Summary
Miyoblast ekiminin başarısını değerlendirmek için bir non-invaziv yollarla açıklanmıştır. Yöntemi olan ifade farklı görüntüleme yöntemleri ile görüntülenebilir genlerin oluşan birleşik bir füzyon muhabiri gen yararlanır. Burada, bir yararlanabilir
Abstract
Duchenne müsküler distrofi (DMD) 3500 erkeklerde 1 etkileyen ciddi bir genetik nöromüsküler hastalıktır ve ilerleyici kas dejenerasyonu 1, 2 ile karakterizedir. Hastalarda, hasarlı myofibers yenilenmesine ikamet kas uydu hücrelerinin yeteneği (SC'ler) 4 gittikçe verimsiz hale gelmektedir. Bu nedenle, sağlıklı deneklerden kas progenitör hücrelerin (PPM'ler) / miyoblastları transplantasyonu DMD için umut verici bir tedavi yaklaşımıdır. Kök hücre tedavisi kullanımı önemli bir kısıtlaması, ancak implante hücrelerin uzun vadeli izlenmesi için, ve onun etkinliğini değerlendirmek için güvenilir görüntüleme teknolojilerinin bir eksikliğidir. Burada, miyoblast ekiminin başarısını değerlendirmek için bir non-invaziv, gerçek zamanlı bir yaklaşım açıklanmaktadır. Bu yöntem (ateş böceği lusiferaz [değişimlerine], monomer cinsi kırmızı flöresanlı protein [MRFP] ve SR39 timidin kinaz [sr39tk]) expre genlerin oluşan bir birleşik füzyon raportör gen yararlanırSsion farklı görüntüleme yöntemleri 9, 10 ile görüntülenebilir. Pozitron emisyon tomografisi (PET), tek foton emisyon bilgisayarlı tomografi (SPECT), manyetik rezonans görüntüleme (MRI), optik görüntüleme ve yüksek frekanslı 3D ultrason dahil olmak üzere görüntüleme yöntemleri, çeşitli eşsiz avantajları ve sınırlamaları, her biri mevcuttur 11. Bio-ışıldama, görüntüleme (BLI) çalışmalar, örneğin, nispeten düşük maliyetle ve yüksek işlem olma avantajına sahiptir. Bu çalışmada, biz bir fare içine implantasyonu uygulanabilir C2C12 miyoblastları kısa vadeli lokalizasyon için füzyon geni ve biyolüminesans görüntüleme (BLI) bulunan ateşböceği lusiferaz (değişimlerine) muhabiri gen sekansı yararlanabilir, bu nedenle içindir DMD modeli 12-14 (X kromozomu [mdx] fare müsküler distrofi). Önemlisi, BLI etiketli PPM'ler implantasyon sonrası kinetiğini incelemek için bir yol bize sağlar ve t üzerinde art arda hücreleri izlemek için yararlı olacaktırime ve aşağıdaki göç. Bizim muhabiri gen yaklaşımı bizi daha tek bir canlı konuda birden fazla görüntüleme yöntemleri birleştirme sağlar; tomografik doğası, ince uzaysal çözünürlük ve büyük hayvanlarda ve insanlarda 10,11 büyültmek için yeteneği verilir, PET gelecekteki çalışmalarımızın temelini oluşturacaktır ki önermek preklinik modeller ve klinik uygulamalara hücrelerinde geliştirilen yöntemlerden hızlı çeviri kolaylaştırabilir.
Protocol
1. C2C12 miyoblastları Bakım ve Yayılım
- Levha C2C12 75 cm2 şişeye iskelet hücreleri ve% 10 bir son konsantrasyon için, sığır cenin serumu (FBS) ile desteklenmiş yüksek glikoz Dulbecco Modifiye Kartal Serumu (HG-DMEM) hücreleri korumak. Bu myoblastic nüfusun tüketmek olacak gibi hücreler her zaman konfluent haline izin vermeyin. ° C Kullanmadan önce bir su banyosunda 37 hep sıcak orta:. Orta günaşırı Not değiştirilmelidir.
- Miyoblastları yaklaşık% 80 oranında konfluent hale geldiğinde, yeni bir şişeye geçit hücreleri. Kültür ortamı aspire. Tripsin önleyici serum içeren kültür ortamı, tüm izlerini kaldırmak için 4-5 ml Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ile hücreleri yıkayın. Kısaca 2-3 ml% 0.25 'lik şişeden yapışık iskelet hücreleri ayırmak (w / v) Tripsin-EDTA çözeltisi ile hücre tabakası durulama. 5 dk için 37 ° C 'de inkübatör içinde tripsin ve yer şişeye aspire.
- Bu inkübasyon sırasındation, HG-DMEM/10% FBS ortamı 9 ml ile yeni bir şişesi hazırlanır. Tripsinizasyonla sonra, ortam içinde tüm hücrelerin toplanmasını sağlayacak hücreleri ve 4-5 kez pipet ile tam bir ortam 10 ml eklenir. Yeni bir şişeye hücre süspansiyonu 1 ml ilave edilir ve 37% 5 CO2 içinde inkübe ° C
2. C2C12 Hücre Transfeksiyon
- Sonra hücreler Invitrogen üreticinin talimatlarına göre, konfluent% 50 transfekte ulaşmıştır. Kısaca, 4.5 ml OPTI-MEM ortam ile 90 ul lipofektamin 2000 reaktifi birleştirir. Başka bir tüp, 4,5 ml OPTI-MEM ile 36 mikrogram CMV-trifusion muhabiri gen DNA birleştirir. 5 dk birleştirmek ve beklemek her tüp Flick. Hem tüplerin içeriğini birleştirin, yavaşça karıştırın ve tam otuz dakika oda sıcaklığında inkübe Not:. İkinci bir şişeyi de sadece bir negatif kontrol olarak hizmet lipofektamin ve OPTI-MEM aldığınız untransfected hücreleri için ayarlanmış olmalıdır.
- C2C12 hücrelerinden orta çıkarın ve 15,5 ekleyinTaze HG-DMEM/10% FBS orta ml. 20 ml toplam hacmi getirmek için transfeksiyon orta ekleyin.
- Hücreler 37, en az 20 saat süreyle gece boyunca transfekte etmek için izin ° C.
- Ertesi gün, transfeksiyon orta aspirat ve 10 ml HG-DMEM/10% FBS ekleyin.
- Ters floresan mikroskop altında hücreleri görüntüle. Parlak alan ve kırmızı floresan görüntüler hem Yakalama (Bir TRITC filtre küp kullanarak; MRFP ex / em: 584/607 nm). Transfeksiyon etkinliği oluşturmak için birden fazla bakış alanları için parlak bir alan altında incelendi hücrelerinin toplam sayısına bölünmesiyle floresan altında incelendi TÇ-salgılayan hücrelerin sayısını sayın.
3. Hücre Survivability / MTT Testinin Değerlendirilmesi
- Bir 24-kuyu levhası, her kuyuya transfeksiyon, levha 1x10 5 C2C12 hücreleri önce bir gün. Hücreler HG-DMEM/10% FBS içinde 500 ul hacim içinde kaplanacaktır.
- Ertesi gün, transfekte miyoblastları bir gecede önce tarif edildiği gibi. Transfeksiyon Reagen için üreticinin önerilerini izleyin24-plaka için t miktarlar. Bir kontrol olarak sadece lipofektamin (DNA yok) ile kuyuları, bir dizi inkübe edin. Bu uygun transfeksiyon oluştu sağlamak için floresan altında hücreleri görüntüle.
- HG-DMEM/10% FBS içinde 5 mg / ml tiazolil mavi tetrazolyum bromürde (MTT) ile transfeksiyon, orta ve inkübe miyoblastları çıkarın. Transfekte kuyuların sekiz D-luciferase ekleyin ve dört saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Kuyulardan ortamı çıkarın. Her kuyucuğa izopropanol 180 ul ekleyerek mavi formazan kristalleri çözünür. 15 dakika boyunca 37 ° C 'de çalkalanır.
- 96 çukurlu bir plaka içine herhangi bir çökelti, pipet çözelti kaçınmak ve 575 nm 'de absorbans okuyun.
4. Nakli için miyoblastları hazırlanması
- , Orta kaldır HBSS ile miyoblastları yıkayın ve 1.1 'de belirtilen hücreleri Trypsinize.
- Tam bir ortam, 4 ml hücreleri tekrar askıya.
- Hemasitometre kullanarak, 10 6 miyoblastları içeren ciltleri üretmek için hücreleri saymak. Pipet volsteril 1.5 ml mikrotüp içine ume. ~% 10 bir transfeksiyon etkinliği ile, bu değerler, 100,000 lusiferaz-Salgılayan hücrelerin nakilden sonra GE ExploreOptix tarayıcı üzerinde saptanabilir işaret etmektedir.
- C2C12 10 6 hücre içeren, 15 ul nihai hacim enjeksiyon ulaşmak. Gerekirse, bir dakika 2.000 rpm'de mikrotüpler santrifüj. Bir pipet ile süpernatant dikkatlice aspire. HG-DMEM FBS yoksun 15 ul hücre yeniden askıya.
5. Hücre İmplantasyonu
- 2% 2 / izofluran% O 2 fare uyuştur. Dorsal arka bacak bölgesinden saç koparmak. % 1.5 2 / izofluran% O 2 de anestezi koruyun.
- Olun C2C12 miyoblastları de askıya alınır. Yüzükoyun pozisyonda fare ile arka bacak uzatmak ve doğrudan 30 ° açıyla gastroknemius kasının lateral kafa içine hücreleri enjekte insülin şırınga kullanın. Sağ arka ekstremite ve untransfected miyoblastları int transfekte miyoblastları Injectkontralateral (sol) arka bacak o.
- Temel biyolüminesans tarama gerçekleştirin: Çabuk bir yüzükoyun pozisyonda fare döşeme, optik tarayıcı sahne fare aktarın. Anestezik hattı bağla. Fare anestezi kalmasını sağlamak için, ikinci bir kişi anestezik hattı bağlamak için mevcut olmalıdır tarayıcıya başka yerlerde hayvan ederken.
- Enjeksiyon bölgesine görülebilecek şekilde yavaşça arka uzuv uzanır. Gibi tıbbi bant gibi nazik bir yapıştırıcı ile bir yerde Teyp arka bacaklarda.
- Odanın kapatın ve bu tespit plan sinyali artacaktır olarak hiçbir ışık, tarayıcı iç erişebilmesini sağlamak. Tarayıcı biyolüminesans görüntüleme için üreticinin talimatlarına dahil parametreleri ayarlanmış olmalıdır. Özellikle, "Hiçbir lazer" seçili olduğundan emin olun.
- Koparıp alan ve başlangıç tarama çevresinde ilgi (ROI) bir bölgede çizin.
6. Mdx Fare içine Fluc Yüzey, D-luciferase, enjeksiyon
<ol>7. BLI DMD Mouse Modelleri içine İmplant ardından Luc-ifade PPM'ler Hedefleyecek
- 5.1 'de tarif edildiği gibi kavrama süre sonra, yine fare anestetize.
- Optik tarayıcı geri fare aktarın ve arka plan tarama ile aynı şekilde başka bir biyolüminesans taraması.
- 20 dakikalık bir süre alım maksimum sinyal yoğunluğu sağlamak gerekir, ancak bir sonraki taraması yapılabilir.
- Görüntü elde tamamlayan, sizin Kurumsal Hayvan Etik Komitesi ve Hayvan Bakımı (CCAC) günü Kanada Konseyi tarafından belirlenen kurallara göre fare feda. Ben hemen arka bacak kas ve yer ayırman% 10 formalin parafin gömme için düzeltmek için. Miyoblastları intramüsküler enjeksiyonu onaylamak için lusiferaz immünohistokimyasal boyama yapın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
% 50-60 oranında konfluent sonra, C2C12 iskelet hücreleri geçici olarak yukarıda sözü edilen füzyon ateş böceği lusiferaz raportör gen oluşan yapı ile transfekte edildi [değişimlerine], monomer cinsi kırmızı flöresanlı protein [MRFP] ve SR39 timidin kinaz [sr39tk] (Şekil 1A). Transfeksiyon verimliliği inşa bizim muhabir MRFP dizisi yararlanarak, floresan mikroskobu (Şekil 1B, C) üzerinden hesaplanmıştır. Hücre beka BLI substrat, D-luciferase (Şekil 1D) ile etiketleme etkilenmedi. Transfeksiyon sonrasında yaklaşık 100.000 MRFP salgılayan miyoblastları mdx farelerde gastroknemius kası (daha önce, el yazması teslim belirlenir) içine intramüsküler implante edildi; 100,000 untransfected hücreleri benzer bir kontrol olarak kontralateral arka ekstremite implante edildi. Hemen aşağıdaki hücre implantasyonu, farelere enjekte edildi 150 mg / kg D-lucife ile intraperitoneal (İP)rin. ~ Bir alım döneminden sonra 20 dk, fareler küçük bir hayvan optik tarayıcı (canlı hayvan biyolüminesans ve floresan için donatılmıştır GE ExplorOptix siyah kutu) üzerine görüntülendi. Önce in vitro ve post-implantasyon (elyazması incelemede) D-luciferase alımını hem de gösterildiği gibi untransfected hücrelerinde saptanabilir biyolüminesans (Şekil 2) ile, değişimlerine-ifade miyoblastları için belirli oldu. İmmünohistokimya miyoblastları intramüsküler transplantasyonu (Şekil 3) doğruladı
Şekil 1, CMV-trifusion raportör yapı (A) şematik;. Aydınlık / raportör plasmidi trifusion (B, C) ile transfekte edilmiş C2C12 miyoblastları flüoresans görüntüsü; BLI alt tabaka, D-Lucifer ile etiketleme aşağıdaki C2C12 hücre hayatta kalma değerlendirmek için MTT (D).
Şekil 2. Biyoparlaklık görüntüleme (BLI). Faiz (ROI) bir bölge miyoblastları (A) enjekte edilir koparıp arka bacak alanını çevrelemek için çizilir. Biyoparlaklık Arka plan tarama (B) sırasında tespit edilmez. D-luciferase enjeksiyonundan sonra 23 dk olarak, net bir sinyal lusiferaz ifade miyoblastları enjekte sağ arka ekstremite itibaren tespit edilir. Hayır biyolüminesans untransfected miyoblastları (C) enjekte kontralateral arka bacak tespit edilir. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
upload/50119/50119fig3.jpg "/>
Şekil 3,. Ateşböceği lusiferaz antikor kullanarak IHC transfekte C2C12 hücrelerin intramusküler implantasyonu doğruluyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, transplantasyon sonrası non-invaziv hedef miyoblastları / PPM'lere hızlı ve güvenilir bir moleküler görüntüleme, muhabir gen yaklaşımı nitelendirdiler. Bu çalışmada bioluminescense görüntüleme (BLI), aslında, kolayca çok hücre implantasyon yoluyla, hücre uyumunu uzunlamasına bir değerlendirme için uygulanabilir hedef hücreler olduğu şekilde üzerinden nakledilen PPM'lerin kısa süreli yerleşimi gösterilmiştir da stabil olarak ekspres raportör geni. Bu amaçla, bizim grup birleşik muhabiri gen liman transgenik fare hatları üretti. Muhabir gen ifade Sadece hücreleri BLI kullanarak görselleştirme için fotonlar üretmek için D-luciferase okside eder. D-luciferase oksidasyonu gen ekspresyonu bağımlı olduğundan, bu non-invaziv görüntü canlı nakledilen hücrelere sahip güçlü bir teknolojidir. FACS yoluyla izole bu transgenik fareler ve uydu hücrelerin (SC'ler) hasat kas dokusu gerçekten targete olabilird mdx farelere implantasyonu takiben. Ayrıca, biz daha DMD araştırma alanında (elyazması incelemede) için, burada sunulan gibi, moleküler görüntüleme teknolojilerinin yararlılığını ve önemini heightening, bir kas-spesifik promotor kullanımı yoluyla farklılaşma durumunu takip edebilirsiniz. Onun hız ve düşük maliyetli ilave olarak, BLI küçük hayvanların sık görüntüleme için cazip bir seçim yapmak, non-toksik değildir. Bu özellik, hem de yüksek özgüllük gibi, PET gibi teknolojiler içeren klinik-uygulanabilir çalışmalara geçmeden önce Duchenne müsküler distrofi klinik öncesi hastalık modellerinde miyoblast replasman tedavileri rafine paha biçilemez olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa etmek başka bir şey var.
Acknowledgments
Yazarlar fluc/mrfp/sr39tk muhabiri gen hediye Sanjiv Gambhir teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Kanada Kök Hücre Ağı (SCN) ve Jesse Yolculuğu Vakfı tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C2C12 myoblasts | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Life Technologies | 12800-017 | |
| fetal bovine serum | Life Technologies | 12483020 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-72 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Nikon Eclipse TE2000-5 | Nikon Instruments Inc. | ||
| Xenolight D-luciferin | PerkinElmer | 122796 | 40 mg/ml in PBS |
References
- Emery, A. E.
- Blake, D. J., et al. Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle. Physiol. Rev. 82, 291-329 (2002).
- Goldring, K., Partridge, T., Watt, D.
- Partridge, T. A. Cells that participate in regeneration of skeletal muscle. Gene Ther. 9, 752-753 (2002).
- Moss, F. P., Leblond, C. P. Satellite cells as the source of nuclei in muscles of growing rats. Anat. Rec. 170, 421-435 (1971).
- Snow, M. H. An autoradiographic study of satellite cell differentiation into regenerating myotubes following transplantation of muscles in young rats. Cell Tissue Res. 186, 535-540 (1978).
- Kuang, S., Rudnicki, M. A. The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential. Trends Mol. Med. 14 (2), 82 (2008).
- Hoffman, E. P., et al. Characterization of dystrophin in muscle-biopsy specimens from patients with Duchenne's or Becker's muscular dystrophy. N. Engl. J. Med. 318, 1363-1368 (1988).
- Ray, P., Tsien, R., Gambhir, S. S. Construction and validation of improved triple fusion reporter gene vectors for molecular imaging of living subjects. Cancer Res. 67 (7), 3085 (2007).
- Ray, P., et al. Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects. Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new lights. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
- Sicinski, P., et al. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science. 244, 1578-1580 (1989).
- Mattson, M. P. Pathogenesis of neurodegenerative disorders. In: Contemporary neuroscience. X, Humana. Totowa, NJ. 294 (2001).
- Andersson, J. E., Bressler, B. H., Ovalle, W. K. Functional regeneration in hind limb skeletal muscle of the mdx mouse. J. Muscle Res. Cell Motil. 9, 499-515 (1988).
