Summary
כדי לפענח את המנגנונים המולקולריים שבבסיס המוקדם סרטן ערמונית ייזום, רומן ומערכות מודל אדם חדשניים וגישות הם זקוקים נואשים. הפוטנציאל של טרום ערמונית ואברי המין סינוס mesenchyme (UGSM) כדי לגרום לאוכלוסיות תאי גזע pluripotent כדי ליצור אפיתל ערמונית אנושי הוא כלי רב עוצמה במחקר ניסיוני ערמונית.
Abstract
התקדמות במחקר סרטן הערמונית היא מוגבלת מאוד על ידי הזמינות של מערכות מודל אדם נגזרות והורמונים נאיביים, המגבילות את היכולת שלנו להבין את האירועים גנטיים ומולקולריים העומדים בבסיס מחלה ייזום ערמונית. לקראת פיתוח מערכות מודל טוב יותר ללימוד ערמונית אנושית סרטן, אנחנו ואחרים ניצלו את פוטנציאל אינדוקטיבי פרו ערמונית הייחודי של המכרסם העוברי ערמונית stroma, כינה ואברי המין סינוס mesenchyme (UGSM). כאשר recombined עם אוכלוסיות תאי pluripotent מסוימות, כגון תאי גזע עובריים, UGSM גורם להיווצרותו של אדם נורמלי ערמונית epithelia באופן תלוי בטסטוסטרון. מערכת כזו מודל אנושית יכולה לשמש כדי לחקור באופן ניסיוני ולבחון את היכולת של גני רגישות לסרטן ערמונית מועמד בקצב מואץ בהשוואה למחקרים מהונדסים מכרסמים טיפוסיים. מאחר ותאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) יכולים להיות מהונדסים גנטי בתרבות usinביטוי גנים מושרה G או siRNA עקום למטה וקטורים שקדמו לרקומבינציה רקמות, מודל כזה מאפשר בדיקת ההשלכות התפקודיות של גנים, או שילובים של גנים, אשר נחשבים כדי לקדם או למנוע היווצרות סרטן.
הטכניקה של בידוד אוכלוסיות טהורות של תאי UGSM, לעומת זאת, הוא מאתגר ולמידה לעתים קרובות דורשת מישהו עם מומחיות קודמת ללמד באופן אישי. יתר על כן, חיסון של תערובות תאים תחת הקפסולה הכליות של מארח immunocompromised יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית. כאן אנו מתארים וממחישים בידוד נכון של UGSM מעוברי מכרסמים והשתלת הכליה כמוסה של תערובות רקמות כדי ליצור אפיתל ערמונית אנושי. גישה כזו, בשלב הנוכחי שלה, דורשת in vivo xenografting של תאי גזע עובריים, שעלולים להיות יישומים עתידיים יכולים לכלול בהיווצרות בלוטת מבחנה או את השימוש של אוכלוסיות תאי גזע pluripotent מושרה (iPSCs).
Introduction
יש צורך עצום במערכות מודל אנושיות טובות יותר של סרטן הערמונית. בפרט, מערכות מודל אדם רלוונטיות של רקמות ערמונית נורמליות, שאינם ממאירות אשר ניתן מניפולציות גנטית כדי להבחין את התפקיד של גנים ספציפיים באופן ישיר בייזום של סרטן הערמונית היינו להיות אינפורמטיבי מאוד. כניסתו של העידן הגנומי זיהתה מספר רב של גנים שעשויים להיות תפקיד בהיווצרות הסרטן. חוסר מערכות מודל ניסיוני אדם, לעומת זאת, קשה פוגע ביכולת שלנו כדי לבחון בחינה התפקודית ולאפיין גני רגישות לסרטן ערמונית מועמד. מערכת מודל אידיאלית תהיה להקל על הניתוח הפונקציונלי המהיר ומהיר יותר של גני רגישות לסרטן בשילוב עם מערכות מודל מכרסמים מהונדסים מתאימות. יתר על כן, מערכת מודל אנושית כזה תאפשר אפיון מולקולרי של מנגנוני האיתות של ערמונית היווצרות הסרטן לעבר הגילוי והאימות של טיפולים חדשניים ללמנוע היווצרות סרטן הערמונית.
תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) מסוגלים להרכיב רקמות ערמונית אדם כxenografts. בשנת 2006 טיילור, et al. דיווח כי יכול להיגרם hESCs כדי ליצור epithelia ערמונית in vivo כשמחדש בשילוב עם מכרסמים ואברי המין סינוס mesenchyme (UGSM) בתוך פרק זמן של 8-12 שבועות. 1 מחקרים אלה התבססו על עבודה קודמת של המעבדה Cunha מראה כי UGSM עוברי המכרסמים יכולה לקדם את הבידול של הערמונית של תאי גזע ואוכלוסיות תאי אפיתל עובריים in vivo. 2,3 הערמונית מתפתחת מanlagen עוברי נקרא סינוס ואברי המין (UGS), ולפני 17 יום העוברי (עכבר E17 ; יום E18 בחולדה) ניתן להסיר את UGS ומחולק פיזי לתוך האפיתל (UGSE) וmesenchyme (UGSM) 4 גישת רקומבינציה רקמה זו שיפרה את ההבנה של התפתחות סרטן הערמונית ו, בפרט שלנו באופן משמעותי.גורם ly צמיחה ומסלולי איתות הורמונליים ואת מערכות יחסים בין מולקולריים ערמונית סטרומה והאפיתל. 5-8 שיטה זו כרוכה בשילוב vivo לשעבר של UGSM עם גזע או תאי האפיתל מאותם מינים או מובחנים וrecombinants הסלולרי / רקמה אלה מושתלים וגדל וxenografts בתוך מארח עכבר. 4,9 לאחר תקופה של צמיחה בvivo, השתל מכיל מבני בלוטות אפיתל ערמונית משובצים ברקמת סטרומה. ניתן לבצע צביעה נוספת כדי לקבוע אם מבנים כאלה הם באמת של הערמונית והוא המעשה ידי האדם. 10,11
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקר זה בוצע בהתאם קפדן עם ההמלצות במדריך לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה של המכון הלאומי לבריאות. הפרוטוקול אושר על ידי האוניברסיטה של טיפול בבעלי חיים מוסדי ועדת שימוש שיקגו (IACUC, מספרים והפרוטוקול 72,066 72,231). כל הניתוח בוצע תחת הרדמה, וכל המאמצים שנעשו כדי למזער את הסבל. תאי הגזע העוברי האנושי הקו WA01 (H1; NIH-רישום # 0043) נרכש מWiCell (מדיסון, ויסקונסין) ותרבותי באמצעות פרוטוקול מזין עצמאי באמצעות mTeSR1 תקשורת (תאי גזע טכנולוגיות; ונקובר, BC). תאי גזע עובריים שמשו בתוך עשרה קטעים של הפשרה.
1. בידוד של סינוס ואברי המין מעוברי עכברים או עכברוש
- להרדים את העכבר מתוזמן בהריון (17.5 יום) או עכברוש (יום 18.5) על ידי שאיפה של CO 2 למשך 5 דקות. מוות הוא אושר על ידי הפסקה של סימנים חיוניים בחולדה. ואז לשבור את צווארו אנושי. Rבהוא מורדמים בשלב זה. לרסס 70% אתנול לחיטוי העור ואגפי הבטן. חותכים את עור הבטן ושכבות שרירים ולאחר מכן לחתוך את הרחם, להפריד את עוברי עכברים מהשק מי השפיר, ולחתוך את חבל הטבור. מעבירים את העוברים לתוך צינור פלקון 50 מ"ל המכיל תמיסת מלח מאוזנת של האנק הקר כקרח (HBSS) ולשמור על קרח. עוברים מומתים על ידי עריפת ראש עם מספריים כירורגיות.
- הנח את העובר בצלחת פטרי 100 מ"מ. לחצות את העובר עם מספריים ברמה של הטבור (איור 1 א). הסר את הקיבה ומעי הדק. לחשוף את השחלות בנקבת העובר והאשך בעובר הזכר (איור 1 ו1C). (השחלות נמצאות בקטבים הזנב של הכליות. האשכים הם בערך ברמה של שלפוחית השתן). בשלב התפתחותי זה, UGSM מבודד משני העוברים ממין זכר ונקבה הם מסוגלים גרימת שושלת האפיתל של הערמונית בנוכחותו של מארחטסטוסטרון. 4 אחרי נקודת הזמן ההתפתחותי הזה, לעומת זאת, בלוטות ערמונית מתחילות לגבש לUGSM, והבידוד של UGSM הטהור הוא מאוד מאתגר. 4
- תחת המיקרוסקופ לנתיחה, לחתוך את דופן הבטן בקו האמצע עם מספריים Vannas כדי לחשוף את שלפוחית השתן והדופן אחורי של הבטן. דרכי המין העליונות החופשית מקבצים מצורפים (בעוברים ממין זכר, לחתוך את השופכן, Wolffian הצינור וצינור Müllerian; בעוברים ממין נקבה, לחתוך את השופכן וMüllerian הצינור). לשחרר את שלפוחית השתן מחבל הטבור. לחתוך עצם ערווה ונפרד בבוטות מהקיר הקדמי של סינוס ואברי המין עם מלקחיים קצה קנס דומונט. לבסוף, להפריד את הקיר האחורי של סינוס ואברי המין מפי הטבעת. חותכים את סינוס ואברי המין עם השלפוחית בקצה התחתון (מהשופכה) ולאחסן את סינוס כמקשה אחת ואברי המין (עם שלפוחית השתן) בHBSS הקר כקרח.
2. הפרדת mesenchyme סינוס ואברי המין
- העבר את סינוס ואברי המין לצינור פלקון המכיל טריפסין 1% בסידן (Ca 2 +) ומגנזיום (Mg 2 +) HBSS חינם. מניחים את הצינור במקרר ב 4 מעלות צלזיוס למשך 75 דקות.
- הסר את טריפסין ולנטרל trypsinization עם 10% עוברי בובין סרום (FBS) בDMEM/F12 בינוני.
- להקניט בזהירות את שרוול mesenchymal הדביק מצינור אפיתל עם מחט או מלקחיים קצה קנס דומון (שמירה על שלמות צינור אפיתל מפחית את הסיכוי לזיהום תאי אפיתל של mesenchyme, זה יכול לגרום לבלוטות מכרסמים ויצר יחד עם הגזע אנושי שלך תאים שמקורם אפיתל בלוטות) (1D איור). 12
- העבר UGSM לתוך צינור חדש פלקון המכיל DMEM/F12 בינוני + 10% FBS + 1% פניצילין / סטרפטומיצין (עט / סטרפטוקוקוס; 0.5 מ"ג / מ"ל) + 1% חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA) בתוספת 1nm R1881. Plאייס הצינור באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 למשך הלילה.
- צנטריפוגה ב XG 200 רקמות וזורקים supernatant. לשטוף עם פוספט חיץ מלוח (PBS) (נא לא להפריע רקמת גלולה).
- הוסף collagenase 0.2% (בDMEM/F12) מחדש להשעות את הרקמות. דגירה של 37 ° C עם נדנדה עדינה במשך שעה 1.
- במרץ מערבולת רקמת העיכול שלוש פעמים עד שהוא הופך תערובת הומוגנית מתא בודד ולהוסיף DMEM/F12 בינוני + 10% FBS 1% + P / S 1% + + NEAA 1nm R1881 לנטרל collagenase.
- צנטריפוגה ב XG 200 ולאחר מכן לשטוף מחדש על ידי השעיית-תאי UGSM בHBSS, וחזור שלוש פעמים לשטוף את UGSM באופן מלא. לבסוף להשעות תאי mesenchymal בDMEM/F12 ולספור את התאים באמצעות hemocytometer או מכשיר ספירת תאים.
- לנתק את תאי הס פרוטוקול ללא מזין באמצעות תרבותי עם mTeSR1 תקשורת (גזע טכנולוגיות סלולריים, ונקובר, BC) באמצעות עיכול Accutase (Millipore; Billerica, MA). שטוף את תאי הסבשלב היומן של הצמיחה שלהם בDMEM/F12 תקשורת חמה, ואז מוסיף פתרון Accutase 1x חם, ודגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך 15-20 דקות עד שתאים בודדים הם ניתקו באופן אחיד ממושבות. הוסף כמות שווה של 1x מוגדר טריפסין מונעי (Invitrogen; גרנד איילנד, ניו יורק) כדי לנטרל את Accutase ופיפטה בעדינות מעלה ומטה כדי לערבב ולשבור את גושי תאים. תאי פיפטה לתוך צינור צנטריפוגות וצנטריפוגות במשך 3 דקות ב 200 XG, מחדש להשעות תא גלולה בDMEM/F12 תקשורת. צנטריפוגה צינור 3 דקות ב 200 XG שוב ולהסיר את supernatant, ולאחר מכן מחדש להשעות בHBSS הקר או DMEM/F12 בנפח רצוי.
- הוסף תאי הס עם יחס של 1:2.5 הס / תאי mesenchymal. 3 זה יהיה הרכב תאי של 5 תאי UGSM 1E עם 4 hESCs 4E להזרקת 10 מ"ל (חולדה אחת UGS בדרך כלל תשואות על 6 תאי mesenchymal 2E). צנטריפוגה ב XG 200 במשך 5 דקות ולאחר מכן לבטל את supernatant. Re-להשעות עם 75% Matrigel (BD Biosciences,סן חוזה, קליפורניה, מעורבב עם 25% HBSS הקר לטיפול קל יותר) ולמקם את הצינור בקרח להזרקה תת הקפסולה כליות.
3. השתלה של רקמות רקומביננטי מתחת לקפסולת הכליה
- הכן את אזור ניתוח סטרילי.
- הרדימי עכבר עירום athymic גברי עם ה-IP של קטמין / xylazine; להשתמש בתערובת טריות המכילה יחס 1:01:08 של קטמין: xylazine: מלוחה. מינון יהיה קטמין מ"ג / ק"ג 100 ו2.5 Xylazine מ"ג / ק"ג. בעלי חיים שאינם מגיבים לבוהן קמצוץ צריכים להיות באופן מלא תחת במשך 20-30 דקות.
- ניתוח להכין את העכבר על ידי גילוח האתר כירורגית (אם לא משתמש בעכבר בעירום), ניקוי עם שלושה מגבונים מתחלפים של אלכוהול 70% ואחריו התמיסה פולידין ויישום וילון כירורגית.
- לשים משחה לחות העין (משחת עיני Altalube) לעיניו של העכבר כדי למנוע התייבשות במהלך הרדמה.
- במהלך ניתוח, קצב נשימה וטמפרטורת גוף ליבה של העכברים מנוטרים. את קצב הנשימה should להיות יציב ונשמר בתוך 40-90 נשימות / דקה. טמפרטורת גוף ליבה היא פיקוח עם תצפית של הצבע של הריריות והכפות ורודות של כפות רגליים.
- הפוך ס"מ חתך בגב עור אורך זמן 1.0. תמשיך לחתוך את דופן הבטן בחתך אורכי 0.5 ס"מ.
- לוחץ בעדינות את הכליה מתוך הבטן ולשמור על לחות פני השטח הכליות באמצעות טיפות של תמיסת מלח סטרילית.
- בעדינות לנקב את הקפסולה הכליות באמצעות מחט מזרק 27 מד ריק. לנקב רדוד מאוד מספיק. זה יהיה איפה אתה מכניס מחט הקהה להזריק התערובת הסלולרית שלך.
- מלא מחט מזרק בוטה 28 מד עם 10 μl של התערובת הסלולרי שלך. לאט לאט להכניס את האתר לנקב ולחדור parenchyma הכליות להגיע לאזור שמתחת הקפסולה הכליות. הזרק 10 μl של התערובת הסלולרית כדי ליצור בולוס על הכליות מתחת הקפסולה הכליות. נסיגת המחט.
- להחזיר את הכליות לעבדוחלל minal. אבטח את השכבה השרירית של הצפק עם תפרי ניילון 4-0.
- סגור את העור עם או תפר או סיכות.
- יש לנקות את הדם מהעור באמצעות תמיסת מלח סטרילית.
4. שיכוך כאבים שלאחר ניתוח וניטור
- הזרק את החיה עם עצירות (0.1 מ"ג / ק"ג בכל שעה 12) או ketoprofen (3-5 מ"ג / ק"ג בכל שעה 12 מלוחה) לטיפול בכאב שלאחר ניתוח, ו1 מ"ל של 37 מעלות צלזיוס IP מלח כדי לשמור על בעלי החיים חמים ולמנוע התייבשות.
- שים את בעל החיים בכלוב נקי והנח אותו על כרית חימום קלה.
- שלח את בעלי החיים בחזרה לחדר של חיה ברגע שהם יחזרו להכרה ונעים בתוך הכלוב.
- שים לב לבעלי החיים מדי יום לסימנים בלתי צפויים של מחלה ודלקת בשלושת הימים הבאים. העכברים מנוטרים עם תצפית של פעילות בכלובים כוללים מזון ומים הניגשים יום 1 לאחר הניתוח. אם העכברים להציג פעילויות פחות, Ketoprofen הוא intraperitoneally מודעהכהן שוב פעם ביום.
- הסר את הסיכות או תפרים עור 2 שבועות לאחר ניתוח.
- ניתן לקצור רקמות xenograft מוקדם ככל 8 שבועות לאחר ניתוח. ניתן הדמיה xenografts in vivo באמצעות אולטרסאונד של חיות קטנות (איור 2 א), ורקמות קבועות יכולות להיות מחולק ומוכתמות לחלבונים שונים באמצעות אימונוהיסטוכימיה (איור 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בונה על הדו"ח המרגש על ידי טיילור, et al., המעבדה שלנו פיתחה פרוטוקול engrafting באמצעות H1 הנפוץ (NIH המיועד WA01, גנטי גברי) שורת תאי גזע עוברית אנושית. 1 קו זה נבדק בקפדנות על בקרת איכות ו הוא karyotypically רגיל 13 כאשר בתרבית כראוי, יכולים להישמר תאי הס, הרחיב, וcryopreserved במצב מובחן וpluripotent באמצעות שיטת תרבות מזין חינם (מערכות מזין ללא מסחרי זמינות דרך גזע טכנולוגיות תא; ונקובר לפני הספירה).. 14 פרוטוקול מעסיק השעיות תא בודדות של hESCs בשילוב עם השעיות תא בודדות של UGSM החולדה E18 ומוזרק תחת הקפסולה הכליות של עכברי immunocompromised זכר בוגרים. כפקדים חשובים, USGM מושתל לבד מניבה אין צמיחה נראית לעין, ואילו hESCs מושתל ללא teratomas גדול טופס UGSM (איור 2). 15 מהניסיון, השתל שלנו זמני של UGSM בלי לזהם תאי האפיתל חולדה לעולם תוצאות בצמיחה של רקמה, ואילו רקומבינציה של UGSM בתוספת תוצאות hESCs בצמיחה חזקה יותר מ -80% מהזמן (לאחר 8 שבועות מגוון גדלים מ - 1 מ"מ עד 5 מ"מ, עם מעל 80% מהרקמה המכיל אפיתל בלוטות). בrecombinants המכיל שני hESCs וUGSM, היווצרות בלוטות מוקדמת הוא ציין לאחר 4 שבועות, ולאחר 8 שבועות נוצרו באופן מלא, אנטיגן הספציפי לערמונית (PSA) חיובי אפיתל ערמונית אנושי מעוצב (איור 3). בלוטות אלה מכילים קולט האנדרוגן (AR) חיוביים ל-תאי luminal-הפרשה שאינם נוכחים שבוע לאחר סירוס מארח. חשוב לציין, בלוטות אלה הן חיוביות עבור אדם הספציפי וספציפי לערמונית החלבון PSA. מסמכים מכתים נוספים המופיעות בלוטות אדם כזה להיות בלתי ממאיר שכן הם אינם מבטאים Alpha-methylacyl-CoA racemase (AMACR), אשר מהווה סמן ספציפי לסרטן ערמונית. 16
ether.within עמודים = "תמיד"> 
איור 1. בידוד של סינוס ואברי המין העובר מחולדה E18.5. עובר א E18.5 חולדה. הקו המוצק הלבן מציין את המיקום כדי לחצות את העובר. עובר חולדת זכר B. E18.5. הקווים המקווקווים השחורים מצביעים על שלפוחית השתן, סינוס ואברי המין, פי הטבעת, אשכים ומתפתחים. עובר נקבת עכברוש ג E18.5. הקווים המקווקווים השחורים מצביעים על שלפוחית השתן, הרחם וסינוס ואברי המין. ד שלפוחית השתן ואברי מין סינוס הוסר מן העובר החולדה E18.5. הקו המוצק ואילו מציין את המיקום כדי להסיר את שלפוחית השתן. הקו המקווקו השחור והחץ לבן מצביעים על צינור אפיתל. ראש החץ הלבן מצביע mesenchyme סינוס ואברי המין.
7/50327fig2.jpg "alt =" איור 2 "עבור: תוכן-width =" 4in "עבור: src =" / files/ftp_upload/50327/50327fig2highres.jpg "/>
איור 2. ההדמיה אולטראסאונד ומורפולוגיה ברוטו של הרקמות בxenografts vivo נגזר מUGSM וhESCs. ההדמיה אולטראסאונד א xenografts הגובר לאפשר ניתוחים ביצורי חיים במהלך הניסוי. תמונה נתפסה 8 שבועות לאחר ניתוח באמצעות אולטרסאונד חיה Vevo 2100 קטן (Visualsonics; טורונטו, ב). . הקיף שטח מייצג את xenograft הרקמה צומח על פני השטח הכליה ב 'בנקודת סיום הניסוי, בשילוב עם תאי הס UGSM העכברוש (rUGSM) יוצרים מסת רקמה גלויה על פני השטח הכליות (פנל משמאל); תאי הס מושתלים לבד בצורת teratomas גדול כמו צפוי (פנל באמצע); וUGSM המושתל לבד לא מצליח ליצור בכל מבנה ניתן להבחין (פנל מימין).
"Alt =" jpg איור 3. "עבור: = תוכן ברוחב" 6in "עבור: src =" / files/ftp_upload/50327/50327fig3highres.jpg "/>
איור 3. היווצרות של אדם ערמונית epithelia מתאי הגזע העובריים האנושי קו WA01 (H1). תאי גזע עובריים הייתה recombined עם UGSM מכרסמים ומושתל מתחת לכמוסת הכליה של עכברי עירום גבריים ללא פגע. לאחר תקופת צמיחה של 8 שבועות, אפיתל בלוטות ערמונית אדם נוצר כפי שתועד על ידי AR, p63, ומכתים PSA האנושי מוגבל. בשבוע שלאחר סירוס מארח אחד, שכבת AR-חיובית, PSA-החיובית luminal אינו נוכחת, המתעד אנדרוגן תלות אופיינית. רקמות ערמונית הן שאינן ממאירות כפי שהודגמו על ידי חוסר מכתים AMACR. בנוסף לכך, תאים נוירואנדוקריניים אגודה לזכר שואה חיובי היו לגילוי. רקמת ערמונית אנושית ללא ממארת שימש כביקורת לAR, PSA, וp63; גידול בערמונית שימש כביקורת חיובית לAMACR סרטן ספציפי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
רקומבינציה רקמות באמצעות UGSM היא טכניקה שימושית להפליא כדי לחקור את התפתחותו של סרטן הערמונית ואת האירועים המולקולריים מובילים לייזום סרטן הערמונית. הפוטנציאל אינדוקטיבית של UGSM שימש במשך מספר רב של יישומים בערמונית מחקר, אלה כוללים גידול שיפור לקחת משורות תאי ערמונית וגידולים, חקר אינטראקציות סטרומה-אפיתל, ויוצרים recombinants הערמונית בין מינים 7,17-20 הכנה נכונה של UGSM. , לעומת זאת, הוא קריטי להצלחת ניסוי כזיהום האפיתל מכרסם יגרום להיווצרות בלוטות ויכול לבלבל את התוצאות. לכן, ההפרדה של UGSM מUGSE (שלב 2.4) היא ללא ספק הצעד מסובך ביותר וגם הקריטי ביותר בפרוטוקול. כדי לשלוט על זיהום כזה, מומלץ לשימוש בטכניקות להבחין בין מינים בחום, כמו גם זרוע ניסוי נוספת באמצעות UGSM לבד לתעד אין היווצרות בלוטות מcellulaמזהמים. r 12
ההתפתחות האחרונה של חומרים כימיים culturing הס מזין ללא ושיטות לאפשר תאי הס אוכלוסיות טהורים להיות מתורבתים, מורחב וcryopreserved. 14 יתר על כן, השימוש המורחב של משלוח גן lentiviral מאפשר התאגדות הגנומי היציבה וביטוי של גנים של עניין. 21,22 התקדמות משולבת אלה מאפשר למניפולציה הגנטית של תרבויות הס טהורות ו, בשילוב עם הפוטנציאל אינדוקטיבית של UGSM העוברית של הערמונית, יאפשר בדור vivo של בלוטות ערמונית אדם לבטא גנים ספציפיים של עניין. יתר על כן, טכניקה זו תהיה מקובל שורות תאי גזע pluripotent מושרה (iPSCs) הנגזרות ממארחים מבוגרים ומתאים גנטיים שונים. 23,24 שימוש בחלבונים מוגדרים, אנו מראים כי אפיתל ערמונית אדם hESC הנגזרות כזה נראה מאוד דומה למבוגרים אדם ערמונית epithelia, אבל ברמה מולקולרית עולמית שם הוא בטוח יהיהכמה הבדלים בביטוי הגנים שצריכים להילקח בחשבון. כדי להסביר זאת, חוקרים צריכים להשתמש בגודל מדגם מורחב ולשקול microdissection לייזר לכידה (LCM) המבוססות על גישות ופלטפורמות ביטוי גנים השוואתיות ניתוחים כדי לאמת את הפרופילים המולקולריים של הרקמות שלהם בהשוואה לרקמות אדם בוגרות. עם זאת, היווצרות של אפיתל בלוטות ערמונית האנושי באמצעות שורת תאי גזע סדרה תרבותית וללא מזין יש פוטנציאל להקל על מחקרים מולקולריים רבים הנוגעים לתפקוד ערמונית וייזום הסרטן.
הטכניקה שלנו מנצלת השעיות תא בודדות של שניהם UGSM וhESCs, המאפשר שימוש של זיהום וזרימת lentiviral מיון גישות, כמו גם שליטה מדויקת יותר של כמויות סלולריות. זה יכול, עם זאת, יקטין את הפוטנציאל של UGSM אינדוקטיבי. גישה חלופית הייתה להשתמש UGSM הלא ניתק (לאחר שלב 2.5), לפני עיכול collagenase)וגם דגירה ישירה עם תאי גזע עובריים או תאי הטבעה בתוך פתרון קולגן. 4 להשתיל רקמות אלה תחת הקפסולה הכליות, טכניקה חלופית תהיה לעשות חתך בכמוסת הכליות, ליצור כיס קטן מתחת לכמוסת הכליה על גבי של הכליה, ופיזי למקם את מסת התאים בתוך הכיס ש. 4,20
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש החוקרים שאין ניגוד עניינים עם עבודתו הוצגה.
Acknowledgments
אנו רוצים לציין את התמיכה של האוניברסיטה שיקגו סעיף לאורולוגיה בראשותו של ד"ר אריה להב, ומנהל מחקר אורולוגית ד"ר קארי רינקר-שפר. אנחנו גם רוצים להכיר את התמיכה מאוניברסיטת המרכז לסרטן של שיקגו (UCCCC) בראשות של ד"ר מישל Le Beau. אנחנו גם עם להודות לסיוע טכני מומחה של מתקן הרקמה האנושי מרכז משאבי ליבה בראשות ד"ר מארק Lingen, וסיוע של לזלי מרטין ומרי ג'ו פקטה. אנו מודים גם מתקן Core אימונוהיסטוכימיה מנוהל על ידי טרי לי. עבודה זו מומנה על ידי אוניברסיטת שיקגו מחלקה לכירורגיה, אורולוגיה של סעיף; האגודה אמריקנית לסרטן מוסדי מענק מחקר (ACS-IRG, # IRG-58-004); מרכז סרטן התמיכה גרנט (P30 CA14599); Brinson קרן; קרן אלווין באום המשפחה; אוניברסיטת שיקגו דירקטוריון קרן לחקר סרטן של הנשים; ס Kregel נתמך על ידי HHMI: עמיתי מד ל- גראדירך (56006772) וסרטן הביולוגיה הדרכה גרנט (T32-CA09594). לבסוף, ברצוננו להודות לרוברט קלארק, ד"ר VenkateshKrishnan, ונתן Stadick להערכה הביקורתית של כתב היד שלהם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | GIBCO | 14170 | |
| DMEM/F12 | GIBCO | 11330 | |
| R1881 | Sigma | 965-93-5 | Mix to 1 ug/ml in Ethanol (1,000x stock) |
| NEAA | GIBCO | 11140 | |
| Pen-Strep Solution | GIBCO | 15070 | 100x stock |
| Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| KETASET (ketamine hydrochloride) | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-2013-01 | 100 mg/ml; dilute 1:10 in sterile saline |
| AnaSed (xylazine) | VET-A-MIX, Inc. | NADA 139-236 | 20 mg/ml; dilute 1:10 in sterile saline |
| Trypsin | BD Biosciences | 215240 | |
| Collagenase | Sigma | C2014 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge | NDC 0856-4396-01 | 100 mg/ml; dilute 1:1,000 in sterile saline |
| Altalube eye ointment | Altaire Pharmaceuticals, Inc. | NLC 56641-19850 | |
| Leica MZ16 F Stereomicroscope | Leica | Any good dissecting scope can be used. | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Syringe | Hamilton | 84855 | |
| Hamilton Needle, Small RN, 28 gauge, 0.5inches, Point Style #3 (Blunt) | Hamilton | 7803-02 | Custom Needle |
| Ethanol Prep Pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | |
| Sterile Gauze Pads | Fisher Scientific | 22-415-469 | |
| Ethicon Vicryl Suture (4-0 FS-2) | MedVet International | J392H | Needle-in, dissolvable suture |
| Autoclip 9 mm Wound Clips | Becton Dickenson | 427631 | |
| PVP Iodine Prep Pads | Fisher Scientific | 06-669-98 | |
| Dissector scissor with blunt end | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Dumont fine tip forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Needle holder with Scissor | Fine Science Tools | 12002-14 |
References
- Taylor, R. A., et al. Formation of human prostate tissue from embryonic stem cells. Nat. Methods. 3, 179-181 (2006).
- Cunha, G. R., Chung, L. W. Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice. J. Steroid Biochem. 14, 1317-1324 (1981).
- Cunha, G. R., Chung, L. W., Shannon, J. M., Taguchi, O., Fujii, H. Hormone-induced morphogenesis and growth: role of mesenchymal-epithelial interactions. Recent Prog. Horm. Res. 39, 559-598 (1983).
- Staack, A., Donjacour, A. A., Brody, J., Cunha, G. R., Carroll, P. Mouse urogenital development: a practical approach. Differentiation. 71, 402-413 (2003).
- Cunha, G. R., et al. Normal and abnormal development of the male urogenital tract. Role of androgens, mesenchymal-epithelial interactions, and growth factors. J. Androl. 13, 465-475 (1992).
- Cunha, G. R., et al. Growth factors as mediators of androgen action during the development of the male urogenital tract. World J. Urol. 13, 264-276 (1995).
- Aboseif, S., El-Sakka, A., Young, P., Cunha, G. Mesenchymal reprogramming of adult human epithelial differentiation. Differentiation. 65, 113-118 (1999).
- Marker, P. C., Donjacour, A. A., Dahiya, R., Cunha, G. R. Hormonal, cellular, and molecular control of prostatic development. Dev. Biol. 253, 165-174 (2003).
- Cunha, G. R., Sekkingstad, M., Meloy, B. A. Heterospecific induction of prostatic development in tissue recombinants prepared with mouse, rat, rabbit and human tissues. Differentiation. 24, 174-180 (1983).
- Van der Griend, D. J., et al. The Role of CD133 in Normal Human Prostate Stem Cells and Malignant Cancer Initiating Cells. Cancer Res. 68, 9703-9711 (2008).
- Van der Griend, D. J., Konishi, Y., De Marzo, A. M., Isaacs, J. T., Meeker, A. K. Dual-label centromere and telomere FISH identifies human, rat, and mouse cell contribution to Multispecies recombinant urogenital sinus xenografts. Prostate. , (2009).
- Vander Griend, D. J., Konishi, Y., De Marzo, A. M., Isaacs, J. T., Meeker, A. K. Dual-label centromere and telomere FISH identifies human, rat, and mouse cell contribution to Multispecies recombinant urogenital sinus xenografts. Prostate. 69, 1557-1564 (2009).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat. Methods. 3, 637-646 (2006).
- Prokhorova, T. A., et al. Teratoma formation by human embryonic stem cells is site dependent and enhanced by the presence of Matrigel. Stem Cells Dev. 18, 47-54 (2009).
- Hameed, O., Sublett, J., Humphrey, P. A. Immunohistochemical stains for p63 and alpha-methylacyl-CoA racemase, versus a cocktail comprising both, in the diagnosis of prostatic carcinoma: a comparison of the immunohistochemical staining of 430 foci in radical prostatectomy and needle biopsy tissues. Am. J. Surg. Pathol. 29, 579-587 (2005).
- Wang, Y. A human prostatic epithelial model of hormonal carcinogenesis. Cancer Res. 61, 6064-6072 (2001).
- Yao, V., Parwani, A., Maier, C., Heston, W. D., Bacich, D. J. Moderate expression of prostate-specific membrane antigen, a tissue differentiation antigen and folate hydrolase, facilitates prostate carcinogenesis. Cancer Res. 68, 9070-9077 (2008).
- Cunha, G. R., Cooke, P. S., Kurita, T. Role of stromal-epithelial interactions in hormonal responses. Arch. Histol. Cytol. 67, 417-434 (2004).
- Xin, L., Ide, H., Kim, Y., Dubey, P., Witte, O. N. In vivo regeneration of murine prostate from dissociated cell populations of postnatal epithelia and urogenital sinus mesenchyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, Suppl 1. 11896-11903 (2003).
- Yu, X. Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells. Mol. Ther. 7, 827-838 (2003).
- Anderson, J. S., Bandi, S., Kaufman, D. S., Akkina, R. Derivation of normal macrophages from human embryonic stem (hES) cells for applications in HIV gene therapy. Retrovirology. 3, 24 (2006).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3, 340-345 (2008).
