drosophile Quantification de la jonction neuromusculaire (JNM) : une méthode pour évaluer la morphologie et la fonction synaptiques

- Tout d’abord, immunocolorer les larves de drosophile avec des marqueurs qui mettent en évidence différents aspects des JNM ou des jonctions neuromusculaires. C’est la région où l’extrémité d’un axone de motoneurone entre en contact avec un muscle, et sa morphologie est utilisée comme lecture de la fonction synaptique.

L’axone se termine par plusieurs branches qui forment des renflements appelés boutons. Les neurotransmetteurs sont libérés par les boutons et provoquent une contraction musculaire. Les zones de libération de neurotransmetteurs sont appelées zones actives. Ici, un marqueur est spécifique d’une protéine synaptique qui décrit la NMJ, et l’autre marqueur est celui d’une protéine présente dans les zones actives.

Ensuite, acquérez des images NMJ à l’aide de la microscopie et évaluez quantitativement leur morphologie à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images semi-automatisé. Appliquez une série prédéfinie de commandes logicielles aux images. Les fichiers de sortie contiennent des images NMJ analysées et des résultats morphologiques. Les caractéristiques qui peuvent être mesurées incluent le nombre et la surface des boutons, la longueur et le numéro de branche NMJ, le nombre de compartiments NMJ non connectés et le nombre de zones actives.

Dans l’exemple suivant, nous analyserons la morphologie des NMJs de la drosophile colorés avec DLG1, un marqueur postsynaptique, et BRP, un marqueur de zone active.

- Pour ce protocole, générez des piles d’images de NMJ et enregistrez-les sous forme de fichiers TIFF individuels où le canal 1 montre la coloration DLG1 ou un marqueur similaire et le canal 2 montre la coloration BRP. Pour commencer, créez des projections Z et des hyperpiles des fichiers d’image NMJ. Ouvrez les options du plugin et sélectionnez Morphométrie de la drosophile NMJ.

Maintenant, identifiez la chaîne de fichiers unique que le microscope a attribuée à la série d’images lors de leur stockage au format TIFF. Ce sera à la fin du nom de l’image. Copiez et collez la chaîne donnée au plan le plus bas et au numéro de canal dans la fenêtre de réglage de la chaîne de fichier unique. Sélectionnez ensuite la sous-macro 'Convertir en pile' et choisissez le répertoire ou le dossier où se trouvent les images.

Pour chaque fichier image, deux nouveaux fichiers sont créés avec les noms par défaut stack et flat stack, suivis du nom de l’image d’origine. Les fichiers d’origine peuvent ensuite être supprimés pour économiser de l’espace de stockage. Ensuite, à partir de l’interface morphométrique de la NMJ de la drosophile, sélectionnez la sous-macro ROI définie et choisissez le répertoire du fichier image.

Lorsque la première projection s’ouvre, sélectionnez l’outil de sélections à main levée, puis utilisez la souris pour définir une région contenant un terminal NMJ complet d’intérêt. Une fois sélectionné, cliquez sur OK dans la fenêtre du terminal définie. Continuez ainsi jusqu’à ce que les terminaux NMJ soient définis dans toutes les projections. La macro fait avancer le processus automatiquement. Pour chaque fichier image, un nouveau fichier est créé avec les noms par défaut ROI suivis du nom de l’image d’origine.

Pour quantifier les caractéristiques de la NMJ, rendez-vous d’abord sur l’interface morphométrique de la NMJ de la drosophile et réglez l’échelle. Par exemple, si un pixel de l’image correspond à 0,72 micron, réglez les pixels d’échelle sur 1 et la distance d’échelle sur 0,072. Sélectionnez ensuite la sous-macro Analyser, et s’il y a deux images de canal, basculez également Attendre. Appuyez sur OK et, lorsque vous y êtes invité, sélectionnez le répertoire du fichier image. Le temps de traitement peut être de plusieurs minutes par synapse.

Après l’analyse, de nouveaux fichiers d’images pour chaque synapse analysée sont stockés dans le dossier parental, et les mesures quantitatives sont dans le fichier results.txt. Inspectez toutes les images et excluez les images présentant des erreurs de segmentation.

Par exemple, certaines parties de la terminaison synaptique peuvent ne pas être incluses dans le contour jaune. Des parties de l’arrière-plan peuvent être incluses dans le terminal synaptique. Une ligne squelette bleue peut s’étendre au-delà de la terminaison synaptique. Il se peut qu’il y ait trop de zones actives ou que certaines zones actives ne soient pas détectées.