Twee-Foton Laser-Geïnduceerde Neurale Verwonding: Een Methode om Axon Degeneratie en Regeneratie in Drosophila Larven te observeren

- Begin met het monteren van een schone, verdoofde larve onder een glazen afdekkingsslip met zijn kop omhoog. Stel vervolgens het interessegebied bloot door zachtjes op de afdekstrook te drukken om de larve te rollen en zijn positie aan te passen. Gebruik confocale beeldvorming om de neurale cellen van de larve te lokaliseren. Identificeer een specifiek axon op een van de doelneurale cellen als de plaats voor letsel.

Stel vervolgens het doel axon bloot aan een twee-foton laser op een hoger vermogen dan gebruikt voor beeldvorming om schade te veroorzaken. Een twee-foton laser wordt gebruikt vanwege het vermogen om schade in levend weefsel te penetreren en nauwkeurig te lokaliseren met minimale schade aan omliggend weefsel.

Stop de laserblootstelling onmiddellijk wanneer er schade is aan het doelneuron, wat resulteert in axotomie of het verbreken van het axon. Stel ten slotte het gewonde neuron in beeld om de degeneratie en daaropvolgende regeneratie op de gewenste tijdstippen te bekijken.

In het voorbeeldprotocol zullen we een larve monteren voor microscopie, schade aan larvale sensorische neuronen veroorzaken en neurale regeneratie volgen.

- Begin met het verdoven van de larven. Plaats in een zuurkast een glazen schaal van 60 millimeter in een plastic petrischaal van 15 centimeter. Vouw vervolgens een stuk tissuepapier en plaats het in de glazen schaal. Plaats de druivenagarplaat op het weefsel nadat de diethylether is toegevoegd.

Plaats vervolgens op een glazen glijbaan een druppel halocarbon 27-olie in het midden en plaats een vlek vacuümvet op elk van de vier hoeken. Gebruik vervolgens een tang om een larve op de agarplaat over te brengen en bedek de glazen schaal om de larve te verdoven. Zodra de lava stopt met bewegen, brengt u deze voorzichtig over naar de halokoolstofolie met zijn kop rechtop. Plaats vervolgens een afdekplaat over de glijbaan en druk deze zachtjes naar beneden totdat deze de larve raakt.

Gebruik vervolgens zachte kracht om de afdekstrip te schuiven om de cellen te rollen naar waar de twee-foton laser ze het gemakkelijkst zal raken. De locatie zal variëren afhankelijk van welke neuronen worden getarget. Beveilig nu de assemblage op de twee-foton microscoop fase en focus op de cellen van belang met behulp van een 40x olie onderdompelingsdoel.

Schakel in de software over naar de scanmodus en laad het opgeslagen protocol. Zorg ervoor dat het pinhole helemaal wordt geopend. Krijg vervolgens in de live-modus een goed beeld van de regio van belang.

Stop vervolgens de live scan zodat de bijsnijdknop beschikbaar komt. Pas met behulp van de bijsnijdfunctie het scanvenster aan om het doelgebied te richten op alleen de potentiële plaats van letsel. Open vervolgens een nieuw beeldvenster. Verlaag nu de scansnelheid en verhoog de laserintensiteit. Schakel vervolgens de continue knop in om de scan te starten en te stoppen. Let goed op. Zodra er een drastische toename van fluorescentie is, beëindigt u de scan.

Schakel vervolgens terug naar het oorspronkelijke beeldvenster en selecteer de livemodus en zoek de regio waarop het doel was gericht door de focus aan te passen.

- Een goede indicatie van succesvol letsel is het verschijnen van een kleine krater, ringachtige structuur of gelokaliseerd puin direct op de plaats van het letsel. Als de laserkracht te hoog was, zou een groot beschadigd gebied zichtbaar zijn, wat dodelijk kan zijn.

- Verwijder nu voorzichtig de afdekslip en breng de gewonde larve over op een nieuw bord met gistpasta. Doe de plaat in een schaal van 60 millimeter samen met een met propionzuur doordrenkt weefsel. Breng de plaat vervolgens terug naar cultiverende temperatuur.

Voor latere beeldvorming van de larve, maak gebruik van de opgeslagen confocale opstelling en verzamel z stack afbeeldingen met een 25x doel. Zorg ervoor dat u het normalisatiepunt opneemt, zodat de regeneratie kan worden gekwantificeerd.