Summary
אמצעי לא פולשני להערכת ההצלחה של השתלה והיצמדות מתואר. השיטה מנצלת את גן כתב היתוך מאוחד המורכבים של גנים אשר ביטוי ניתן הדמיה בשיטות הדמיה שונות. הנה, אנחנו עושים שימוש ב
Abstract
ניוון שרירים דושנו (DMD) הוא מחל תוקפת גנטית חמורה המשפיעה על 1 ב 3500 בנים, ומתאפיין בניוון מתקדם שרירי 1, 2. בחולים, את היכולת של תאי שריר לווין תושבים (SCS) להתחדש myofibers הפגוע הופכת יותר ויותר יעילה 4. לכן, השתלה של תאי שריר (progenitor MPCs) / myoblasts מנבדקים בריאים היא גישה טיפולית מבטיחה לDMD. מגבלה עיקרית לשימוש בטיפול בתאי גזע, לעומת זאת, היא מחסור בטכנולוגיות הדמיה אמינות לניטור ארוך טווח של תאים מושתלים, ולהערכה האפקטיבית שלו. כאן, אנו מתארים גישה לא פולשנית, בזמן אמת כדי להעריך את ההצלחה של השתלה והיצמדות. שיטה זו מנצלת את גן כתב היתוך מאוחד המורכב של גנים (הגחלילית לוציפראז [fluc], חלבון פלואורסצנטי monomeric האדום [mrfp] וsr39 קינאז תימידין [sr39tk]) expression ניתן הדמיה בשיטות שונות הדמיה 9, 10. מגוון של שיטות הדמיה, כולל טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET), טומוגרפיה ממוחשבת פליטת פוטון יחיד (SPECT), דימות תהודה מגנטיות (MRI), דימות אופטי, ותדירות גבוהה 3D-אולטרסאונד זמין כעת, כל אחד עם יתרונותיו ומגבלות ייחודיים 11. פליטת אור הדמית מחקרים (BLI), למשל, יש את היתרון של להיות עלות נמוכה יחסית ותפוקה גבוהה. זה מסיבה זו, במחקר זה, אנו עושים שימוש ברצף גחלילית לוציפראז (fluc) כתב הגן הכלול בתוך גן ההיתוך והדמית פליטת אור (BLI) ללוקליזציה לטווח קצר של C2C12 myoblasts קיימא בעקבות השתלה לעכבר מודל של DMD (ניוון שרירים על כרומוזום X [MDX] עכבר) 12-14. חשוב לציין, BLI מספק לנו אמצעים לבחון את הקינטיקה של MPCs כותרת פוסט השתלה, ויהיה שימושי כדי לעקוב אחר תאים שוב ושוב על tIME וההגירה הבאה. גישת גן כתבנו נוסף מאפשרת לנו למזג שיטות הדמיה מרובות בחי נושא יחיד; קבל טומוגרפית הטבע, ברזולוציה מרחבית מצוינת ויכולת בהיקף של עד חיות ובני אדם 10,11 גדולות, PET יהווה את הבסיס למחקר עתידי שאנחנו מציע עשויה להקל תרגום מהיר של שיטות שפותחו בתאים למודלים פרה וליישומים קליניים.
Protocol
1. תחזוקה והתקדמות של C2C12 Myoblasts
- צלחת C2C12 myoblasts בבקבוק 2 סנטימטר 75 ולשמור על תאים בסרום של גלוקוז הגבוה Dulbecco השינוי של הנשר (HG-DMEM) בתוספת סרום שור עוברי (FBS) לריכוז סופי של 10%. אל תאפשרו לתאים להפוך לconfluent בכל עת כמו זה יהיה לרוקן את אוכלוסיית myoblastic. בינוני צריכים להיות שונה בכל יום אחרת הערה:. בינונית תמיד חם עד 37 מעלות צלזיוס באמבט מים לפני שימוש.
- כאשר myoblasts הפך כ 80% מחובר, תאי מעבר לבקבוק חדש. לשאוב מדיום התרבות. שטוף תאים עם פתרון 4-5 מ"ל הנקס מאוזן מלח (HBSS) כדי להסיר את כל העקבות של תרבות בינונית, המכיל סרום טריפסין-עיכוב. בקצרה לשטוף את שכבת התא עם 0.25 (w / v) פתרון טריפסין-EDTA לנתק את myoblasts החסיד מבקבוק% 2-3 מ"ל. לשאוב טריפסין ובקבוקון המקום באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- במהלך incuba זהtion, להכין בקבוק חדש עם 9 מ"ל של מדיום FBS HG-DMEM/10%. לאחר trypsinization, להוסיף 10 מ"ל של מדיום מוחלט לתאים וזמני פיפטה 4-5 להבטיח אוסף של כל התאים בטווח הבינוני. הוסף 1 מ"ל של השעית תא לבקבוק החדש ומדגיר CO 5% 2 ב 37 ° C.
2. Transfection התא C2C12
- ברגע שתאים הגיעו 50% confluency, transfect פי הוראות היצרן מInvitrogen. בקצרה, לשלב 90 ריאגנט 2000 μl Lipofectamine עם 4.5 מ"ל בינוני OPTI-ממ. בצינור אחר, לשלב 36 דנ"א גן כתב CMV-trifusion מיקרוגרם עם 4.5 המ"ל OPTI-ממ. פליק כל צינור לשלב ולחכות 5 דקות. שלב את התוכן של שני הצינורות, מערבב בעדינות והדגירה בטמפרטורת חדר למשך שלושים דקות בדיוק. הערה: בקבוק השני צריך גם להגדיר לתאי untransfected שיקבלו Lipofectamine וOPTI-ממ רק כדי לשמש שליטה שלילית.
- הסר בינוני מC2C12 תאים ולהוסיף 15.5מ"ל של מדיום FBS טרי HG-DMEM/10%. הוסף בינוני transfection להביא נפח כולל עד 20 מ"ל.
- התר לתאי transfect לילה עבור לפחות 20 שעות ב 37 ° C.
- למחרת, לשאוב בינוני transfection ולהוסיף 10 המ"ל HG-DMEM/10% FBS.
- צפו בתאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. ללכוד הוא שדה מואר ותמונות פלואורסצנציה אדומות (באמצעות קוביית מסנן TRITC; mrfp לשעבר /: 584/607 ננומטר). לספור את מספר התאים המבטאים-RFP שנצפו תחת פלואורסצנטי מחולק במספר הכולל של תאים שנצפו בשדה בהיר עבור שדות מרובים של נוף לייצר יעילות transfection.
3. הערכת Assay הנייד שרידות / MTT
- יום לפני transfection, 1x10 5 תאים C2C12 צלחת לכל אחד גם בצלחת 24 גם אחד. תאים צריכים להיות מצופים ב500 כרכי μl בHG-DMEM/10% FBS.
- למחרת, myoblasts transfect הלילה כפי שתואר לעיל. פעל לפי הצעות יצרן לtransfection reagenכרכי t לצלחת 24 היטב. דגירת קבוצה של בארות עם Lipofectamine בלבד (ללא DNA) כביקורת. צפו בתאים תחת פלואורסצנטי כדי להבטיח שtransfection התקין התרחש.
- הסר בינוני transfection וmyoblasts אינקובטורים עם 5 מ"ג / המ"ל thiazolyl הכחול tetrazolium רומיד (MTT) בHG-DMEM/10% FBS. הוסף D-luciferin לשמונה מבארות transfected, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות.
- הסר בינוני מבארות. Solubilize גבישי formazan כחולים על ידי הוספת 180 μl isopropanol לכל באר. נער על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
- הימנעות מכל משקע, פתרון פיפטה בצלחת 96 היטב ולקרוא בספיגה 575 ננומטר.
4. הכנת Myoblasts להשתלות
- הסר בינוני, לשטוף myoblasts עם HBSS, וtrypsinize תאים כפי שמתואר ב1.1.
- Re-להשעות תאים ב4 מ"ל של מדיום שלם.
- שימוש hemocytometer, ספירת תאים לייצר כרכים המכילים 10 6 myoblasts. פיפטה כרךUme לתוך 1.5 המ"ל microtubes סטריליים. עם יעילות transfection של ~ 10%, ערכים אלה מצביעים על כך שהתאים 100.000 לוציפראז מבטא-ניתנים לאיתור בסורק GE ExploreOptix לאחר השתלה.
- להשיג נפח הזרקה סופית של 15 μl, המכיל 10 6 C2C12 תאים. במידת צורך, סרכזת microtubes ב2000 סל"ד במשך דקה אחת. בזהירות לשאוב supernatant עם פיפטה. Re-להשעות תאים ב15 μl של HG-DMEM FBS החסר.
5. השתלת תאים
- הרדם עכבר עם 2%% isoflurane / 2 O 2. למרוט שיער מאזור האיבר האחורי הגבה. לשמור על הרדמה בשיעור של 1.5%% isoflurane / 2 O 2.
- תבטיח C2C12 myoblasts מושעה היטב. עם העכבר בתנוחת שכיבה, להאריך את האיבר האחורי ולהשתמש במזרק אינסולין להזריק תאים ישירות לתוך הראש לרוחב של שריר הגסטרוקנמיוס בזווית ° 30. הזרק myoblasts transfected לגפה הימנית האחורית וint myoblasts untransfectedo איבר הנגדי (משמאל) האחורי.
- לבצע סריקת פליטת אור בסיסית: מהירות העברת עכבר לבמה בסורק האופטי, נחת העכבר בתנוחת שכיבה. לחבר את קו ההרדמה. כדי להבטיח את העכבר נשאר מורדם, אדם שני צריך להיות נוכח כדי לחבר את קו ההרדמה ואילו במקומות האחרים בחיים של הסורק.
- עדינות להאריך את האיבר האחורי כך אזור ההזרקה גלוי. גפיים אחוריים במקום קלטת עם דבק עדין כגון קלטת רפואית.
- סגור את החדר ולוודא שאין אור יכול לגשת לחלק פנימי של הסורק, שכן דבר יגדיל את אות הרקע זוהתה. הסורק צריך להיות מוגדר לפרמטרים שנכללו בהוראות היצרן שלך עבור הדמית פליטת אור. באופן ספציפי, להבטיח "לא ליזר" נבחר.
- צייר אזור של עניין (ROI) באזור המרוט וסריקת התחלה.
6. הזרקה של תשתית Fluc, D-luciferin, לעכבר MDX
<ol>7. BLI ליעד MPCs לוק מבטא-בעקבות שתל לתוך מודלי עכבר של DMD
- לאחר תקופת הקליטה, להרדים עכבר שוב, כפי שתואר ב 5.1.
- העבר את העכבר חזרה לסורק האופטי ולבצע סריקת פליטת אור אחר, באותו אופן כמו סריקה ברקע.
- למרות תקופת ספיגת דקות 20 אמורה לספק עוצמת אות מקסימלי, סריקה לאחר מכן ניתן לבצע.
- עם השלמת רכישה של תמונה, להקריב את העכבר בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי בעלי החיים המוסדיים ועדת האתיקה שלך והמועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים (CCAC). מבודד את שרירי גפיים אחוריים ואת המקום מיידn 10% פורמלין כדי לתקן לembedment פרפין. בצע צביעת אימונוהיסטוכימיה ללוציפראז לאשר הזרקה לשריר של myoblasts.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
על 50-60% confluency, C2C12 myoblasts היה transfected זמנית עם גן כתב ההיתוך הנ"ל לבנות מורכב מגחלילית לוציפראז [fluc], monomeric אדום ניאון חלבון [mrfp] וsr39 תימידין קינאז [sr39tk] (איור 1 א). יעילות transfection חושבה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (האיורים 1B, C), תוך שימוש ברצף mrfp בכתב שלנו לבנות. שרידות תא לא הושפע על ידי תיוג עם מצע BLI, D-luciferin (1D איור). בעקבות transfection, כ 100.000 myoblasts mrfp מבטא-הושתלו לתוך שריר לתוך שריר הגסטרוקנמיוס של עכברי MDX (נקבע בעבר, כתב יד שהוגש); 100.000 תאי untransfected הושתלו דומה לאיבר האחורי הנגדי כביקורת. השתלת תאים באופן מיידי הבאה, עכברים הוזרק intraperitoneally (IP) עם 150 מ"ג / ק"ג D-lucifeרין. לאחר תקופת ספיגה של ~ 20 דקות, עכברים צלמו בסורק אופטי חיה קטנה (קופסה שחורה GE ExplorOptix כי הוא מצויד לפליטת אור פלואורסצנטי וחי). כפי שהוכיח בעבר, היא במבחנה וספיגה של D-luciferin לאחר השתלה (כתב יד שהוגשה) היה ספציפי לmyoblasts fluc מבטא-, ללא פליטת אור לזיהוי בתאי untransfected (איור 2). אימונוהיסטוכימיה אשרה השתלה תוך שרירית של myoblasts (איור 3)
איור 1 סכמטי של CMV-trifusion כתב מבנה ();. Brightfield / תמונות פלואורסצנציה של C2C12 myoblasts transfected עם כתב פלסמיד trifusion (ב ', ג'); assay MTT להעריך שרידות תא C2C12 בעקבות תיוג עם מצע BLI, D-lucifer ב( ד ').
איור 2. הדמית פליטת אור (BLI). אזור של עניין (ROI) נמשכת להקיף את אזור האיבר האחורי קטף בי myoblasts מוזרק (). פליטת האור אינה מזוהית במהלך סריקה ברקע (B). בגיל 23 דקות לאחר הזרקה של D-luciferin, איתות ברורה מזוהית מאיברו הימני האחורי בי myoblasts וציפראז-לבטא מוזרק. אין פליטת אור מתגלה באיבר האחורי הנגדי הוזרק myoblasts untransfected (C). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
upload/50119/50119fig3.jpg "/>
איור 3. IHC באמצעות נוגדן בלוציפראז גחלילית מאשר השתלה תוך שרירית של C2C12 תאי transfected.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקר זה, שתארנו הדמיה, גישה מולקולרית מהירה ואמינה לגן כתב הלא פולשני myoblasts היעד / MPCs לאחר השתלה. בעוד מחקר זה מדגים את הלוקליזציה לטווח קצר של MPCs המושתל באמצעות bioluminescense הדמיה (BLI), אופן שבו תאים ממוקדים יכול, למעשה, להיות מיושם בקלות להערכת אורך של engraftment תא, באמצעות השתלה של תאים שמבטאים יציבות גן הכתב. לשם כך, הקבוצה שלנו נוצרה קווי עכבר מהונדסים כי נמל גן הכתב האחיד. רק תאים המבטאים את גן הכתב להתחמצן D-luciferin לייצר פוטונים להדמיה באמצעות BLI. מאז חמצון של D-luciferin תלוי בביטוי גנים, מדוברת בטכנולוגיה רבה עצמה שבה להלא פולשני תאים מושתלים קיימא תמונה. רקמת שריר שנקטפה מעכברים מהונדסים אלה ותאי לווין (SCS) בודדו באמצעות FACS אכן יכולה להיות targeteד לאחר השתלה לעכברי MDX. בנוסף, נוכל לעקוב אחר סטטוס ההתמיינות שלהם באמצעות השימוש במקדם שרירים ספציפיים, מגביר עוד יותר את התועלת והחשיבות של טכנולוגיות הדמיה מולקולריות, כמו שהוצג במסמך זה, בתחום מחקר DMD (כתב יד שהוגשה). בנוסף למהירות שלה והעלות נמוכה, BLI אינו רעיל, מה שהופך אותו לבחירה אטרקטיבית עבור הדמיה תכופה של בעלי חיים קטנים. תכונה זו, כמו גם סגולית הגבוהה שלה, תהיה יקרה בזיקוק טיפולים חלופיים ובהיצמדות למודלים למחלות טרום קליניים של ניוון שרירים דושן לפני קידום המחקרים קליניים החלימו-המעורבים טכנולוגיות כגון PET.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
סופרים אין לי מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לסנג'יב Gambhir על המתנה של גן כתב fluc/mrfp/sr39tk. עבודה זו מומנה על ידי רשת לתאי הגזע (SCN) של קנדה, וקרן מסעו של ג'סי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C2C12 myoblasts | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Life Technologies | 12800-017 | |
| fetal bovine serum | Life Technologies | 12483020 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-72 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Nikon Eclipse TE2000-5 | Nikon Instruments Inc. | ||
| Xenolight D-luciferin | PerkinElmer | 122796 | 40 mg/ml in PBS |
References
- Emery, A. E.
- Blake, D. J., et al. Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle. Physiol. Rev. 82, 291-329 (2002).
- Goldring, K., Partridge, T., Watt, D.
- Partridge, T. A. Cells that participate in regeneration of skeletal muscle. Gene Ther. 9, 752-753 (2002).
- Moss, F. P., Leblond, C. P. Satellite cells as the source of nuclei in muscles of growing rats. Anat. Rec. 170, 421-435 (1971).
- Snow, M. H. An autoradiographic study of satellite cell differentiation into regenerating myotubes following transplantation of muscles in young rats. Cell Tissue Res. 186, 535-540 (1978).
- Kuang, S., Rudnicki, M. A. The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential. Trends Mol. Med. 14 (2), 82 (2008).
- Hoffman, E. P., et al. Characterization of dystrophin in muscle-biopsy specimens from patients with Duchenne's or Becker's muscular dystrophy. N. Engl. J. Med. 318, 1363-1368 (1988).
- Ray, P., Tsien, R., Gambhir, S. S. Construction and validation of improved triple fusion reporter gene vectors for molecular imaging of living subjects. Cancer Res. 67 (7), 3085 (2007).
- Ray, P., et al. Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects. Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new lights. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
- Sicinski, P., et al. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science. 244, 1578-1580 (1989).
- Mattson, M. P. Pathogenesis of neurodegenerative disorders. In: Contemporary neuroscience. X, Humana. Totowa, NJ. 294 (2001).
- Andersson, J. E., Bressler, B. H., Ovalle, W. K. Functional regeneration in hind limb skeletal muscle of the mdx mouse. J. Muscle Res. Cell Motil. 9, 499-515 (1988).
