Summary
Prostat kanseri başlangıcı, yeni ve yenilikçi insan model sistemler ve yaklaşımlar altında yatan en erken moleküler mekanizmaları umutsuzca ihtiyaç vardır çözülmeye. Insan prostat epitel oluşturmak için pluripotent kök hücre popülasyonlarının ikna etmek için önceden prostat ürogenital sinüs mezenşimin (UGSM) potansiyel prostat araştırma güçlü deneysel bir araçtır.
Abstract
Prostat kanseri araştırmalarında ilerleme ciddi prostat hastalığın başlangıcında altta yatan genetik ve moleküler olayları anlamak için yeteneğimizi sınırı insan kaynaklı ve hormon-naif model sistemler, durumu ile sınırlıdır. Kanser insan prostat çalışmak için daha iyi bir model sistemlerinin geliştirilmesi doğru, biz ve diğerleri, embriyonik kemirgen prostat stromanın eşsiz yanlısı prostat endüktif potansiyel yararlanmaktadır ürogenital sinüs mezenşimin (UGSM) olarak adlandırdığı. Embriyonik kök hücreleri gibi belirli pluripotent hücre popülasyonu ile rekombine olduğunda, UGSM bir testosteron bağımlı bir şekilde normal bir insan prostat epitel oluşumuna neden olur. Böyle bir insan modeli sistemi araştırmak ve deneysel olarak tipik bir kemirgen transgenik çalışmalara kıyasla daha hızlı bir biçimde aday prostat kanserine yatkınlık genlerinin yeteneğini test etmek için de kullanılabilir. İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC) genetik kültür istimal olarak değiştirilebilir yanadoku rekombinasyon önce g indüklenebilir gen veya siRNA knock-down vektörler, böyle bir model genlerin fonksiyonel sonuçları test kolaylaştırır, ya da teşvik ya da kanser önlemek için düşünülen gen kombinasyonları,.
UGSM hücre saf nüfus izole tekniği, ancak zordur ve genellikle öğrenme önceki uzmanlık kimse ile kişisel olarak öğretmek gerekir. Dahası, immün sistemi baskılanmış ana böbrek kapsülü altında hücre karışımlarının aşılama teknik zor olabilir. Burada anahat ve kemirgen embriyo ve insan prostat epitel oluşturmak için doku karışımları böbrek kapsül implantasyon gelen UGSM uygun izolasyon göstermektedir. Böyle bir yaklaşım, mevcut aşamada, embriyonik kök hücrelerin xenografting in vivo gerektirir; gelecekteki uygulamalar potansiyel in vitro bezi oluşumu veya uyarılmış pluripotent kök hücre popülasyonlarının (iPSCs) kullanımı dahil olabilir.
Introduction
Prostat kanserinin daha iyi insan modeli sistemleri için çok büyük bir ihtiyaç vardır. Özellikle, genetik olarak, prostat kanseri başlatılmasında belirli genlerin rolünü anlamak için manipüle edilebilir, normal, habis olmayan prostat dokularında ilgili insan modeli sistemler çok bilgilendirici olacaktır. Genomik çağın habercisi kanser oluşumunda rol olabilir çok sayıda gen tespit etti. Deneysel insan modeli sistemlerinin eksikliği, ancak, ciddi fonksiyonel test etmek ve aday prostat kanseri yatkınlık genleri karakterize yeteneğimizi bozar. İdeal bir model sistem uygun transgenik kemirgen model sistemler ile birlikte kanser duyarlılık genlerin hızlı ve daha hızlı fonksiyonel analiz kolaylaştıracaktır. Ayrıca, bu tür bir insan modeli sistemine yeni tedavilerin keşfi ve doğrulama doğru kanser prostat sinyal mekanizmalarının moleküler karakterizasyonu sağlayacakprostat kanseri oluşumunu önler.
İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC) xenogreftler insan prostat dokusu oluşturma yeteneğine sahiptir. 2006, Taylor et al. HESC 8-12 haftalık bir süre içinde kemirgen ürogenital sinüs mezenşim (UGSM) ile tekrar kombine edildiğinde in vivo olarak prostat epitel oluşturmak için uyarılabilir bildirmiştir. 1 Bu çalışmalar ile daha önceki çalışmaları dayandırılsaydı Bu kemirgen embriyonik UGSM gösteren Cunha laboratuvar 2,3 Prostat ürogenital sinüs (UGS) olarak adlandırılan bir embriyonik anlagen gelişir. kök hücre ve in vivo olarak embriyonik epitel hücre popülasyonlarının prostat farklılaşma teşvik ve önce embriyonik gün 17 (fare E17 olabilir , sıçan gün E18) UGS kaldırılır ve fiziksel olarak bölünmüş epitel (UGSE) içine ve mezenşimin (UGSM) 4 Bu doku rekombinasyon yaklaşım önemli ölçüde prostat gelişimi ve kanser, özellikle anlayışımızı artırmıştır edilebilir.ly büyüme faktörü ve hormonal sinyal iletim yolakları ve prostat stroma, epitel arasındaki moleküler ilişkilerin. 5-8 Bu yöntem, kök ya da aynı ya da farklı türlerden epitel hücreleri ile UGSM arasında ex vivo kombinasyonu içerir ve bu hücre / doku rekombinantlar implante ve yetiştirilen ve fare konak içinde ksenograftları. 4,9 in vivo büyüme döneminden sonra, implant stromal doku içinde gömülü prostat epitelyal glandüler yapılar içerir. Ayrıca boyama gibi yapılar gerçekten prostat ve insan kaynaklı olup olmadığını belirlemek için yapılabilir. 10,11
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu önerileri ile tam uyum içinde gerçekleştirilmiştir. Protokol Chicago Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu Üniversitesi'nde (IACUC, protokol numaraları 72.066 ve 72.231) tarafından onaylanmıştır. Tüm cerrahi anestezi altında yapıldı ve tüm çabaları acı en aza indirmek için yapılmıştır. İnsan embriyonik kök hücre hattı WA01 (H1, NIH-kayıt # 0043) mTeSR1 medya kullanarak besleyici bağımsız protokolünü kullanarak WiCell (Madison, WI) ve kültürlü elde edildi (Hücre Teknolojileri Kök, Vancouver, BC). ES hücrelerinin çözdürme on geçişleri içinde kullanılmıştır.
1. Fare veya Rat Embriyolar gelen Ürogenital Sinüs izolasyonu
- 5 dakika boyunca CO 2 Solunduğunda bir zamanlı hamile fare (gün 17.5) veya sıçan (gün 18.5) euthanize. Ölüm sıçan vital bulgular kesilmesi ile doğrulanır. Daha sonra insanca boynunu kırmak. RBu noktada ötenazi. Karın cilt ve yanları sterilize etmek için% 70 etanol püskürtün. Karın cilt ve kas tabakaları kesin ve daha sonra, rahim kesmek amniyon kesesi gelen sıçan embriyolar ayrı ve göbek kordonu kesti. Buzla soğutulmuş Hank'in dengeli tuz solüsyonu (HBSS) ihtiva eden 50 ml'lik bir Falcon tüpüne embriyo transferi ve buz üzerinde tutmak. Fetus cerrahi makas ile kesilerek ötenazi.
- 100 mm Petri kabındaki embriyo yerleştirin. Göbek (Şekil 1A) düzeyinde makas ile embriyo ikiye bölmek. Mide ve ince bağırsak çıkarın. Erkek embriyo (Şekil 1B ve 1C) olarak kadın embriyo ve testis yumurtalıklar ortaya koymaktadır. (Yumurtalıklar böbreklerin kaudal kutuplarda yer almaktadır. Testisler yaklaşık mesane düzeyinde bulunmaktadır). Bu gelişimsel aşamada, UGSM hem erkek hem de dişi embriyoların ana mevcudiyetinde bir prostat epitel soy uyarabildiğinden izoletestosteron. 4 Bu gelişme süresi noktadan sonra, ancak, prostat tomurcukları UGSM içine oluşturan başlar ve saf UGSM izolasyonu çok zor. 4
- Diseksiyon mikroskobu altında, mesane ve karın arka duvar ortaya çıkarmak için Vannas makas ile orta doğrultusunda karın duvarı kesti. Ekleri içermez üst genital sistem (erkek embriyolarda, üreter, Wolf kanal ve Müllerian kanal kesilmiş; kadın embriyolarda, üreter ve Müllerian kanal kesme). Göbek kordonu gelen mesane ücretsiz. Kasık kemiğine ve Dumont ince uçlu forseps ile ürogenital sinüs ön duvarından açıkça ayrı kesin. Son olarak, rektum ürogenital sinüs arka duvar ayırın. Alt ucunda (üretra itibaren) de mesane ile ürogenital sinüs kesin ve buz HBSS ürogenital sinüs en blok (mesane ile) saklayın.
2. Ürogenital Sinüs mezenşimin ayrılması
- 1% Kalsiyum tripsin (Ca 2 +) ve Magnezyum (Mg 2 +) ücretsiz HBSS içeren bir şahin tüp ürogenital sinüs aktarın. 75 dakika boyunca 4 ° C 'de bir buzdolabında tüp yerleştirin.
- Tripsin çıkarın ve DMEM/F12 ortamı içinde% 10 Fetal Bovin Serumu (FBS) ile nötralize tripsinizasyon.
- Bu da kök hücre kaynaklı insan ile birlikte oluşturan kemirgen bezleri neden olabilir, dikkatli bir iğne veya Dumont ince uçlu forseps (sağlam epitel tüp mezenşimin epitel hücre kontaminasyon şansını azaltır bakımı ile epitel tüp yapışkan mezenkimal kol kızdırmak glandüler epitel) (Şekil 1D). 12
- DMEM/F12 ortamı + içeren yeni bir Falcon tüpüne transfer UGSM% 10 FBS +% 1 Penisilin / Streptomisin (pen / strep, 0.5 mg / ml) +% 1 Esansiyel olmayan amino asitler (NEAA) artı 1nM dozu R1881. Plas 37 ° C'de bir inkübatör tüp% 5 CO 2 gece ile.
- 200 xg doku santrifüj ve süpernatant atın. Fosfat tampon tuzu (PBS) (doku pelet rahatsız etmeyin) ile yıkayın.
- Yeniden askıya dokuya% 0.2 kolajenaz (DMEM/F12) ekleyin. 1 saat boyunca hafif bir sallama ile 37 ° C'de inkübe edin.
- Şiddetle girdap sindirim doku üç kez homojen tek hücreli karışımı olur ve DMEM/F12 orta + eklemek kadar% 10 FBS +% 1 P / S +% 1 NEAA + kollajenaz nötralize etmek 1nM dozu R1881.
- 200 x g santrifüj ve sonra HBSS UGSM hücreleri yeniden askıya tarafından yıkayın ve tam UGSM yıkamak için üç kez tekrarlayın. Son olarak DMEM/F12 mezenkimal hücreler askıya ve Hemasitometre veya hücre sayımı cihazı kullanarak hücreleri saymak.
- Bir Accutase sindirim (; Billerica, MA Millipore) kullanılarak; iEK hücreleri mTeSR1 medya (Vancouver, BC Kök Hücre Teknolojileri) ile kültür kullanarak besleyici-ücretsiz protokolü ayırmak. IEK hücreleri yıkayınsıcak DMEM/F12 medya kendi büyüme günlük aşamasında, sonra ılık 1x Accutase çözüm ekleyin ve tek hücre kolonilerden düzgün ayrışmış kadar 15-20 dakika 37 ° C'de inkübe edin. Accutase nötralize ve yavaşça yukarı pipet ve aşağı hücre kümeleri karıştırmak ve parçalamak için; 1x tanımlanan tripsin inhibitör (Grand Island, NY Invitrogen) eşit miktarda ekleyin. Bir santrifüj tüpü ve 3 dakika 200 x g ve DMEM/F12 ortamı içinde yeniden askıya hücre pelletini için santrifüj içine pipetle hücreler. 200 tekrar xg az 3 dakika tüp santrifüj ve süpernatant kaldırmak, daha sonra istediğiniz ses seviyesinde soğuk HBSS veya DMEM/F12 yeniden askıya.
- IEK / mezenkimal hücrelerin 1:2.5 oranı ile iEK hücreleri ekleyin. 3 Bu 10 ml enjeksiyon başına 4E 4 hESC (tek bir fare 2E 6 mezenkimal hücreler hakkında genellikle verim UGS) ile 1E 5 UGSM hücre hücresel bileşimi olacaktır. 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüjden sonra supernatant atın. 75% Matrigel (BD Biosciences ile yeniden askıya,San Jose, CA, daha kolay kullanım için 25% soğuk HBSS ile karıştırılmış) ve alt böbrek kapsülü enjeksiyon için buz tüp yerleştirin.
3. Böbrek Kapsül altında Rekombinant Doku Nakli
- Bir steril cerrahi zemin hazırlayın.
- Ksilizin / ketamin ip ile bir erkek atimik çıplak fare anestezisi, ketamin bir 01:01:08 oranı içeren yeni bir karışım kullanın: ksilizin: tuzlu. Dozlama 100 mg / kg ketamin ve 2.5 mg / kg 'Ksilazin olacaktır. Bir ayak-tutam tepkisiz Hayvanlar tam 20-30 dakika altında olmalıdır.
- Cerrahi betadin çözüm ardından% 70 alkol üç alternatif mendil ile temizlik ve bir cerrahi örtü uygulayarak, cerrahi alan (çıplak bir fareyi kullanarak değilse) tıraş tarafından fare hazırlamak.
- Anestezi sırasında kurumasını önlemek için fare gözünde göze nem merhem (Altalube göz merhemi) koyun.
- Ameliyat sırasında, farelerin solunum hızı ve çekirdek vücut ısısı izlenir. Solunum oranları should istikrarlı ve 40-90 solunum / dakika içinde muhafaza olabilir. Çekirdek vücut ısısı mukoza renk ve ayak pembe tabanı gözlem ile izlenir.
- Arkasında bir 1.0 cm uzunluğunda longitudinal cilt kesi yapmak. 0.5 cm boyuna kesi içinde karın duvarı kesmek için devam edin.
- Yavaşça karın dışında böbrek sıkmak ve steril serum fizyolojik damla kullanarak böbrek yüzeyi nemli tutmak.
- Yavaşça delinme boş bir 27-gauge enjektör iğnesi ile böbrek kapsülü. Çok sığ delik yeterlidir. Eğer cep karışımı enjekte etmek için künt bir iğne takın burada olacak.
- Cep karışımı 10 ul ile 28-gauge künt şırınga iğne doldurun. Yavaş yavaş ponksiyon yerleştirin ve böbrek kapsülü altında bir alana ulaşmak için böbrek parankim nüfuz. Böbrek kapsülü altında böbrek üzerindeki bir kapsül oluşturmak üzere hücresel karışımı 10 ul enjekte edilir. Çekilme iğne.
- Abdo için böbrek dönminal boşluğu. 4-0 naylon sütür ile periton kas tabakası sabitleyin.
- Dikiş veya zımba ya ile cilt kapatın.
- Steril tuzlu su kullanılarak, deriden kan temizleyin.
4. Ameliyat sonrası analjezi ve İzleme
- Ameliyat sonrası ağrı, ve 37 1 ml hayvan sıcak tutmak için ° C tuzlu ip yönetmek için buprenorfin (0.1 mg / kg, her 12 saat) kadar veya ketoprofen (serum fizyolojik her 12 saat, 3-5 mg / kg) ile hayvan enjekte ve su kaybını önlemek.
- Temiz bir kafeste hayvan koyun ve hafif bir ısıtma yastığı yerleştirin.
- Bu bilinci kazanmak ve kafes içinde hareket bir kez hayvan odasına geri hayvanlar gönder.
- Aşağıdaki üç gün boyunca hastalık ve enfeksiyon belirtileri bakımından günlük olarak beklenmedik bir hayvan dikkate alınmalıdır. Fareler erişen gıda ve su operasyon sonrası 1 gün de dahil olmak üzere kafeslerde faaliyetlerinin gözlem ile takip edilmektedir. Fareler daha az faaliyetleri gösterirseniz, Ketoprofen intraperitoneal reklamdırGünde bir kez daha ministered.
- Cilt zımba veya dikişler 2 hafta sonrası ameliyat çıkarın.
- Xenograft dokular 8 hafta ameliyat sonrası gibi erken hasat edilebilir. Xenografts küçük hayvan ultrason (Şekil 2A) ve sabit dokular kesitli ve immünhistokimya (Şekil 3) kullanarak çeşitli proteinlerin için lekeli olabilir kullanarak in vivo olarak görüntülenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Taylor ve ark. Tarafından heyecan verici rapor üzerine inşa, bizim laboratuar yaygın olarak kullanılan H1 (NIH-tahsis edilmiş WA01, genetik olarak erkek) insan embriyonik kök hücre hattı. 1 Bu satır sıkı kalite kontrol için test edilmiş ve kullanarak bir yerleştirilmesiyle protokolü geliştirdi karyotipik normaldir 13 uygun kültüre zaman, embriyonik kök hücreleri genişletilmiş, muhafaza ve besleyici içermeyen kültür yöntemi (Kök Hücre Teknolojileri ile ticari besleyici ücretsiz sistemleri, Vancouver BC) kullanarak farklılaşmamış ve pluripotent devlet kriyoprezerve edilebilir.. 14. Bizim Protokol E18 fare UGSM tek hücre süspansiyonları ile bir araya getirilmiş ve yetişkin erkek farelerin bağışıklık böbrek kapsülü altına enjekte hESC tek hücre süspansiyonları kullanmaktadır. HESC UGSM formu büyük teratom (Şekil 2B) olmadan implante ise önemli kontrol olarak, USGM, hiçbir fark büyüme verir yalnız implante. 15. Deneyimlerimiz, implant olarak, sıçan epitel hücreleri doku büyüme hiçbir zaman sonuçları kirletici olmadan UGSM bir ation ise UGSM artı zaman% 80 üzerinde güçlü büyüme (1 mm ila 5 mm 8 hafta boyutları aralığı sonra, doku 80% ile hESC sonuçlarının rekombinasyon ) glandüler epitel içeren. HESC ve UGSM her ikisini de içeren rekombinantlar, erken glandüler formasyonu 4 hafta sonra gözlenir ve 8 hafta sonra tam olarak oluşmuş, prostat spesifik antijen (PSA)-pozitif insan prostat epitel (Şekil 3) oluşturulmuştur. Bu bezler Androjen Reseptör (AR) pozitif ev sahibi kastrasyon bir hafta sonra mevcut olmayan luminal-salgı hücreleri içerir. Önemlisi, bu bezler insan-özel ve prostat spesifik protein PSA için olumludur. Bu insan bezleri bir prostat kanseri spesifik göstergesi olan Alfa-metil açil-KoA rasemöz (AMACR), ifade olmadığı olmayan malign gibi görünen daha boyama belgeler. 16.
ether.within-page = "her zaman"> 
Şekil 1. Bir E18.5 Rat Embriyo gelen Ürogenital Sinüs izolasyonu. A. E18.5 fare embriyo. Beyaz düz çizgi embriyo ikiye bölmek için konumunu gösterir. B. E18.5 erkek sıçan embriyo. Siyah noktalı çizgiler mesane, ürogenital sinüs, rektum, ve gelişmekte olan testisler gösterir. C. E18.5 kadın sıçan embriyo. Siyah noktalı çizgiler mesane, ürogenital sinüs ve rahim gösterir. D. mesane ve E18.5 sıçan embriyo kaldırılır ürogenital sinüs. Ise düz çizgi mesane kaldırmak için konumunu gösterir. Siyah noktalı çizgi ve beyaz ok epitel tüp gösterir. Beyaz ok başı ürogenital sinüs mezenşimin gösterir.
7/50327fig2.jpg "alt =" Şekil 2 "fo: içerik-width =" 4in "fo: src =" / files/ftp_upload/50327/50327fig2highres.jpg "/>
Şekil 2. Ultrason görüntüleme ve UGSM ve hESC elde edilen in vivo doku xenografts içinde brüt morfolojisi. Büyüyen xenografts A. Ultrason görüntüleme deney sırasında canlı hayvan analizine imkan vermektedir. Görüntü bir Vevo 2.100 küçük bir hayvan ultrason (, Toronto, ON Visualsonics) kullanarak 8 hafta ameliyat sonrası yakalandı. . Daire alan böbrek yüzeyinde büyüyen doku xenograft temsil eden deneysel nokta ise B., sıçan UGSM (rUGSM) ile birlikte iEK hücreleri böbrek yüzeyi (sol panel) üzerinde görünür bir doku kitlesi oluşturmak; iEK hücreleri tek başına implante gibi büyük teratom formu (orta panel) beklenen ve tek başına implante UGSM herhangi bir fark edilebilir bir yapı (sağ panel) oluşturmak için başarısız olur.
. Jpg "alt =" Şekil 3 "fo: içerik-width =" 6in "fo: src =" / files/ftp_upload/50327/50327fig3highres.jpg "/>
Şekil 3,. İnsan Embriyonik Kök Hücre Hattı WA01 (H1). ES hücrelerinden İnsan Prostat Epiteli oluşumu kemirgen UGSM ile recombined ve sağlam erkek çıplak farelerin böbrek kapsülü altında implante edildi. 8 haftalık bir büyüme sürecini takiben, insan prostat Glandüler epitelyum AR, p63 ve insan kısıtlı PSA boyama ile belirtildiği gibi oluşturulmuştur. Ev sahibi kastrasyon takip eden bir hafta, AR-pozitif, PSA-pozitif luminal katman özelliği androjen-bağımlılık belgeleyen, mevcut değildir. AMACR boyama eksikliği ile gösterildiği gibi prostat dokularında habis olmayan vardır. Buna ek olarak, CHRA-pozitif endokrin hücreleri tespit edildi. Habis olmayan insan prostat dokusu AR, PSA ve p63 için bir kontrol olarak kullanılmıştır, bir prostat tümörü kansere özgü AMACR için pozitif bir kontrol olarak kullanılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
UGSM kullanarak doku rekombinasyon prostat gelişimi ve prostat kanseri inisiyasyon yol açan moleküler olayları araştırmak için inanılmaz faydalı bir tekniktir. UGSM bir endüktif potansiyel prostat araştırma çok çeşitli uygulamalar için kullanılmıştır; bu arttırıcı tümör stromal-epitelyal etkileşimler eğitim ve türler arası prostat rekombinantlar oluşturan, prostat hücre hatları ve tümörlerin almak dahil UGSM bir 7,17-20 doğru hazırlanması. Bununla birlikte, kemirgen epitel kirlenmesine glandüler oluşumuna neden olur ve sonuç olarak etkilemesi için deneysel başarısı için çok önemlidir. Bu nedenle, ikinci UGSE UGSM ayrılması (Basamak 2.4) göre uzak protokolde de en önemli ve en çok zor bir adımdır. Bu tür kirlenme kontrol etmek için, türler arasında ayırt etmek tekniklerinin kullanılması kuvvetle teşvik, hem de bir cellula hiçbir glandüler oluşumu belgelemek için tek başına UGSM kullanarak ilave deneysel kolr kirletici. 12
Besleyici-ücretsiz embriyonik kök kültür reaktif ve yöntemleri son gelişmeler saf nüfus iEK hücreleri, kültür genişletilmiş ve dondurulmuş izin verir. 14. Ayrıca, lentiviral gen teslim genişletilmiş kullanımı ilgi genlerin istikrarlı genomik kuruluş ve ifade sağlar. 21,22 Bu kombine gelişmeler prostat embriyonik UGSM en endüktif potansiyeli ile kombine edildiğinde, saf embriyonik kök kültürlerin genetik manipülasyon için izin ve ilgi belirli genleri ifade insan prostat bezlerinin in vivo nesil izin verecektir. Ayrıca bu tekniği yetişkin konaklardan ve genetiği değiştirilmiş hücreler elde edilen uyarılmış pluripotent kök-hücre hatları (iPSCs) için uygun olacaktır. 23,24 tanımlanan proteinleri kullanarak, göstermek gibi hESC-kaynaklı insan prostat epitel yetişkin çok benzer görünür insan prostat epitel, ama küresel bir moleküler düzeyde olacağından emin olduğunudikkate alınmalıdır gen ekspresyonunda bazı farklılıklar mevcuttur. Bunu dikkate almak için, araştırmacılar genişletilmiş bir örneklem büyüklüğü kullanımı ve lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) tabanlı yetişkin insan dokuları kıyasla dokuların moleküler profilleri doğrulamak için yaklaşım ve karşılaştırmalı gen ekspresyon analizleri platformlar düşünmelisiniz. Bununla birlikte, bir seri-kültürlenmiş ve besleyici içermeyen kök hücre hattı kullanılarak insan prostat Glandüler epitelyum oluşumu prostat fonksiyonu ve kanser başlatılması ile ilgili çok sayıda moleküler çalışmalar kolaylaştırmak için potansiyele sahiptir.
Bizim teknik yaklaşım, hem de hücresel miktarları daha doğru kontrol sıralama lentiviral enfeksiyon ve akış bölgesinin kullanımını sağlar UGSM ve hESC, hem de tek hücre süspansiyonları kullanır. Bu, ancak, UGSM en endüktif potansiyelini azaltabilir. Alternatif bir yaklaşım) kollajenaz sindirim önce olmayan ayrışmış UGSM (Adım 2.5 sonra), kullanmak olmuşturve kollajen çözüm içinde ES hücreleri veya gömme hücreleri ile ya doğrudan kuluçka. 4 böbrek kapsülü altında bu dokular implant için, alternatif bir teknik böbrek kapsülü bir kesi yapmak olacaktır, üst böbrek kapsülü altında küçük bir cep oluşturmak böbrek, ve fiziksel olarak bu cep içinde hücre kitlesi yerleştirin. 4,20
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çalışma sundu ile herhangi bir çıkar çatışması var.
Acknowledgments
Biz Dr Arieh Shalhav liderliğindeki Üroloji Chicago Bölüm Of Üniversitesi ve Ürolojik Araştırma Dr Carrie Rinker-Schaeffer Direktörü destek dolayı teşekkür etmek istiyoruz. Ayrıca Dr Michelle Le Beau liderliğindeki Chicago Kapsamlı Kanser Merkezi (UCCCC) Üniversitesi desteği kabul etmek istiyorum. Ayrıca Dr Mark Lingen liderliğindeki İnsan Doku Kaynak Merkezi çekirdek odası ve Leslie Martin ve Mary Jo Fekete yardımı uzman teknik yardım teşekkür ile. Ayrıca Terri Li tarafından yürütülen İmmünohistokimya Çekirdek Tesis teşekkür ederim. Bu çalışma Cerrahi Chicago Dalı, Üroloji Bölüm Üniversitesi tarafından finanse edildi; bir Amerikan Kanser Derneği Kurumsal Araştırma Bursu (ACS-IRG, # IRG-58-004), bir Kanser Merkezi Destek Hibe (P30 CA14599); Brinson Vakfı, Alvin Baum Aile Fonu; Chicago Kanser Araştırma Vakfı Kadın Kurulu Üniversitesi; S. Kregel bir HHMI tarafından desteklenmektedir: Med-içine-Grad Fellowskalça (56006772) ve Kanser Biyolojisi Eğitim Grant (T32-CA09594). Son olarak, yazının eleştirel değerlendirilmesi için Robert Clark, Dr VenkateshKrishnan ve Nathan Stadick teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | GIBCO | 14170 | |
| DMEM/F12 | GIBCO | 11330 | |
| R1881 | Sigma | 965-93-5 | Mix to 1 ug/ml in Ethanol (1,000x stock) |
| NEAA | GIBCO | 11140 | |
| Pen-Strep Solution | GIBCO | 15070 | 100x stock |
| Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| KETASET (ketamine hydrochloride) | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-2013-01 | 100 mg/ml; dilute 1:10 in sterile saline |
| AnaSed (xylazine) | VET-A-MIX, Inc. | NADA 139-236 | 20 mg/ml; dilute 1:10 in sterile saline |
| Trypsin | BD Biosciences | 215240 | |
| Collagenase | Sigma | C2014 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge | NDC 0856-4396-01 | 100 mg/ml; dilute 1:1,000 in sterile saline |
| Altalube eye ointment | Altaire Pharmaceuticals, Inc. | NLC 56641-19850 | |
| Leica MZ16 F Stereomicroscope | Leica | Any good dissecting scope can be used. | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Syringe | Hamilton | 84855 | |
| Hamilton Needle, Small RN, 28 gauge, 0.5inches, Point Style #3 (Blunt) | Hamilton | 7803-02 | Custom Needle |
| Ethanol Prep Pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | |
| Sterile Gauze Pads | Fisher Scientific | 22-415-469 | |
| Ethicon Vicryl Suture (4-0 FS-2) | MedVet International | J392H | Needle-in, dissolvable suture |
| Autoclip 9 mm Wound Clips | Becton Dickenson | 427631 | |
| PVP Iodine Prep Pads | Fisher Scientific | 06-669-98 | |
| Dissector scissor with blunt end | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Dumont fine tip forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Needle holder with Scissor | Fine Science Tools | 12002-14 |
References
- Taylor, R. A., et al. Formation of human prostate tissue from embryonic stem cells. Nat. Methods. 3, 179-181 (2006).
- Cunha, G. R., Chung, L. W. Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice. J. Steroid Biochem. 14, 1317-1324 (1981).
- Cunha, G. R., Chung, L. W., Shannon, J. M., Taguchi, O., Fujii, H. Hormone-induced morphogenesis and growth: role of mesenchymal-epithelial interactions. Recent Prog. Horm. Res. 39, 559-598 (1983).
- Staack, A., Donjacour, A. A., Brody, J., Cunha, G. R., Carroll, P. Mouse urogenital development: a practical approach. Differentiation. 71, 402-413 (2003).
- Cunha, G. R., et al. Normal and abnormal development of the male urogenital tract. Role of androgens, mesenchymal-epithelial interactions, and growth factors. J. Androl. 13, 465-475 (1992).
- Cunha, G. R., et al. Growth factors as mediators of androgen action during the development of the male urogenital tract. World J. Urol. 13, 264-276 (1995).
- Aboseif, S., El-Sakka, A., Young, P., Cunha, G. Mesenchymal reprogramming of adult human epithelial differentiation. Differentiation. 65, 113-118 (1999).
- Marker, P. C., Donjacour, A. A., Dahiya, R., Cunha, G. R. Hormonal, cellular, and molecular control of prostatic development. Dev. Biol. 253, 165-174 (2003).
- Cunha, G. R., Sekkingstad, M., Meloy, B. A. Heterospecific induction of prostatic development in tissue recombinants prepared with mouse, rat, rabbit and human tissues. Differentiation. 24, 174-180 (1983).
- Van der Griend, D. J., et al. The Role of CD133 in Normal Human Prostate Stem Cells and Malignant Cancer Initiating Cells. Cancer Res. 68, 9703-9711 (2008).
- Van der Griend, D. J., Konishi, Y., De Marzo, A. M., Isaacs, J. T., Meeker, A. K. Dual-label centromere and telomere FISH identifies human, rat, and mouse cell contribution to Multispecies recombinant urogenital sinus xenografts. Prostate. , (2009).
- Vander Griend, D. J., Konishi, Y., De Marzo, A. M., Isaacs, J. T., Meeker, A. K. Dual-label centromere and telomere FISH identifies human, rat, and mouse cell contribution to Multispecies recombinant urogenital sinus xenografts. Prostate. 69, 1557-1564 (2009).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat. Methods. 3, 637-646 (2006).
- Prokhorova, T. A., et al. Teratoma formation by human embryonic stem cells is site dependent and enhanced by the presence of Matrigel. Stem Cells Dev. 18, 47-54 (2009).
- Hameed, O., Sublett, J., Humphrey, P. A. Immunohistochemical stains for p63 and alpha-methylacyl-CoA racemase, versus a cocktail comprising both, in the diagnosis of prostatic carcinoma: a comparison of the immunohistochemical staining of 430 foci in radical prostatectomy and needle biopsy tissues. Am. J. Surg. Pathol. 29, 579-587 (2005).
- Wang, Y. A human prostatic epithelial model of hormonal carcinogenesis. Cancer Res. 61, 6064-6072 (2001).
- Yao, V., Parwani, A., Maier, C., Heston, W. D., Bacich, D. J. Moderate expression of prostate-specific membrane antigen, a tissue differentiation antigen and folate hydrolase, facilitates prostate carcinogenesis. Cancer Res. 68, 9070-9077 (2008).
- Cunha, G. R., Cooke, P. S., Kurita, T. Role of stromal-epithelial interactions in hormonal responses. Arch. Histol. Cytol. 67, 417-434 (2004).
- Xin, L., Ide, H., Kim, Y., Dubey, P., Witte, O. N. In vivo regeneration of murine prostate from dissociated cell populations of postnatal epithelia and urogenital sinus mesenchyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, Suppl 1. 11896-11903 (2003).
- Yu, X. Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells. Mol. Ther. 7, 827-838 (2003).
- Anderson, J. S., Bandi, S., Kaufman, D. S., Akkina, R. Derivation of normal macrophages from human embryonic stem (hES) cells for applications in HIV gene therapy. Retrovirology. 3, 24 (2006).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3, 340-345 (2008).
