan gebruikt worden, maar in elk geval de fragmenten van de ionisatie reactie dient te worden gecontroleerd voordat de selected ion count (SIC) programma's worden gemaakt. Wij hebben gebruik gemaakt van de volgende programma voor een Varian GC 3900/Saturn MS 2200 systeem en methanol als de CI reagens: 5.00-11.30min ionen (M +1) ⁺ 153-158 (methylsalicylaat 153, ^methyl-2 H _{5-salicylaat);} 11.30-13.30min ionen (M +1) ⁺ 207 tot 228 (methyljasmonaat 207 en 225, methyl dihydrojasmonate 209 en 227), 13.30-16.30min ionen (M +1) ⁺ 237 tot 300 (methyl abscisinezuur 261, ^methyl-2 H _{6-abscisinezuur} 267 (abscisinezuur produceert voornamelijk [MH ₂ O +1] ⁺ ionen). Alle verbindingen moeten worden vastgesteld door vergelijking met authentieke commercieel verkrijgbare standaarden. Kwantificering van JA, SA, en ABA wordt gedaan door correleren het piekoppervlak (geëxtraheerd ionen) met de piek gebied (gewonnen ionen) van de respectieve interne standaard en is tevens gebaseerd op het verse gewicht van het gebruikte plantmateriaal.

Discussion

De methode die hier is bewezen betrouwbaar te werken voor een breed scala van planten signaleren stoffen op voorwaarde dat de grootte en de chemische aard van de verbinding niet te voorkomen dat deze uitgepakt, gemethyleerd, en verdampt. Ook de methylering procedure zoals het hier is beschreven is niet de enige manier van derivatisering. Silyllation en acetylering zijn alternatieve methoden en protocollen kunnen eenvoudig online te vinden.

Als de massa spectrometer is niet in staat om enkele ionen de massa bereik dat is opgenomen tijdens een run moet worden beperkt tot te veel ongewenste ionen uit te sluiten van het proces. Bijvoorbeeld, jasmonzuur (JA) en de interne standaard dihydro jasmonzuur (dhJA) produceren twee belangrijke (M +1) ⁺ ionen, 207 en 225 voor JA, en 209 en 227 voor dhJA tijdens chemische ionisatie met methanol. Omdat deze twee belangrijke (M +1) ⁺ massa's (207 en 225 voor JA, 209 en 227 voor dhJA) hebben niet dezelfde overvloed rationfor JA en dhJA, moeten ze beiden worden geëxtraheerd en worden gebruikt voor kwantificering. Daarom moet een massa-range 207 tot 228 worden vastgelegd en de specifieke ionen moeten later worden geëxtraheerd.