Övervakning växt hormoner under stressreaktioner

Summary

En enkel metod finns som möjliggör för snabb extraktion och analys av flera växt hormoner från små vävnadsprover. Förfarandet använder ångfasen extraktion som det högtidliga reningssteget. Proverna analyseras med GC / MS med kemisk jonisering som producerar huvudsakligen (M 1) + joner.

Abstract

Plantera hormoner och liknande signalering föreningar spelar en viktig roll i regleringen av anläggningen reaktioner på olika stimuli från omgivningen och påfrestningar. Bland de mest svåra påfrestningar är insekt herbivori, patogener infektion, och torka stress. För varje av dessa betonar en specifik uppsättning av hormoner och / eller kombinationer av dessa är kända för att finjustera svaren, varigenom växtens överlevnad. De stora hormoner involverade i regleringen av dessa svar är jasmonic syra (JA), salicylsyra (SA) och Abscisic syra (ABA). För att bättre förstå vilken roll enskilda hormoner samt deras potentiella samspel under dessa svar är det nödvändigt att övervaka förändringar i överflöd i ett tidsmässigt och i en rumslig sätt. För lätt, känslig och reproducerbar kvantifiering av dessa och andra signalering föreningar vi utvecklat en metod baserad på ångfasen utvinning och gaskromatografi / masspektrometri (GC / MS) analys (1, 2, 3, 4). Efter att utvinna dessa ämnen ur växtvävnad av sura vattenlösningar 1-propanol blandas med diklormetan till karboxylsyra-innehållande föreningar är denaturerad, förflyktigas under värme, och samlas på ett polymert absorberande. Efter eluering i ett prov flaskan analyter separeras med hjälp av gaskromatografi och detekteras med kemisk jonisering masspektrometri. Användning av lämpliga interna standarder tillåter sedan av den enkla kvantifiering genom att relatera toppareorna av analyt och intern standard.

Protocol

1. Först måste vi förbereda 2ml skruvkork injektionsflaskor för utvinning: Lägg 400ul extraktionsbuffert (1-propanol: H2O: koncentrerad HCl 2:1:0.002 vol / vol / vol) och 10 l respektive intern standard (10ng/μl ) till en flaska. Frys i flytande kväve och sedan lägga den keramiska pärlor.
2. Tillsätt växtmaterial (mellan 50 och 200 mg), medan injektionsflaskor är fortfarande placerad i flytande kväve. Notera att vikt läggs växtmaterial måste uppskattas innan ytterligare behandling för att möjliggöra senare för exakt kvantifiering, som är baserad på den färska vikten.
3. Se till att alla flytande kväve förångas innan tättslutande flaskan med en kapsyl. Observera att locket måste ha en gummitätning för att förhindra utsläpp av lösningsmedel och därmed utvunnits under homogenisering.
4. Homogenisera vävnaden i ett FastPrep eller Precellys pärla kvarn homogeniseringsblandare i en hastighet av 6000 (för Precellys) för 30 sek.
5. Ta bort rören från homogeniseringsblandare individuellt, öppna försiktigt locket och tillsätt 1 ml diklormetan till varje prov. Stäng flaskorna igen ordentligt och homogenisera igen för 10-15sec på 6000 (Precellys).
6. Överför injektionsflaskor som en bordsskiva centrifug och separera den organiska fasen från vattenfasen vid 10.000xg för 60 sekunder.
7. Efter fasseparering överföra den nedre gröna skiktet (organiska fasen innehåller hormoner och interna standarder) från enskilda flaskor till en ren 4 ml glasflaska. Undvik transport av vatten (övre fas). Alternativt kan etylacetat användas i stället för diklormetan. I så fall ethyacetate fasen kommer att det övre lagret (grön) och är nu lättare att ta bort och överförs till en ny 4 ml glasflaska. Liksom tidigare undvika överföring av vatten.
8. Blås bort lösningsmedlet med luft via ett grenrör i ca 10-25 min (beroende på prov), kolla med en enda luftflöde tips om prover är torra (försiktigt). Låt inte strykfria prover, kan detta leda till förluster av föreningar.
9. När proverna torkas vi kan starta metylering av karboxylsyra som innehåller ämnen i våra prover. Först är 100 l av en diethyether / metanolblandning (09:01 vol / vol) till varje flaska följt av 4μl en 2M trimethylsilyldiazomethane lösning (i hexan, Sigma Aldrich). Flaskorna är omedelbart försluts med en öppen topp skruvlock försedda med en Teflon-fodrad silikon septum. Skaka försiktigt och inkubera vid RT 25 till 30min.
10. Efter avslutad steg 9, slå på en värmeblock och ställ in på önskad samlingen temperatur. Volatiliteten i metylerade föreningar beror på deras storlek, utan även på andra, mer polära grupper som = O,-OH och-NH. För jasmonic och salicylsyra metylestrar en samling temperaturer runt 80 ° C är tillräckliga, medan till exempel andra föreningar som C18 fettsyror, jasmonic syra-aminosyra konjugat, coronatine, och 12-oxo-phytodienoic metylestern kräver temperatur mellan 180-200 ° C för att effektivt förångas.
11. Efter en 30min inkubation metylering reaktionen måste stoppas för att undvika oönskade sekundär reaktion. Detta görs genom att lägga till 4 ìl av en 2M ättiksyra-lösning (i hexan) till varje flaska. När du har stängt flaskorna med lock och en kort vortexa, är de prover som fått inkubera i en annan 30min.
12. Filtren används för detta ångfasen extraktion är handgjorda och i denna form inte är kommersiellt tillgänglig. De består av en yttre teflon röret (ca 7-8cm lång), där från den ena sidan en välsittande glasrör på ca 4cm längd är isatt. På andra sidan av teflon röret ett nät av rostfritt stål skivan trycks inuti röret tills den når det inre glasröret och på att ca 20-30mg av adsorbent (antingen SuperQ 80/100 (utgångna) eller HayeSep ® Q80/100) läggs till. En annan nät av rostfritt stål skiva och slutligen ett glas tips är skjuter in i teflon röret, vilket försiktigt trycka den rostfria skivan stålnät på absorberande. En detaljerad bild ett filter visas i figur 1.
    
    Figur 1.
13. Under inkubationstiden för steg 11, filter för uppsamling av den metylerade och därmed flyktiga växt hormoner, måste tvättas med första 200ul av metanol, och sedan 2 tvättar med 200ul diklormetan vardera. Lösningsmedel kvar i filter sedan blåses bort med flyg. Filtren kan nu användas för att fånga flyktiga hormoner genom ångfasen extraktion.
14. Efter 30min av inkubationen gummi septa i 4 ml flaskan lock skärs med en skalpell. Att samla in växten hormoner genom gasfasen extraktion den rengjorda filter är anslutna till enskilda vakuum linjer med en flödeshastighet på ca 800ml/min. Filtren är sedan in i flaskan genom snittet septa. En liten pipettspetsen är också införas för att fungera som ett luftintag. Under denna inledande del av förfarandet rören med isatt filter måste hållasi upprätt läge för att undvika att något av vätskan inuti flaskan för att komma i kontakt med filtret spetsen, som skulle förorena filtret och därefter även GC / MS. Injektionsflaskorna är dess haft hand tills all vätska har avdunstat genom filtret. Sedan rören med bifogade filter placeras på värmeblocket och värme-avdunstat föreningar samlas in för 3min. Principen komponenterna i systemet samt installationen avbildas i figur 1. Efter denna sista ångfasen extraktionen rören med filter fortfarande sitter placeras på ett galler och får svalna.
15. När filtren har uppnått rumstemperatur igen de är elueras med 150ml av diklormetan i en 1,5 ml GC-flaskan förses med en insats. Alter blåser ut den återstående vätskan från filtret flaskorna är täckta och analyseras med GC / MS.

En gaskromatograf utrustad med en split / splitless injektor (splitless läge 250 ° C, injektionsvolym 1μ) gränssnitt till en masspektrometer används i kemisk jonisering läge (CI) bör användas för analys). Föreningar skiljs på HP-1ms kolumn (30m x 0,25 x 025μm), som hölls vid 40 ° C under 1 min efter injektion och sedan temperatur programmeras vid 15 ° C / min till 250 ° C (för 10min), med helium som bärare gas (konstant flöde 0.7ml/min). För MS-analys båda quadropole (t.ex. Agilent HP5973) och en jonfälla-baserade (t.ex. Varian Saturn 2200) masspektrometer en kan användas. Som ett CI gas antingen isobutan (kommer i gastankar) eller metanol (ångor från en vätska reservoar används) kan använda, men i varje enskilt fall fragment av jonisering reaktionen bör kontrolleras innan det valda jon räknare (SIC) program skapas. Vi har använt följande program för en Varian GC 3900/Saturn MS-2200 systemet och metanol som CI reagens: 5,00-11.30min joner (M 1) ⁺ 153-158 (metyl salicylat 153, ^metyl-2 H _{5-salicylat);} 11,30-13.30min joner (M 1) ⁺ 207-228 (metyl jasmonate 207 och 225, metyl dihydrojasmonate 209 och 227), 13,30-16.30min joner (M 1) ⁺ 237-300 (metyl Abscisic syra 261, ^metyl-2 H _6-Abscisic sura 267 (Abscisic syra producerar främst [MH ₂ O 1] ⁺ joner). Alla föreningar bör identifieras genom jämförelse med autentiska kommersiellt tillgängliga standarder. Kvantifiering av JA, SA, och ABA görs genom att korrelera den topp som (extraherat joner) med toppytan (extraherat joner) av respektive intern standard och är också baserad på färskvikt av det använda växtmaterial.

Discussion

Den metod som presenteras här har visat sig fungera tillförlitligt för ett brett spektrum av växter signalering föreningar förutsatt att storleken och den kemiska beskaffenheten hos förening inte förhindra att den utvinns, denaturerad och förgasas. Dessutom är metylering förfarande som det beskrivs här inte det enda sättet att derivatisering. Silyllation och acetylering är alternativa metoder och protokoll kan vara lätt att hitta på nätet.

Om masspektrometer inte kan enstaka jon övervaka massan sortiment som spelas in under en körning bör begränsas att utesluta alltför många oönskade joner från processen. Till exempel jasmonic syra (JA) och dess interna standarden dihydro jasmonic syra (dhJA) producerar två stora (M 1) ⁺ joner, 207 och 225 för JA, och 209 och 227 för dhJA vid kemisk jonisering med metanol. Eftersom dessa två stora (M 1) ⁺ massor (207 och 225 för JA, 209 och 227 för dhJA) inte har samma överflöd rationfor JA och dhJA bör de båda extraheras och användas för kvantifiering. Därför bör en massa olika 207 till 228 spelas in och de specifika joner ska extraheras senare.