Article de méthode

La libération de dopamine au niveau individuel terminaisons présynaptiques visualisées avec FFNs

DOI :

10.3791/1562

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31 août 2009

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1Departments of Neurology, Columbia University, 2Departments of Psychiatry and Pharmacology, Columbia University, 3Department of Chemistry, Columbia University, 4eMolecules, Inc., 5Departments of Neurology and Physiology, University of California School of Medicine, San Francisco, 6Division of Molecular Therapeutics, New York Psychiatric Institute

Dans cet article

Résumé

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Un nouveau moyen de mesurer la neurotransmission dopaminergique optiquement en utilisant des analogues fluorescents.

Résumé

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Le système nerveux transmet des signaux entre les neurones via la libération de neurotransmetteurs lors de la fusion des vésicules synaptiques. Pour observer l'absorption et la libération de neurotransmetteurs différents terminaux présynaptiques directement, nous avons conçu fluorescentes faux neurotransmetteurs comme substrats pour le transporteur de vésicules synaptiques inhibiteurs de la monoamine. L'utilisation de ces sondes pour la libération de dopamine dans le striatum l'image, nous avons fait plusieurs observations pertinentes à la plasticité synaptique. Nous avons constaté que la fraction de vésicules synaptiques libérant des neurotransmetteurs par stimulus était dépendante de la fréquence de stimulation. Une cinétique distincte «réserve» de la population de vésicules synaptiques n'a pas été observé dans ces conditions expérimentales. Une hétérogénéité dépendant de la fréquence des terminaisons présynaptiques a été révélé que dépendait en partie sur les récepteurs dopaminergiques D2, indiquant un mécanisme de dépendant de la fréquence de codage de la sélection présynaptique.

Hui Zhang et Niko G. gubernator contribué également à ce travail.

Protocole

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Cette méthode a été utilisée dans la recherche présentée dans gubernator et al., Science 324 (5933). 1441-1444 (2009) .

1. Préparation des tranches striatales aiguë

  1. Avant de préparer aiguë tranches striatales, il faut oxygéner le liquide céphalo-rachidien artificiel (FCSA) et le refroidir avec de la glace pendant au moins 15 minutes avant l'extraction du cerveau. Gardez le froid de la glace ACSF et oxygéné pendant la dissection. ACSF (en mM): NaCl 125, KCl 2,5, NaHCO 3 26, CaCl 2 2,4, MgSO4 1,3, KH 2 PO 4 0,3, glucose 10, HEPES 5; pH 7.3 à 7.4, 290-295 mOsm.
  2. Décapitez souris mâle sans anesthésie.
  3. Extrait de l'ensemble du cerveau de la souris, et le monter sur le plateau vibratome mis sur le vibratome utilisant Krazy Glue ®. L'extraction du cerveau et de montage doit être fait dans les 2 minutes. Pendant ce temps, veillez à conserver le froid de la glace ACSF et oxygénée pour garder le tissu sain.
  4. Couper des tranches de cerveau coronale striatum à une épaisseur de 250μm entre bregma 1.54 à 0.62 1. Trois tranches entières seront obtenus qui peuvent ensuite être coupée en 6 tranches moitié avec une aiguille.
  5. Incuber les coupes de cerveau de l'ACSF oxygénée à température ambiante pendant au moins 1 heure avant le chargement de la sonde. Tranches d'affichage bonne FFN511 chargement et rester actifs pour l'imagerie jusqu'à 4 heures après la préparation tranche.

2. Chargement FFN511

  1. Préparer FFN511 solution de chargement (10 uM FFN511 dans ACSF); également préparer 100 microns ADVASEP-7 dans l'ACSF. Toutes les solutions doivent être fraîchement préparés et oxygéné au moins 15 minutes avant le chargement dans les tranches.
  2. Individuellement incuber tranche avec FFN511 solution de chargement pendant 30 minutes à température ambiante.
  3. Retirez ensuite le colorant liée au tissu extracellulaire en incubant la tranche chargé dans oxygénée 100 microns ADVASEP-7 ACSF pendant 30 minutes à température ambiante 2. Les tranches sont maintenant prêts pour l'imagerie.

3. Imagerie FFN511 dans les tranches de cerveau

L'imagerie de FFN511 dans les tranches est réalisée en utilisant un microscope laser multiphotonique à balayage. Nous utilisons un Prairies Ultima multiphotonique microscope à balayage laser (Nous étions en utilisant un Zeiss LSM 510 NLO multiphotonique microscope à balayage laser, préalablement et certains résultats ont été obtenus avec le microscope Zeiss).

  1. Placez la tranche FFN511-chargés dans la chambre d'enregistrement (RC-27L, Warner) et superfuse avec ACSF oxygénée à un débit de 1-2 ml par minute. Ensuite, placez une harpe de platine avec des cordes en nylon sur le dessus de la tranche afin de minimiser le mouvement pendant l'expérience. Pour réduire davantage le mouvement, permettre à la tranche de se stabiliser pendant au moins 10 minutes dans la chambre avant de l'imagerie.
  2. Visualisez et repérez le striatum dorsal avec la luminescence champ lumineux sous un objectif à immersion d'eau 10x.
  3. Place et la position des électrodes bipolaires de tungstène tordus dans cette région, si l'exécution d'une expérience de stimulation. La zone d'imagerie idéale se situe à moins de 300 um entre les deux extrémités de l'électrode bipolaire de stimulation. Placez cette région au centre du champ visuel.
  4. Image FFN511 marqué terminaux striatum sous un 63x (0,9 NA) L'objectif ultraviolets immersion dans l'eau. FFN511 est excité à 760 nm avec un laser Mai Tai de la physique et la fluorescence spectrale optimale des terminaux striatum est vu à travers un filtre passe-bande (480-520 nm). Les images sont capturées en 12 bits avec le format 75 x 75 um régions d'intérêt à la résolution 512 x 512 pixels. Pour stimuler les expériences de décoloration, pour compenser l'axe z décalage, un z-série d'images 5-7, séparés par une um dans le plan z, est obtenue pour chaque période de temps.

4. FFN511 décoloration

L'étiquette peut être FFN511 décolorés, soit par une forte concentration de KCl (nous utilisons 70 mM de KCl), (+)-amphétamine sulfate (AMPH, 20 uM), ou la stimulation électrique. Dans l'expérience de décoloration de KCl, quand une solution de potassium haute ACSF est appliqué à la tranche de cerveau, le FFN511 destains l'étiquette dans les 2 minutes. Enregistrement xyz-t images pour suivre FFN511 décoloration au fil du temps. La section suivante décrit la stimulation électrique dépendant de la dopamine décoloration terminale:

  1. Pour suivre FFN511 décoloration au fil du temps, xyz-t images sont enregistrées. Afin de garantir un minimum de mouvement de la tranche (moins de 4 um de l'axe z) et aucun photoblanchiment par les images laser de contrôle, des séries chronologiques de la Z-stack doit être obtenu au moins 5 minutes avant la stimulation. Sinon, ajuster la puissance du laser.
  2. Suite à ces images de contrôle, de continuer l'imagerie xyz-t tandis commencer la stimulation à des fréquences de 1, 4 ou 20 Hz. Les stimuli à 1, 4 ou 20 Hz (300 ms x 1 mA) sont appliquées dans le striatum localement par un isolateur de relance Iso-Flex déclenchée par un maître-8 générateur d'impulsions (AMPI, Jérusalem, Israël) en utilisant des électrodes bipolaires. Afin de minimiserla variation de la dépolarisation des sites de libération, nous avons utilisé un protocole de stimulation appliquant 150% de l'intensité de stimulation maximale déterminée par voltampérométrie cyclique.
  3. Utilisez un logiciel approprié pour l'analyse d'imagerie. Dans notre laboratoire, nous utilisons l'image J (Wayne Rosband, National Institutes of Health, Rockville, MD) et personnalisée écrite logiciels en IDL (Research Systems, Boulder, CO) afin de quantifier la fluorescence lacrymaux et les changements avec temps3.

Résultats Represenative

La figure 1 montre le chargement dans FFN511 tranche striatum est maintenant terminée. Images représentant l'aide de l'objectif 10x et 60x sont présentés dans la Fig.1. Le marquage sélectif des terminaux de dopamine peut être décolorés par 20 uM amphétamines.
La figure 2 montre décoloration des FFN511 étiquetage par le KCl élevé.
La figure 3 montre décoloration des FFN511 étiquetage par stimulation électrique locale.

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Figure 1 FFN511 étiquettes terminaux de dopamine dans vivons cortico-striatale tranches aiguë (A) dans l'étiquetage par FFN511 aiguë direct cortico-striatale tranche:.. Étiquetage abondant dans le striatum (STR), l'étiquetage clairsemés dans le cortex (CTX), et aucune étiquette corps calleux (CC). Barre d'échelle: 100. Um (B) Décoloration des FFN511 du striatum par l'amphétamine. Panneaux gauche: avant d'amphétamines; panneaux à droite: après 20 minutes de 20 uM amphétamines. Barre d'échelle: 10 um.

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Figure 2. Décoloration des FFN511 étiquetage par le KCl élevé. Étiquetage FFN511 est décolorée dans les 2 min d'application de 70 mM de KCl dans l'ACSF. Barre d'échelle: 10 microns.

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Figure 3. Fonction de la fréquence de décoloration des FFN511 étiquetage dans le striatum. (A) la stimulation locale à 4 Hz entraîné décoloration des bornes. La stimulation a commencé à t = 0. Barre d'échelle: 5 um (B) Décoloration des FFN511 à 4 Hz est Ca 2 + - et dépendant de la fréquence.. Contrôles reçu aucune stimulation (153 points lacrymaux de 3 tranches). Décoloration avec du chlorure de cadmium (200 uM) était identique à des contrôles non stimulées (475 points lacrymaux de 5 tranches). Les courbes de décoloration pour chaque fréquence de stimulation ont été ajustées par une fonction de décroissance exponentielle simple et demi-vie (t 1 / 2) Les valeurs calculées comme τ x 0,693 (1 Hz: 765 points lacrymaux, de 9 tranches, 4 Hz: 410 points lacrymaux de 7 tranches, 20 Hz: 416 points lacrymaux de 6 tranches). S'il vous plaît se référer à la micrographie vidéo à partir de 2-microscopie biphotonique des FFN511 décoloration lors de l'exocytose dans une préparation de tranches de cerveau du striatum.

Discussion

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Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode pour visualiser la neurotransmission dopaminergique optiquement en utilisant des analogues fluorescents. FFN511 est la première génération de FFNs nous avons développé. Bien qu'il ait été conçue en ciblant les neurones du transporteur vésiculaire monoamine (VMAT2) qui transporte les neurotransmetteurs inhibiteurs de la monoamine du cytoplasme dans des vésicules synaptiques, et les labels spécifiquement terminaux de dopamine dans le striatum et les catécholamines présumée et / ou les terminaux de la sérotonine dans le cortex (comme indiqué dans la science papier), une période de chargement appropriée est essentielle pour la spécificité puisque FFN511 est relativement hydrophobe. Nous avons constaté que d'incubation de plus de 40 minutes se traduira par un marquage non spécifique approfondie en tranches striatales. La spécificité peut être directement déterminée par de décoloration en utilisant une forte concentration de KCl, ce qui devrait entraîner la libération du FFN dans les vésicules synaptiques fonctionnelles. L'exposition de la tranche d'FFN511 pour les moins de 15 minutes entraînera signal fluorescent faible en raison de l'insuffisance de chargement du colorant dans les terminaux. Dans ce protocole, nous utilisons 100 microns ADVASEP-7 pour éliminer le colorant liée au tissu extracellulaire. Cette étape n'est pas nécessaire, mais si elle est omise, le temps de purge de l'ACSF a besoin d'être prolongée. En résumé, selon la préparation que vous avez choisi, vous aurez besoin de modifier la période de concentration et de chargement pour déterminer l'étiquetage optimal.

Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Remerciements

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D. Les Sames merci Harold G. & Y. Leila Mathers Charitable Foundation et l'Université de Columbia initiatives en sciences et génie.
D. Sames et D. Sulzer remercier la Fondation McKnight pour les innovations technologiques dans McKnight Prix neurosciences
D. Sulzer grâce NIDA, NIMH, et la Picower et Fondations maladie de Parkinson.
H. Zhang grâce NARSAD.
RH Edwards remercie la Fondation Michael J. Fox, la National Parkinson Foundation, le NIDA et NiMH.
Nous remercions Robert Burke pour la 6-OHDA injections et des conseils, Sonders Mark pour des discussions utiles, Merek Siu pour la programmation de l'analyse d'imagerie, et Jan Schmoranzer pour le soutien technique avec l'installation de microscopie TIRF.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
FFN511 (8-(2-Amino-ethyl)-2,3,5,6-tetrahydro-1H,4H-11-oxa-3a-aza-benzo[de]anthracen-10-one)Université Columbia - Laboratoire Dalibor Sames
ADVASEP-7 CyDexAR-OA7-005
Chambre d'enregistrement RC-27LWarner Instruments64-0375
Support PELCO PrepEze à 6 puitsTed Pella, Inc.36157-1Pour l'incubation des tranches
Stimulateur d'impulsions Master-8 et isolateur de stimulus Iso-FlexAMPI

Références

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  1. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxi coordinators. , Academic Press. San Diego. (1997).
  2. Kay, A. R. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat. Neuron. 24, 8098-8117 (1999).
  3. Bamford, N. S. Heterosynaptic dopamine neurotransmission selects sets of corticostriatal terminals. Neuron. 42, 653-653 (2004).

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Mots-clés

Faux neurotransmetteurs fluorescentsfusion des v sicules synaptiquesmarquage au FFN 511microscopie multiphotoniquestimulation lectriqued polarisation au chlorure de potassiumh t rog n it d pendante de la fr quencer cepteurs dopaminergiques D2

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