Summary
ووصف وسائل غير الغازية لتقييم نجاح زرع myoblast. الأسلوب يستفيد من الجين الانصهار مراسل موحدة تتألف من الجينات التي التعبير ولا يمكن تصوير مع طرائق التصوير المختلفة. هنا، ونحن الاستفادة من
Abstract
ضمور العضلات دوشين (DMD) هو اضطراب عصبي عضلي شديد وراثي يصيب 1 في 3500 البنين، ويتميز الضمور العضلي التدريجي 1 و 2. في المرضى، وقدرة الأقمار الصناعية المقيمين خلايا العضلات (SCS) لتجديد التالف يصبح غير فعال myofibers متزايد 4. ولذلك، زرع الخلايا الاصلية العضلات (البلدان المتوسطية الشريكة) / myoblasts من الأصحاء هو نهج واعد العلاجية لDMD. وجود قيود كبيرة على استخدام العلاج بالخلايا الجذعية، ومع ذلك، هو عدم وجود تقنيات التصوير موثوقة لرصد طويل الأجل من الخلايا المزروعة، وتقييم فعاليتها. هنا، نحن تصف غير الغازية، في الوقت الحقيقي نهج لتقييم نجاح زرع myoblast. هذه الطريقة يستفيد من الجين الانصهار مراسل موحدة تتألف من الجينات (يراعة luciferase [fluc]، بروتين أحمر فلوري موحودي [mrfp] وsr39 كيناز ثيميدين [sr39tk]) الذي expreولا يمكن تصوير ssion مع طرائق التصوير المختلفة 9 و 10. مجموعة متنوعة من طرائق التصوير، بما في ذلك التصوير المقطعي بوزيترون الانبعاثات (PET)، واحدة الفوتون التصوير المقطعي (SPECT)، التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)، والتصوير الضوئي، وارتفاع وتيرة الموجات فوق الصوتية 3D-متاحة الآن، ولكل منها مزايا فريدة والقيود 11. تلألؤ بيولوجي التصوير (BLI) الدراسات، على سبيل المثال، لديها ميزة كونها منخفضة التكلفة نسبيا وارتفاع الإنتاجية. ولهذا السبب، في هذه الدراسة، ونحن الاستفادة من وسيفيراز اليراع (fluc) مراسل تسلسل الجينات الموجودة داخل الجينات الانصهار والتصوير تلألؤ بيولوجي (BLI) لتوطين قصيرة الأجل قابلة للحياة من myoblasts C2C12 بعد زرع في الماوس نموذج DMD (ضمور العضلات على الكروموسوم X [MDX] الماوس) 12-14. الأهم من ذلك، BLI يوفر لنا وسيلة لدراسة حركية البلدان المتوسطية الشريكة صفت ما بعد الزرع، وسوف يكون من المفيد تتبع الخلايا مرارا على مدى رIME والهجرة التالية. نهجنا الجينات مراسل يسمح لنا المزيد لدمج طرائق التصوير متعددة في موضوع واحد المعيشة؛ نظرا لطبيعة تصوير الشعاعي الطبقي، القرار المكانية والقدرة على غرامة تصل إلى حجم أكبر الحيوانات والبشر 10،11، سوف PET تشكل أساس العمل في المستقبل أننا قد توحي تسهيل عملية الترجمة السريعة من الطرق وضعت في الخلايا لنماذج قبل السريرية والتطبيقات السريرية.
Protocol
1. صيانة ونشر C2C12 Myoblasts
- لوحة C2C12 myoblasts في قارورة 75 2 سم والحفاظ على الخلايا في مصل الدم عالية الجلوكوز في Dulbecco معدلة النسر (HG-DMEM) تستكمل مع مصل بقري جنيني (FBS) إلى تركيز النهائي من 10٪. لا تسمح الخلايا لتصبح متموجة في أي وقت لأن هذا سوف تستنفد السكان الأرومة العضلية. يجب تغيير كل ملاحظة أخرى متوسطة اليوم:. المتوسطة الدافئة دائما الى 37 درجة مئوية في حمام مائي قبل استخدامها.
- عندما تصبح myoblasts ما يقرب من 80٪ متموجة، وخلايا لمرور قارورة جديدة. نضح ثقافة المتوسط. غسل الخلايا مع الحل 4-5 مل هانكس المتوازن الملح (HBSS) لإزالة كل أثر للثقافة المتوسط، التي تتضمن التربسين المثبط للمصل. شطف لفترة وجيزة مع طبقة الخلايا 2-3٪ 0.25 مل (ث / ت) التربسين EDTA-حل لفصل وتمسكا myoblasts من القارورة. نضح التربسين وقارورة في مكان الحاضنة في C ° 37 لمدة 5 دقائق.
- خلال هذه incubaنشوئها، وإعداد قارورة جديدة مع 9 مل من المتوسط FBS HG-DMEM/10٪. بعد trypsinization، إضافة 10 مل من المتوسط إلى خلايا كاملة ومرات 4-5 ماصة لضمان جمع جميع الخلايا في المتوسط. إضافة 1 مل من التعليق الخلية إلى قارورة جديدة واحتضان في 5٪ CO 2 في 37 ° C.
2. C2C12 خلية ترنسفكأيشن
- مرة واحدة وصلت 50٪ الخلايا confluency، بالنقل وفقا لتعليمات الشركة الصانعة من إينفيتروجن. لفترة وجيزة، والجمع بين 90 ميكرولتر كاشف Lipofectamine 2000 مع 4.5 المتوسطة OPTI-MEM مل. في آخر أنبوب، والجمع بين 36 ميكروغرام الجينات مراسل CMV-DNA trifusion مع 4.5 مل OPTI-MEM. نفض الغبار كل أنبوب على الجمع بين والانتظار 5 دقائق. الجمع بين محتويات كل من أنابيب، مزيج بلطف واحتضان في درجة حرارة الغرفة لثلاثين دقيقة بالضبط ملاحظة: ينبغي أيضا القارورة الثانية يمكن إعداد الخلايا لuntransfected التي تتلقى فقط Lipofectamine وOPTI-MEM لتكون بمثابة الشاهد السلبي.
- إزالة الخلايا المتوسطة من C2C12 وإضافة 15،5مل من جديد HG-DMEM/10٪ FBS المتوسط. إضافة ترنسفكأيشن المتوسطة الحجم الإجمالي لجلب إلى 20 مل.
- يسمح بالنقل الخلايا ليلة وضحاها لا يقل عن 20 ساعة في 37 ° C.
- اليوم التالي، ونضح المتوسطة ترنسفكأيشن إضافة 10 مل HG-DMEM/10٪ FBS.
- عرض الخلايا تحت المجهر الفلورسنت ومقلوب. القبض على كل من حقل مشرق والصور مضان أحمر (باستخدام مكعب TRITC مرشح؛ mrfp م ت / م: 584/607 نانومتر). حساب عدد الخلايا، معربا عن RFP ينظر تحت مضان مقسوما على العدد الكلي للخلايا ينظر تحت حقل مشرق للحقول متعددة من أجل توليد الكفاءة ترنسفكأيشن.
3. تقييم الفحص البقاء على قيد الحياة / MTT الخليوي
- يوم واحد قبل، ترنسفكأيشن وحة 1x10 خلايا C2C12 5 في كل بئر في لوحة 24 أيضا. وينبغي مطلي الخلايا في 500 ميكرولتر حجم HG-DMEM/10٪ FBS في.
- اليوم التالي، myoblasts بالنقل بين عشية وضحاها كما هو موضح سابقا. اتبع الاقتراحات الشركة المصنعة لreagen ترنسفكأيشنر مجلدات لوحة 24 أيضا. احتضان مجموعة من الآبار مع Lipofectamine فقط (أي DNA) كمجموعة تحكم. عرض الخلايا تحت مضان لضمان ترنسفكأيشن السليم حدث.
- إزالة المتوسطة ترنسفكأيشن واحتضان myoblasts مع 5 ملغ / مل thiazolyl الأزرق تترازوليوم بروميد (MTT) في HG-DMEM/10٪ FBS. إضافة إلى D-وسيفيرين ثمانية من الآبار بالنقل، واحتضان في C ° 37 لمدة أربع ساعات.
- إزالة المتوسطة من الآبار. ذوبان بلورات زرقاء formazan بإضافة 180 ميكرولتر الأيزوبروبانول إلى كل بئر. يهز في C ° 37 لمدة 15 دقيقة.
- تجنب أي حل متعجل ماصة، في لوحة 96-جيدا وقراءة الامتصاصية على 575 نانومتر.
4. إعداد Myoblasts لزرع
- إزالة المتوسطة، وغسل myoblasts مع HBSS، ويعرض للتريبسين الخلايا على النحو المبين في 1.1.
- اعادة تعليق الخلايا في 4 مل من المتوسط كاملة.
- باستخدام عدادة الكريات، عد الخلايا لتوليد مجلدات تحتوي على 10 6 myoblasts. ماصة المجلدأوميا في معقمة microtubes مل 1.5. مع كفاءة ترنسفكأيشن من 10٪ ~، هذه القيم تشير إلى أن 100،000 وسيفيراز، معربا عن الخلايا للكشف على الماسح الضوئي ExploreOptix GE بعد الزرع.
- تحقيق وحدة تخزين حقن النهائي من 15 ميكرولتر، التي تحتوي على 10 6 C2C12 الخلايا. إذا لزم الأمر، في أجهزة الطرد المركزي microtubes 2،000 دورة في الدقيقة لدقيقة واحدة. نضح بعناية طاف مع ماصة. اعادة تعليق الخلايا في 15 ميكرولتر من HG-DMEM FBS تفتقر.
5. خلية زرع
- تخدير الفأر مع 2٪ isoflurane / 2 O 2٪. نتف الشعر من المنطقة الخلفية الظهرية أطرافهم. الحفاظ على التخدير بنسبة 1.5٪ isoflurane / 2 O 2٪.
- وعلقت كذلك ضمان C2C12 myoblasts. مع الماوس في وضعية الرقود، تمديد أطرافهم هند واستخدام حقنة الأنسولين لحقن الخلايا مباشرة في الرأس الوحشي للعضلة الساق بزاوية ° 30. حقن myoblasts بالنقل في أطرافهم هند الحق وuntransfected الباحث myoblastsيا المقابل (يسار) أطرافهم هند.
- إجراء فحص تلألؤ بيولوجي خط الأساس: نقل بسرعة إلى مرحلة الماوس في الماسح الضوئي البصري، ووضع الماوس في وضعية الرقود. وصل خط مخدر. لضمان تخدير الماوس لا يزال، يجب أن يكون الشخص الثاني الحالي لعقف خط مخدر في حين أن غيرها من الأماكن الحيوان في الماسح الضوئي.
- تمديد أطرافهم هند بلطف حتى مجال حقن مرئيا. الشريط أطرافه الخلفية في مكان مع مادة لاصقة لطيف مثل الشريط الطبية.
- إغلاق الغرفة وضمان عدم وجود ضوء يمكن الوصول إلى المناطق الداخلية من الماسح الضوئي، حيث سيؤدي ذلك إلى زيادة إشارة الخلفية الكشف عنها. يجب تعيين الماسح الضوئي لمعلمات المدرجة في إرشادات الشركة المصنعة للتصوير تلألؤ بيولوجي. على وجه التحديد، وضمان "لا ليزر" محددا.
- رسم المنطقة ذات الاهتمام (ROI) في جميع أنحاء منطقة التقطه وبدء المسح.
6. حقن الركيزة Fluc، D-وسيفيرين، في الماوس MDX
<رأ>7. BLI لاستهداف لوك، معربا عن البلدان المتوسطية الشريكة وبعد زرع في نماذج الماوس من DMD
- بعد فترة امتصاص، تخدير الماوس مرة أخرى، كما هو موضح في 5.1.
- نقل الماوس مرة أخرى إلى ماسحة الضوئية وتنفيذ مسح آخر تلألؤ بيولوجي في بنفس الطريقة التي تفحص الخلفية.
- على الرغم من أن امتصاص 20 دقيقة الفترة القصوى ينبغي أن توفر قوة إشارة، قد يتم تنفيذ مسح لاحقة.
- عند الانتهاء من الحصول على الصور، تضحية الماوس وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها الخاص المؤسسية الحيوان الأخلاق اللجنة والمجلس الكندي للرعاية الحيوان (وانا). عزل العضلات الخلفية أطرافهم ومكان على الفور طن 10٪ فورمالين لإصلاح الغرز البارافين. أداء تلطيخ المناعية للوسيفيراز لتأكيد الحقن العضلي من myoblasts.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
على 50-60٪ confluency، وعابر C2C12 myoblasts مع مراسل الانصهار المذكورة أعلاه بناء الجينات تتألف من وسيفيراز اليراع [fluc]، موحودي الحمراء الفلورسنت البروتين [mrfp] وsr39 ثيميدين كيناز [sr39tk] (الشكل 1A). تم حساب الكفاءة ترنسفكأيشن عبر المجهر مضان (أرقام 1B، C)، والاستفادة من تسلسل mrfp في بناء مراسلنا. لم يتأثر بقاء الخلية عن طريق وضع العلامات مع الركيزة BLI، D-وسيفيرين (1D الشكل). بعد ترنسفكأيشن، تم زرع ما يقرب من 100،000 mrfp، معربا عن myoblasts عضليا في عضلة الساق من الفئران MDX (التي سبق تحديدها، مخطوطة المقدمة)، وتم زرع الخلايا وبالمثل 100،000 untransfected في أطرافهم هند المقابل كمجموعة تحكم. زرع الخلايا التالية مباشرة، تم حقن الفئران الغشاء البريتونى (IP) مع 150 ملغ / كغ D-lucifeرين. بعد فترة امتصاص ~ 20 دقيقة، تم تصويره على الفئران ماسح ضوئي بصري الحيوانات الصغيرة (GE ExplorOptix الصندوق الأسود الذي تم تجهيز للتلألؤ بيولوجي الحيوانات الحية ومضان). كما أوضحنا آنفا، سواء في المختبر، وبعد زرع (مخطوطة المقدمة) امتصاص D-وسيفيرين كان fluc محددة ل، معربا عن myoblasts، ومع تلألؤ بيولوجي لا يمكن كشفها في الخلايا untransfected (الشكل 2). أكد المناعية زرع العضلي من myoblasts (الشكل 3)
الشكل 1 تخطيطي للبناء مراسل CMV-trifusion (A)؛ brightfield / صور مضان من C2C12 myoblasts transfected مع مراسل trifusion بلازميد (B، C)؛ MTT فحص لتقييم C2C12 البقاء على قيد الحياة بعد وضع العلامات مع خلية الركيزة BLI، D-وسيفر في (D).
الشكل 2. التصوير تلألؤ بيولوجي (BLI). يتم رسم المنطقة ذات الاهتمام (ROI) لإحاطة منطقة أطرافهم هند التقطه حيث يتم حقن myoblasts (A). لم يتم الكشف عن تلألؤ بيولوجي الخلفية أثناء الفحص (B). في 23 دقيقة بعد حقن D-وسيفيرين، يتم الكشف عن إشارة واضحة من أطرافهم هند الحق حيث يتم حقن وسيفيراز، معربا عن myoblasts. لم يتم الكشف عن تلألؤ بيولوجي في أطرافهم هند المقابل حقن myoblasts untransfected (C). اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
upload/50119/50119fig3.jpg "/>
الشكل 3. IHC باستخدام الأجسام المضادة وسيفيراز اليراع يؤكد زرع الخلايا العضلي C2C12 بالنقل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه الدراسة، وقد وصفت لدينا سريعة وموثوق بها الجينات الجزيئية التصوير الصحفي، إلى نهج myoblasts الهدف غير جراحية / بعد زرع البلدان المتوسطية الشريكة. في حين توضح هذه الدراسة التوطين على المدى القصير من البلدان المتوسطية الشريكة المزروعة عن طريق التصوير bioluminescense (BLI)، والطريقة التي يتم استهداف الخلايا يمكن، في الواقع، أن تطبق بسهولة لتقييم الطولي للخلية engraftment، من خلال زرع الخلايا التي ستابلي صريح مراسل الجينات. تحقيقا لهذه الغاية، وقد ولدت مجموعتنا خطوط الماوس المعدلة وراثيا التي تؤوي الجين مراسل موحدة. معربا عن الخلايا فقط الجين مراسل أكسدة D-وسيفيرين لإنتاج الفوتونات لتصور باستخدام BLI. منذ أكسدة D-وسيفيرين تعتمد على التعبير الجيني، وهذا هو التكنولوجيا قوة، والتي لغير جراحية الخلايا المزروعة صورة قابلة للحياة. الأنسجة العضلية يمكن أن تحصد من هذه الفئران المعدلة وراثيا والخلايا الأقمار الصناعية (SCS) معزولة عن طريق FACS يكون في الواقع targeteد بعد زرع في الفئران MDX. بالإضافة إلى ذلك، يمكننا تتبع وضعهم التمايز من خلال استخدام أحد المروجين العضلات الخاصة مما زاد زيادة فائدة وأهمية تقنيات التصوير الجزيئي، مثل الواردة في هذه الوثيقة، في مجال البحوث DMD (مخطوطة المقدمة). بالإضافة إلى سرعة ومنخفضة التكلفة، BLI غير سامة، مما يجعله خيارا جذابا للتصوير المتكرر من الحيوانات الصغيرة. هذه الميزة، فضلا عن خصوصيته عالية، وسوف لا تقدر بثمن في تحسين العلاجات البديلة للmyoblast في نماذج الأمراض ما قبل السريرية من ضمور العضلات دوشين قبل التقدم إلى الدراسات التي تنطوي على سريريا للتطبيق تكنولوجيات مثل PET.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر سانجيف كثافة جامبير للهدية من الجين مراسل fluc/mrfp/sr39tk. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل شبكة خلية الجذعية (SCN) في كندا، ومؤسسة وجيسي رحلة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C2C12 myoblasts | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Life Technologies | 12800-017 | |
| fetal bovine serum | Life Technologies | 12483020 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-72 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Nikon Eclipse TE2000-5 | Nikon Instruments Inc. | ||
| Xenolight D-luciferin | PerkinElmer | 122796 | 40 mg/ml in PBS |
References
- Emery, A. E.
- Blake, D. J., et al. Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle. Physiol. Rev. 82, 291-329 (2002).
- Goldring, K., Partridge, T., Watt, D.
- Partridge, T. A. Cells that participate in regeneration of skeletal muscle. Gene Ther. 9, 752-753 (2002).
- Moss, F. P., Leblond, C. P. Satellite cells as the source of nuclei in muscles of growing rats. Anat. Rec. 170, 421-435 (1971).
- Snow, M. H. An autoradiographic study of satellite cell differentiation into regenerating myotubes following transplantation of muscles in young rats. Cell Tissue Res. 186, 535-540 (1978).
- Kuang, S., Rudnicki, M. A. The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential. Trends Mol. Med. 14 (2), 82 (2008).
- Hoffman, E. P., et al. Characterization of dystrophin in muscle-biopsy specimens from patients with Duchenne's or Becker's muscular dystrophy. N. Engl. J. Med. 318, 1363-1368 (1988).
- Ray, P., Tsien, R., Gambhir, S. S. Construction and validation of improved triple fusion reporter gene vectors for molecular imaging of living subjects. Cancer Res. 67 (7), 3085 (2007).
- Ray, P., et al. Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects. Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new lights. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
- Sicinski, P., et al. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science. 244, 1578-1580 (1989).
- Mattson, M. P. Pathogenesis of neurodegenerative disorders. In: Contemporary neuroscience. X, Humana. Totowa, NJ. 294 (2001).
- Andersson, J. E., Bressler, B. H., Ovalle, W. K. Functional regeneration in hind limb skeletal muscle of the mdx mouse. J. Muscle Res. Cell Motil. 9, 499-515 (1988).
