Abstract
Single-molecule microscopie is in opkomst als een krachtige aanpak van het gedrag van signaalmoleculen, in het bijzonder met betrekking tot die aspecten (bv.., Kinetiek, naast elkaar bestaan van verschillende staten en bevolkingsgroepen, voorbijgaande interacties), die typisch zijn verborgen in ensemble-metingen, zoals analyseren die verkregen met standaard biochemische methoden of microscopie. Aldus thermische, zoals receptor-receptor-interacties, kunnen worden gevolgd in real time in een levende cel met hoge resolutie spatiotemporal. Dit protocol beschrijft een methode waarbij merken met kleine en lichte organische fluoroforen en totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie direct visualiseren enkele receptoren op het oppervlak van levende cellen. Deze aanpak maakt het mogelijk om precies receptoren lokaliseren, meten van de grootte van de receptor complexen, en vangen dynamische evenementen zoals transient receptor-receptor interacties. Het protocol geeft een gedetailleerde beschrijving van hoe u perform een single-molecule experiment, inclusief monstervoorbereiding, beeldacquisitie en beeldanalyse. Als voorbeeld, de toepassing van deze methode twee G-eiwit-gekoppelde receptoren te analyseren, dwz., Β 2-adrenerge en γ-aminobutyric acid type B (GABA B) receptor, wordt gerapporteerd. Het protocol kan worden aangepast aan andere membraaneiwitten en verschillende celmodellen, transfectie en etikettering strategieën.
Introduction
Receptoren op het celoppervlak zin de extracellulaire omgeving en reageren op verschillende stimuli, zoals geurstoffen, ionen, kleine neurotransmitters en hormonen groot eiwit. De vloeibare aard van cellulaire membranen maakt bewegingen van receptoren en andere membraaneiwitten. Dit is essentieel voor de vorming van eiwitcomplexen en het optreden van transiënte eiwit-eiwit interacties, zoals die gebruikt door receptoren te assembleren in functionele eenheden en transduceren signalen in de cel interieur. Bijvoorbeeld, G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR's), die de grootste familie van celoppervlak receptoren 1 vormen, zijn voorgesteld om di-/oligomers, die lijkt te worden betrokken bij de fijnafstemming regulatie van signaaltransductie en vorm belangrijke fysiologische en farmacologische gevolgen zou kunnen hebben 2-5.
Single-molecule microscopie heeft het grote potentieel van direct visualiseren met een hoge spatiotemporale oplossing het dynamische gedrag van individuele receptoren op het oppervlak van levende cellen, met inbegrip van hun associatie met dimeren en hogere orde moleculaire complexen 6-10 vormen. Dit biedt verschillende voordelen ten opzichte van standaard biochemische en microscopie methoden, die gewoonlijk rapporteren de gemiddelde gedrag van duizenden of miljoenen moleculen.
Eiwit labeling met een voldoende heldere en fotostabiel fluorofoor is essentieel voor single-molecule microscopie. Dit protocol maakt gebruik van de onlangs geïntroduceerde SNAP-tag 11 covalent hechten kleine en lichte organische fluoroforen aan celoppervlak receptoren. SNAP is een 20 kD eiwit tag afkomstig van het menselijk DNA-reparatie-enzym O 6-alkylguanine-DNA alkyltransferase, die onomkeerbaar kunnen worden gelabeld met fluorofoor-geconjugeerde benzylguanine (fluorofoor-BG) derivaten. CLIP, een verder ontwikkeld tag afgeleid van SNAP, kan in plaats daarvan worden gelabeld met fluorofoor-conjugated benzylcytosine derivaten 12.
Het protocol beschreven in dit manuscript uitgelegd hoe transfecteren en label SNAP-11 receptoren gelabeld met kleine organische fluoroforen en gebruik totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie enkele receptoren of receptor complexen zichtbaar op het oppervlak van levende cellen 10. De gerapporteerde resultaten protocol in> 90% labelingsefficiëntie een extracellulair SNAP-gelabeld eiwit van het celoppervlak 10. Nadere informatie over individuele molecuul gegevens gebruiken om de omvang en de mobiliteit van receptor complexen te analyseren, evenals transient receptor-receptor-interacties te vangen, is voorzien. Een schematische werkstroom van het gehele protocol is gegeven in figuur 1. Als voorbeeld, de transfectie van Chinese hamster ovarium (CHO) cellen met SNAP-gemerkte G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCRs), gevolgd door het merken met een fluorofoor-BG derivaat als alsmede de toepassing ervan op quantify en de monitor receptor di-/oligomerization worden beschreven. Dit protocol kan worden uitgebreid tot andere cel-oppervlakte-eiwitten en fluorescerende labels (bijv.. CLIP), alsmede andere transfectie en etikettering methoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Monstervoorbereiding
- Dekglaasje reiniging
LET OP: Brei onder een afzuigkap.- Gebruik schone pincet om dekglaasjes (24 mm diameter) te plaatsen in een dekglaasje houder dat individuele dekglaasjes scheidt.
- Plaats de houder met dekglaasjes in een beker en voeg chloroform totdat de dekglaasjes worden gedekt. Bedek het bekerglas met aluminiumfolie om verdamping en ultrasone trillingen te verminderen in een badsonicator gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Neem het dekglaasje houder uit de beker en laat de dekglaasjes droog.
- Herhaal stap 1.1.2 met 5 M NaOH-oplossing in plaats van chloroform.
- Neem het dekglaasje houder in een nieuwe beker en was driemaal met gedestilleerd water. Zet gereinigd dekglaasjes in een glazen celkweekplaat gevuld met 100% ethanol.
- Bereiding van ijkmonsters
- Los fluorescente kleurstof in geschikt oplosmiddel.
- Bereid een 1:10 seriële verdunning van de fluorescente kleurstof, variërendvan 13:00 tot 1 nM in filter gesteriliseerd (0,22 pm) water.
- Neem schoongemaakt coverslips opgeslagen in 100% ethanol en wassen met een filter gesteriliseerd water. Vlek 20 pi van elke verdunning fluorescente kleurstof op een afzonderlijk gereinigd dekglaasje. Laat de dekglaasjes drogen onder een steriele kap. Bescherm de dekglaasjes van licht en stof tot gebruik. Gebruik deze monsters te schatten de intensiteit van individuele fluorescerende moleculen (zie stap 3).
- Transfectie
- Kweek CHO cellen in 01:01 Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium / voedingsmengsel F-12 (DMEM/F12), aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine bij 37 ° C, in . 5% CO 2 OPMERKING: Gebruik fenol-rood vrije media gedurende het experiment om autofluorescentie minimaliseren.
- Neem gereinigd dekglaasjes van 100% ethanol-oplossing, spoel ze met steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), en plaats een dekglaasje in elk putje van een 6 goed celkweek platen.
- Trypsinize, tellen en zaden CHO-cellen bij een dichtheid van 3 x 10 5 cellen / putje in 6-well celcultuur plaat met de dekglaasjes. Laat de cellen groeien in een incubator (37 ° C, 5% CO2) gedurende 24 uur om ongeveer bereiken. 80% confluentie, wat de optimale celdichtheid voor transfectie.
- Voor elk putje verdunde 2 ug van het gewenste plasmide-DNA (bijv.. SNAP-gelabeld β 2-adrenerge receptoren) en 6 pl Lipofectamine 2000 in twee buisjes die 500 pi Optimem medium. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Combineer de oplossingen van stap 1.3.4 in een buis en meng tot een transfectie mengsel te verkrijgen. Incubeer de transfectie mengsel bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
- Tijdens de incubatie (1.3.5), neemt de CHO-cellen en tweemaal wassen met voorverwarmde (37 ° C) PBS. Vervang PBS met 1 ml / putje van fenolrood-vrij DMEM/F12 medium aangevuld met 10% FBS, maar geen antibiotica.
- Voeg de hele transfecterenion mengsel (1 ml) van stap 1.3.5 druppelsgewijs aan elk putje, en schud de plaat heen en weer om volledige menging te garanderen.
- Incubeer gedurende 2 tot 4 uur bij 37 ° C in 5% CO2 en daarna onmiddellijk over tot de volgende stap. OPMERKING: De transfectie omstandigheden zijn geoptimaliseerd om receptor dichtheid <0,45 deeltjes / um 2, die geschikt zijn voor eenmalig worden getild molecule beeldvorming. Aanpassingen kunnen bij het gebruik van verschillende cellen, bouwt of reagentia nodig zijn.
- Eiwitmarkerend
- Verdun 1 pl fluorofoor-BG voorraadoplossing in 1 ml DMEM/F12 medium aangevuld met 10% FBS tot een uiteindelijke concentratie van 1 uM vinden. Neem de getransfecteerde cellen uit de incubator en tweemaal wassen met voorverwarmde (37 ° C) PBS. Vervang PBS met 1 ml van 1 uM fluorofoor-BG-oplossing en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C 5% CO2 in een incubator.
- Na de incubatie was de cellen driemalen met DMEM/F12-medium aangevuld met 10% FBS, telkens gevolgd door 5 minuten incuberen bij 37 ° C. Neem een dekglaasje (met gelabelde cellen) met een pincet en plaats deze in een imaging kamer.
- Twee keer wassen met 300 ul beeldvorming buffer. Voeg 300 ul van verse beeldvorming buffer en onmiddellijk overgaan tot beeldvorming (deel 2).
2. Image Acquisition
OPMERKING: Gebruik een totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscoop, uitgerust met een olie-immersie hoge numerieke apertuur doelstelling (bijv. 100X magnification/1.46 numerieke lensopening.), Geschikt lasers (bv, 405 nm, 488 nm, 561 nm en 645 nm diode lasers), een elektron te vermenigvuldigen charge-coupled device (EMCCD) camera, een incubator en een temperatuurregelaar op enkele fluorescerende moleculen te visualiseren.
- Stel de gewenste microscoop parameters, dwz., Laserlijn, TIRF hoek (deze parameter regelt de penetratietie diepte van de verdwijnende veld), belichtingstijd, frame rate en het aantal beelden per film 10. Houd de kachel / incubator en temperatuurregeling altijd op temperatuur drifts en condensvorming te voorkomen.
- Een druppel immersie olie op het 100x objectief van de microscoop. Plaats de beeldvorming kamer met de gelabelde cellen op het monster houder van de microscoop, en breng de cellen in focus met helderveld verlichting.
- Schakel over naar TIRF verlichting. Houd laservermogen zo laag mogelijk zoeken naar de gewenste cel, maar tegelijkertijd het minimaliseren fotobleken mogelijk.
- Selecteer de gewenste cel en fijn scherp. Stel het laservermogen tot een niveau dat visualisatie van enkele fluoroforen maakt. Acquire image reeks, en sla rauw beeldsequentie bestand als. Tiff.
3. Calibration (Single Fluoroforen op glas en Monomeer / dimeer Receptor Controls)
- Monteer elke kalibratie sample bereid zoals beschreven in 1.2 in de beeldvorming kamer. Plaats elk monster op de microscoop en kies het monster dat goed gescheiden buigingsbegrensde plekken die bleken in een enkele stap. Opmerking: Deze vlekken vertegenwoordigen enkele moleculen van de fluorescente kleurstof.
- Verwerven TIRF beeld sequenties zoals beschreven in stap 2. Belangrijk: dezelfde beeldparameters worden gebruikt voor alle experimenten, inclusief die voor kalibratie.
- Voer de detectie en tracking analyse zoals beschreven in 4,1-4,2. Extraheer de intensiteit van elk deeltje zoals beschreven in 4.2.6. Uit deze gegevens berekent het gemiddelde (μ) en de standaarddeviatie (σ) van de intensiteit van enkele fluoroforen.
- Optioneel: voeren dezelfde analyse van cellen getransfecteerd met een monomere receptor van het celoppervlak (. Bijvoorbeeld CD86), N-terminaal gelabeld met een of twee kopieën van SNAP 10 en gelabeld met het fluorofoor-BG derivaat. Follow de hierboven beschreven voor de enkele fluorofoor op glas procedure. Schat de etikettering efficiëntie zoals beschreven in Calebiro, D. et al.. 10
4. Beeldanalyse
- Beeldsequentie voorbereiding
- Gebruik een image processing software (bijv.., ImageJ) om de beelden bij te snijden.
- Spaar individuele frames als afzonderlijke. TIFF-afbeeldingen in een nieuwe map, wat aangeeft op elk beeld het framenummer.
- Meet het celoppervlak door het tekenen van een gebied van belang (ROI) langs de omtrek van een cel en door meting gereedschap ImageJ of dergelijks in andere software. Met deze waarde deeltjesdichtheid berekend door het totale aantal deeltjes aan het begin van de film van het cel oppervlak.
- Deeltjesdetectie en volgen
OPMERKING: Gebruik niet-commerciële software zoals u-spoor 13, het werken in Matlabmilieu, om automatisch te detecteren en te volgen enkele receptor deeltjes.
OPMERKING: De u-circuit algoritme is gebaseerd op de meervoudige hypothese volgen benadering. Deze benadering koppelt deeltjes tussen frames door bouwkosten matrices, waarbij de individuele probabiliteiten die een bepaald deeltje in een frame correspondeert met een bepaald deeltje in het volgende frame, wordt, verdwijnt of fuseert / splitst met / van andere deeltjes toegewezen. De oplossing die wereldwijd minimaliseert de kosten, dwz. Degene met de hoogste waarschijnlijkheid, is uiteindelijk gekozen. Dit maakt ook het volgen van een tijdelijk verdwijnen deeltje, een typisch verschijnsel veroorzaakt door fluorofoor knipperen. De nieuwste versie van U-track (2.1.0) heeft grafische gebruikersinterfaces die de uitvoering van deze analyses te vergemakkelijken.- Van de Matlab commando prompt "movieSelectorGUI" om de film selectie-interface te openen. Volg de instructies om een te creërennieuwe film-database vanaf de eerder opgeslagen afzonderlijke beelden (zie 4.1.2).
- Bieden de pixelgrootte in nm, tijdsinterval in seconden, numerieke opening, camera bit diepte en emissie golflengte van de fluorofoor, die nodig zijn voor deeltjes detectie en tracking. Sla de film-database.
- Uit de film selectie interface, voert u de analyse, het kiezen van "single-deeltjes", zoals type objecten. Een nieuw venster verschijnt waarin de parameters die worden gebruikt voor deeltjes detectie en tracking kan worden gedefinieerd. Begin met de standaard parameters. Later, passen deze parameters als de kwaliteit van de detectie en / of tracking is niet bevredigend (bijvoorbeeld zijn sommige deeltjes niet gedetecteerd of tracks zijn gefragmenteerd) Optioneel:. Onder de tracking-instellingen controleren "Exporteren bijhouden van resultaten op de matrix van formaat" om op te slaan de coördinaten en amplitudes van alle deeltjes in een matrix (veld "trackedFeaturedInfo"). Voor een gedetailleerde beschrijving van deze parameters vindt u in de u-spoor documentatie.
- Voer het algoritme. Dit algoritme de locatie en intensiteit boven achtergrond van elke buigingsbegrensde vlek (dwz. Enkel receptoren / receptor complexen) door een tweedimensionale Gaussische functie met standaarddeviatie gelijk aan de puntspreidingsfunctie van de microscoop in lokale maxima intensiteit automatisch bepalen . Vervolgens voert u de tracking algoritme. Bewaar de resultaten van de analyses in een. Mat bestand.
- Gebruik de "movieViewer" routine, die in de u-spoor pakket, of soortgelijke aangepaste degenen om de tracks te visualiseren en controleren de kwaliteit van de opsporing en tracking.
- Open de mat bestand. De positie en amplitude (dwz., Intensiteit) van de bijgehouden deeltjes bij elk frame bekijken. Gegevens die bij stap 4.2.4 zijn opgenomen in het veld tracksCoordAmpCG van de tracksFinal array en / of in trackedFeaturedInfo. Van het totale aantal deeltjes gedetecteerd berekenen deeltjesdichtheid deze waarde te delen door het cel oppervlak gemeten 4.1.3.
- Optioneel: Gebruik het deeltje coördinaten in de tijd (zie 4.2.6) om de beweging van de receptor deeltjes te analyseren. Bereken de gemiddelde vierkante verplaatsingen (MSD) en diffusiecoëfficiënten (D) met behulp van Matlab of soortgelijke software. Voor elk deeltje en elke tijdsinterval (Δ t) beschouwd, berekent het gemiddelde kwadraat verplaatsing (MSD) met de volgende formule:
waarbij Δ t het tijdsinterval in frames, N is het aantal stappen geanalyseerd x en y x en y de coördinaten deeltje op het door de index frame. Gebruik MSD tijd percelen het type beweging van een bepaald deeltje evalueren: Lineair verhoudingengeven gratis verspreiding (dwz., Brownse beweging), een positieve kromming (dwz., de curve ziet eruit als een parabool) suggereert gerichte beweging, een negatieve kromming is een indicatie van beperkte beweging 14. Bij vrij diffunderende deeltjes, berekent de diffusiecoëfficiënt (D) van elk deeltje door het aanbrengen van de MSD-gegevens verkregen met de volgende vergelijking:
- Berekening van de deeltjesgrootte met Gaussian pasmethode
Opmerking: Als de intensiteitsverdeling ijkmonsters (enkele fluoroforen op glas en / of fluorescerend gemerkte monomere receptoren) bekend is, een gemengde Gaussiaanse passen op de verdeling van deeltjes intensiteiten begin van een sequentie van beelden om de grootte van receptorcomplexen bepalen (dwz. het aantal receptoren per deeltje) 10. Het uitvoeren van deze analyses met behulp van Matlab of similar software.- Bereken de intensiteit van elk deeltje van de gemiddelde intensiteit van de deeltjes van het eerste frame aan het frame voor de eerste verandering in intensiteit opgetreden (meestal een daling door fotobleken).
- Voer een gemengde Gaussische fitting volgens de volgende vergelijking:
waarbij φ (i) is de frequentie van deeltjes met intensiteit I, n het getal component, α n is een parameter die bijdraagt aan de hoogte van bestanddeel n, μ en σ zijn het gemiddelde en de standaardafwijking van de intensiteit van de referentie enkele fluoroforen . (berekend zoals beschreven in stap 3) OPMERKING: Bepaal thij maximale aantal componenten (nmax) voor elke reeks afbeeldingen door geleidelijk toenemende n max tot de toevoeging van een component ofwel niet langer produceert een statistisch beter vallend, zoals beoordeeld door een F-test. - Optioneel: (. Bijvoorbeeld de laatste 60 frames van een 400 framereeks) Voer een gemengde Gaussiaanse passen op de intensiteitsverdeling opgehaald op de laatste frames van de film. Vervang μ en σ met de waarden verkregen na deze montage, die geraffineerd schattingen voor de parameters te verstrekken, en herhaal stap 4.3.2.
- Bereken de oppervlakte onder de curve (AUC) van elke component van de gemengde Gaussische fit. Bereken de relatieve abundantie van receptor deeltjes van verschillende grootte (bijvoorbeeld monomeer, dimeer, trimeer, etc.) door de AUC waarde van elke component te delen door de AUC van de volledige distributie.
- Optioneel: Gegevens uit verschillende cellen en de bijbehorende deeltjesdichtheden (berekend zoals beschreven in 4.2.6) te plaatsen waarin de verdeling van deeltjes met verschillende grootte is gecorreleerd met deeltjesdichtheid 10 genereren.
- Berekening van de deeltjesgrootte met stap montage methode
OPMERKING: Gebruik een stap fitting analyse als een alternatieve methode om de grootte van receptorcomplexen 10 bepalen. De basis voor deze analyse is dat de licht-geïnduceerde vernietiging (fotobleken) van een fluorofoor resulteert in de onmiddellijke verdwijnen - dus partikels die n fluoroforen verwachting geleidelijk bleekmiddel produceren een intensiteit profiel met n trappen.- Extract intensiteit profielen van elk deeltje van de mat bestand. Gegenereerd door u-track of soortgelijke detectie / tracking software (zie 4.2.6).
- Gebruik een stap fitting algoritme, zoals die gepresenteerdin ref. 10, het aantal bleken stappen voor elk deeltje tellen.
- Optioneel: gebruik de resultaten verdelingen die de relatieve abundantie van receptor deeltjes van verschillende grootte te genereren en correleren met deeltjesdichtheid zoals eerder beschreven voor de resultaten van de gemengde Gaussische fitting (zie 4.3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De beschreven protocol kan worden toegepast op een verscheidenheid van andere membraaneiwitten. Als voorbeeld, worden representatieve resultaten verkregen met β 2-adrenerge en GABA B-receptoren gemeld 10. Aangezien fluorescente signalen van enkele moleculen zwak, minimalisering van de achtergrond fluorescentie is de eerste cruciale stap succesvolle resultaten. Derhalve is het belangrijk om uitgebreid gereinigd dekglaasjes (Figuur 2A) gebruikt als monster autofluorescentie (bijv.., Met fenolrood-vrij medium) te minimaliseren. De volgende stap is de fluorescentie-intensiteit van enkele fluorofoor moleculen te bepalen. Dit kan door beeldvorming enkele fluoroforen gespot op een schone dekglaasje (figuur 2B). Typisch wordt een seriële verdunning van de fluorofoor gebruikt om de beste omstandigheden voor onderzoek selecteren, dwz. De concentratie die goed gescheiden en gelijkmatig enkele fluoroforen produceert. Extra contRols kan door beeldvorming monomere controle eiwitten, bijvoorbeeld., NAP-gelabeld CD86 receptoren gelabeld met een fluorofoor-BG derivaat. Na deze voorlopige controles en kalibratie uitgevoerd, kan de werkelijke experimenten beginnen. Figuur 3A toont het eerste frame van een typisch beeld TIRF sequentie van een cel getransfecteerd met SNAP-gelabeld β 2-adrenerge receptoren en gelabeld met een fluorofoor-BG derivaat. De vlekken vertegenwoordigen enkele receptoren of receptor complexen. Deze afbeelding toont ook een geschikte deeltjesdichtheid voor automatische detectie en volgen -. Volgens onze ervaring dichtheden boven 0,45 deeltjes / um 2 resulteren in een slechte kwaliteit volgen en moet worden vermeden 10 Figuur 3B toont de resultaten van het algoritme toegepast op dezelfde sequentie van beelden. Elke blauwe cirkel geeft een waargenomen deeltje. De resultaten van de tracking-algoritme worden weergegeven in figuur 3C,waar de blauwe splines vertegenwoordigen de trajecten van de afzonderlijke deeltjes. De trajecten van elk deeltje kan dan worden gebruikt om de diffusie coëfficiënten te berekenen. Deze werkwijze maakt het ook vastleggen dynamische gebeurtenissen zoals in Figuur 3D, waarbij twee deeltjes blijkbaar ondergaan een voorbijgaande interactie. Figuur 4 toont de verdeling van diffusiecoëfficiënten gemeten voor twee verschillende GPCR's, dwz., Β 2-adrenerge en GABA B-receptoren. Dit type analyse konden we zien dat een groot deel van GABA B-receptoren immobiel of heeft een zeer lage mobiliteit 10. De gemengde Gaussian montage en stap passende analyses geven een nauwkeurige kwantificering van de omvang van receptor complexen op het oppervlak van levende cellen (Figuur 5). Deze analyse kan openbaren complexe verdelingen, bijvoorbeeld. De coëxistentie van monomeren en dimeren zoals in het voorbeeld van figuur 5A.Figuren 5B en 5C geven twee voorbeelden van deeltjes bleken in een of twee stappen en de bijbehorende stappen passende analyse correct toegewezen als monomere en dimere receptoren respectievelijk.
Figuur 1. Workflow van een typische single-molecule experiment zoals beschreven in dit protocol. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Coverslip reiniging en voorbereiding van ijkmonsters. (A)Vergelijking van de achtergrond fluorescentie voor en na uitgebreide dekglaasje reiniging. Dekglaasjes werden afgebeeld door TIRF microscopie. (B) TIRF beelden van toenemende concentraties van een fluorofoor-BG derivaat gespot op gereinigde dekglaasjes. Schaal bar:. 10 micrometer Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Typische single-molecule beelden en de resultaten van de detectie / bijhouden van algoritmen. (A) CHO cellen die met SNAP-gelabeld β 2-adrenerge receptoren en gelabeld met een fluorofoor-BG-derivaat werden gevisualiseerd door TIRF microscopie. Getoond wordt het eerste frame van de verkregen sequentie van beelden. Schaalbalk:. 5 micrometer (B)0; gedetecteerde deeltjes worden aangegeven met blauwe cirkels op de top van het originele beeld (C) De trajecten die uit de toepassing van de tracking algoritme om dezelfde afbeelding volgorde worden weergegeven op een witte achtergrond.. De snapshot komt overeen met de situatie op framenummer. 35. Green segmenten, het samenvoegen van evenementen. Rode segmenten, splitsen evenementen. (D) Vertegenwoordiger trajecten verkregen uit twee receptor deeltjes (blauw en groen, respectievelijk), het ondergaan van een schijnbare voorbijgaande interactie (rood). De twee deeltjes samen te voegen, samen bewegen voor verschillende frames, en splitsen weer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Analyse van de receptor mobility. De trajecten van individuele deeltjes worden gebruikt om hun diffusiecoëfficiënten berekenen. In dit voorbeeld zijn de verdelingen van diffusie coëfficiënten berekend voor twee verschillende GPCR's gemeld. β 2-adrenerge receptoren worden gekenmerkt door snelle laterale diffusie op het celoppervlak, terwijl GABA B-receptoren beperkte mobiliteit. Gewijzigd van Calebiro, D. et al.. 10
Figuur 5. Analyse van de grootte van receptor complexen. (A) De grootte van receptorcomplexen nauwkeurig worden geschat door het aanbrengen van de verdelingen van deeltjes intensiteiten met een gemengde Gaussische model. De gerapporteerde voorbeeld toont de toepassing van deze analyse aan een cel tot expressie SNAP-gelabeld β 2-drenergic receptoren. De montage onthult twee components: een die overeenkomt met de intensiteit van enkele fluoroforen (voornamelijk superponeerbare die ijkmonsters en de verdeling verkregen na gedeeltelijke bleken van het monster, hier getoond) en een met ongeveer het dubbele intensiteit. De twee componenten kunnen als monomeren en dimeren, (B) Voorbeeld van een monomere receptor deeltjes bleken in een stap worden toegewezen respectievelijk, en de gebieden onder de twee componenten kan worden gebruikt om de relatieve abundantie van monomere en dimere receptoren.. (C ) Voorbeeld van een dimere receptor deeltje met de karakteristieke twee stappen bleken. De rode lijnen in (B) en (C) zijn het resultaat van de stap-fitting algoritme. Het cijfer werd gewijzigd van Calebiro, D. et al.. 10 Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De beschreven protocol maakt analyse van de ruimtelijke ordening, mobiliteit en grootte van celoppervlak receptor-complexen bij individuele molecuul. Vergeleken met het gebruik van fluorescente proteïnen, labeling met kleine organische fluoroforen, die helderder en fotostabiel zijn, heeft het voordeel van het toestaan uitgebreide visualisatie van een enkele receptor deeltjes. Aangezien extreem lage expressieniveaus worden verkregen (<0,45 receptor deeltjes / um 2) de eigenschappen van receptoren en andere membraaneiwitten kunnen worden geanalyseerd dichtheid van ten hoogste fysiologische degenen. Bovendien zijn de gevolgen van receptor stimulatie met 10 agonisten of andere manipulaties, bijvoorbeeld om het reproduceren van een pathologische situatie kan worden geanalyseerd. Bovendien, vanwege de flexibiliteit van het etiket strategie SNAP / CLIP markeringen 11,12, verschillende fluoroforen worden gebruikt volgens zijn specifieke behoeften - Opvallend is de combinatie van SNAPen CLIP tags kunnen worden gebruikt om twee kleuren experimenten, zoals voeren. aan de colocalization nemen tussen twee interagerende eiwitten. Tenslotte kan dit protocol worden gewijzigd op verschillende punten, bijvoorbeeld met behulp van verschillende cellen, transfectie en etikettering strategieën.
Kritische stappen omvatten de minimalisering van de achtergrond en autofluorescentie (met behulp van uitgebreid gereinigd dekglaasjes, fenol-rood vrije media en gefilterd oplossingen), de optimalisering van transfectie (bijv.., Hoeveelheid plasmide-DNA en de tijd na transfectie) tot zeer lage expressie niveaus te bereiken , efficiëntie-etikettering en de keuze van een heldere en voldoende fotostabiel fluorophore. Wat de keuze van de fluorofoor, rood / ver-rode meestal geven betere resultaten omdat mobiele autofluorescentie is hoger in het blauw / groene deel van het zichtbare spectrum en gewoonlijk bijna te verwaarlozen boven 550 nm. Bijzondere aandacht moet worden besteed aan het vermijden van fotoblekingde fluoroforen tijdens de zoektocht naar een geschikte cel en scherpstelling. Monsters met fluoroforen gespot op dekglaasjes als monomeer en dimeer receptor controles (bv., CD86 met een of twee SNAP-tags) 10 moet worden overwogen om de analyse te kalibreren en controleren etikettering efficiëntie.
De beperkingen van deze benadering zijn grotendeels afhankelijk van de spatiotemporele resolutie die nog kan worden bereikt. Dit wordt meestal bepaald door het aantal fotonen vanuit een fluorofoor en de gevoeligheid en acquisitiesnelheid van de gebruikte camera. Typische waarden voor de lokalisatie precisie van een gedetecteerde deeltje 20 - 30 nm (ter vergelijking de ruimtelijke resolutie van conventionele fluorescentiemicroscopie ongeveer 200-300 nm). Deze waarden zijn steeds groter dan de werkelijke grootte van een typisch membraaneiwit (ongeveer 2 - 8 nm). Aangezien receptoren vallen op een afstand onder de diffractie limiet van het microscope (ongeveer 200-300 nm) worden gedetecteerd als een enkel deeltje, moeten passende controles en statistische analyses worden gebruikt om willekeurige colocalizations (false positives) af te trekken van het aantal echte receptor-receptor interacties 8-10 De maximale opnamesnelheid haalbaar met. huidige EMCCD camera's dan 1 kHz, althans gewassenwijze (dwz. wordt slechts een deel van de gebruikte sensor). Echter, de opnamesnelheid ook beperkt door het aantal fotonen uitgezonden door een fluorofoor dat de camera bereikt. In de praktijk belichtingstijden van ten minste 10 - 20 msec zijn algemeen nodig. Daarom typische acquisitie snelheden variëren tussen 10 en 50 Hz, dwz. Een lijst elke 20 tot 100 msec. Toekomstige ontwikkelingen in fluorofoor ontwerp, optische componenten en detectie technologie zou kunnen stellen om verdere toename van de spatiotemporele resolutie van single-molecule methoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | AppliChem GmbH | A1585 | CAUTION: toxic and irritating substance as well as a possible carcinogen |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | CAUTION: strong base and highly corrosive reagent |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 32205 | |
| Glass coverslip | Marienfeld-Superior | 111640 | 24 mm diameter, 0.13-0.16 mm thickness |
| 0.2 mm sterile filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| CHO cells | ATCC, USA | ATCC CCL-61 | Chinese hamster ovary cell line |
| 6-well cell culture plate | Nunc | 140675 | |
| DMEM/F-12 medium | GIBCO, Life Technologies | 11039-021 | Phenol-red free medium |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S 0115 | |
| Penicillin - streptomycin | Pan Biotech GmbH | P06-07 100 | |
| Trypsin-EDTA | Pan Biotech GmbH | P10-23100 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Life Technologies | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen, Life Technologies | 31985-047 | |
| Fluorophore-conjugated benzylguanine | New England BioLabs | S9136S | SNAP-Surface Alexa Fluor 647. Make a 1 mM stock solution in DMSO. Store at -20°C. |
| DMSO | AppliChem GmbH | A1584 | |
| Imaging buffer: | 137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.3, sterile-filtered | ||
| NaCl | AppliChem GmbH | A1371 | |
| KCl | AppliChem GmbH | A3582 | |
| CaCl2 | AppliChem GmbH | A2303 | |
| MgCl2 | AppliChem GmbH | A3618 | |
| HEPES | AppliChem GmbH | A3724 | |
| Imaging chamber | Molecular Probes, Life Technologies | A-7816 | Attofluor Cell Chamber, for microscopy |
| TIRF-M | Leica | Model: DMI6000B | |
| TIRF objective | Leica | 11 506 249 | HCX PL Apo 100x/1.46 Oil CORR |
| EM-CCD camera | Roper Scientific | Photometrics Cascade 512B | |
| Temperature controller | Pecon | Tempcontrol 37-2 digital | |
| ImageJ software | NIH, USA | http://rsbweb.nih.gov/ij | |
| u-track software | Laboratory for computational cell biology, Dept. of Cell Biology, Harvard Medical School, USA | http://lccb.hms.harvard.edu/software.html | |
| Matlab software | The MathWorks, USA |
References
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J.
- Angers, S., Salahpour, A., Bouvier, M. Dimerization: an emerging concept for G protein-coupled receptor ontogeny and function. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 42, 409-435 (2002).
- Ferré, S., et al. Building a new conceptual framework for receptor heteromers. Nat Chem Biol. 5, 131-134 (2009).
- Milligan, G. G. protein-coupled receptor hetero-dimerization: contribution to pharmacology and function. Br J Pharmacol. 158, 5-14 (2009).
- Lohse, M. J. Dimerization in GPCR mobility and signaling. Curr Opin Pharmacol. 10, 53-58 (2010).
- Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y.
- Triller, A., Choquet, D. New concepts in synaptic biology derived from single-molecule imaging. Neuron. 59, 359-374 (2008).
- Hern, J. A., et al. Formation and dissociation of M1 muscarinic receptor dimers seen by total internal reflection fluorescence imaging of single molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 2693-2698 (2010).
- Kasai, R. S., et al. Full characterization of GPCR monomer-dimer dynamic equilibrium by single molecule imaging. J Cell Biol. 192, 463-480 (2011).
- Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 743-748 (2013).
- Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nat Biotechnol. 21, 86-89 (2003).
- Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chem Biol. 15, 128-136 (2008).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat Methods. 5, 695-702 (2008).
- Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: applications to membrane dynamics. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 26, 373-399 (1997).
