Abstract
Single-molekyl mikrosfremstår som en kraftfull tilnærming til å analysere atferden til signalmolekyler, særlig når det gjelder de aspekt (f.eks., Kinetikk, sameksistens mellom ulike stater og bestander, forbigående interaksjoner), som vanligvis er skjult i ensemble målinger, som for eksempel de som oppnås med vanlige biokjemiske eller mikroskopi metoder. Således, dynamisk hendelser, slik som reseptor-reseptor-interaksjoner, kan bli etterfulgt i sann tid i en levende celle med høy oppløsning tid og rom. Denne protokollen beskriver en metode basert på merking med små lyse og organiske fluoroforer og total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi for å visualisere direkte enkelt-reseptorer på overflaten av levende celler. Denne tilnærmingen gjør det mulig å nøyaktig lokalisere reseptorer, måle størrelsen på reseptor komplekser, og fange dynamiske hendelser som forbigående reseptor-reseptor interaksjoner. Protokollen gir en detaljert beskrivelse av hvordan du perform en single-molekyl eksperiment, blant annet eksempler på bildeanalyse forberedelse, image oppkjøpet og. Som et eksempel på anvendelsen av denne metoden analysere to G-protein-koblede reseptorer, f.eks., Β 2-adrenerge og γ-aminosmørsyre type B (GABA B) reseptoren, er rapportert. Protokollen kan tilpasses til andre membranproteiner og forskjellige cellemodeller, transfeksjonsmetoder og merking strategier.
Introduction
Reseptorer lokalisert på celleoverflaten avføle det ekstracellulære miljø og svare på en rekke stimuli, som for eksempel luktstoffer, ioner, små nevrotransmittere og store proteinhormoner. Væsken natur cellulære membraner tillater bevegelser av reseptorer og andre membran proteiner. Dette er viktig for dannelsen av proteinkompleksene og forekomst av transiente protein-protein interaksjoner, slik som de som brukes av reseptorer for å montere inn i funksjonelle enheter, og transduce-signaler inn i cellens indre. For eksempel, G-protein-koblede reseptorer (GPCR), som utgjør den største familie av celleoverflatereseptorer 1, er blitt foreslått å danne di-/oligomers, som synes å være involvert i finjustert regulering av signaltransduksjon og kan ha viktige fysiologiske og farmakologiske konsekvenser 2-5.
Single-molekyl mikroskopi har det store potensialet for direkte visualisere med høy spatiotemporal oppløsning den dynamiske oppførsel av individuelle reseptorer lokalisert på overflaten av levende celler, inkludert deres forening til å danne dimerer og høyere ordens molekylære komplekser 6-10. Dette gir flere fordeler sammenlignet med vanlige biokjemiske og mikroskopi metoder, som vanligvis rapporterer den gjennomsnittlige oppførsel av tusenvis eller millioner av molekyler.
Proteinmerking med tilstrekkelig lys og photo fluoroforen er viktig for enkelt-molekyl mikroskopi. Denne protokollen tar fordel av den nylig innførte SNAP tag 11 til kovalent feste små og lyse organiske fluoroforene til celle-overflate reseptorer. SNAP er et 20 kD protein-koden avledet fra humant DNA reparasjonsenzym 6-alkylguanine-DNA alkyltransferase, som kan være irreversibelt merket med fluorofor-konjugert benzylguanine (fluorofor-BG)-derivater. CLIP, en ytterligere konstruert signal avledet fra SNAP, kan i stedet merket med fluorofor-conjugated benzylcytosine derivater 12.
Protokollen rapportert i dette manuskriptet forklarer hvordan du transfektere og etiketten SNAP-merket 11 reseptorer med små organiske fluorophores og bruke total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi for å visualisere enkelt reseptorer eller reseptor komplekser på overflaten av levende celler 10. De rapporterte protokollresultatene i> 90% merking effektiviteten av et ekstracellulært SNAP-merket celle-overflateprotein 10. Ytterligere informasjon om hvordan man skal benytte en-molekyl data for å analysere størrelsen og mobiliteten av reseptor-komplekser, så vel som for å fange opp kortvarige reseptor-reseptor-vekselvirkninger, er gitt. En skjematisk arbeidsflyt av hele protokoll er gitt i figur 1.. Som et eksempel, transfeksjon av kinesisk hamsterovarie (CHO) celler med SNAP-merket G-protein-koblede reseptorer (GPCR), etterfulgt av merking med en fluorofor-BG-derivat som vel som sin søknad til quantify og monitor reseptor di-/oligomerization er beskrevet. Denne protokollen kan bli utvidet til andre celle-overflateproteiner og fluorescerende tags (f.eks., CLIP), samt til andre transfeksjonsteknologier og merking metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Prøvepreparering
- Dekk rengjøring
MERK: Arbeid under en avtrekkshette.- Bruk rene pinsett til å plassere glass dekkglass (24 mm diameter) i en dekk holder som skiller enkeltdekkglass.
- Sett holderen med dekkglass i en beholder, og legge kloroform til Dekkglass er dekket. Dekk til med aluminiumsfolie begerglass for å redusere avdamping og sonicate i et bad sonicator i 1 time ved RT. Ta dekkholderen ut av begerglass og la Dekk tørr.
- Gjenta trinn 1.1.2 med 5M NaOH-løsning i stedet for kloroform.
- Ta dekkholderen inn i en ny begerglass og vaskes tre ganger med destillert vann. Sett renset dekkglass i et glass cellekulturplate fylt med 100% etanol.
- Utarbeidelse av kalibreringsprøvene
- Oppløse fluorescerende fargestoff i passende løsemiddel.
- Forbered en 01:10 seriell fortynning av fluorescerende fargestoff som spennerfra 13:00 til en nM i filteret sterilisert (0,22 mikrometer) vann.
- Ta renset dekkglass som er lagret i 100% etanol og vask med filter-sterilisert vann. Spot 20 mL av hver fluorescerende fargestoff fortynning på en egen renset dekkglass. La Dekk tørke under en steril hette. Beskytt Dekk mot lys og støv før bruk. Bruk disse prøvene for å beregne intensiteten av enkelt fluorescerende molekyler (se trinn 3).
- Transfeksjon
- Kultur CHO-celler i 01:01 Dulbeccos modifiserte Eagle medium / næringsblanding F-12 (DMEM/F12) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin ved 37 ° C, i . 5% CO 2 MERK: Bruk fenol-rød frie medier gjennom hele forsøket for å minimere autofluorescence.
- Ta renset dekkglass av 100% etanol-løsning, vaskes med steril fosfat-bufret saltvann (PBS), og sette inn en dekkglass i hver brønn av en 6 godt cellekultur plspiste.
- Trypsinize, telle og frø CHO-celler ved en tetthet på 3 x 10 5 celler / brønn på 6-brønners cellekulturplate som inneholder dekkglass. La cellene vokse i en inkubator (37 ° C, 5% CO2) i 24 timer for å oppnå ca. 80% konfluens, som er den optimale celletetthet for transfeksjon.
- For hver brønn, fortynne 2 mikrogram av ønsket plasmid DNA (f.eks., SNAP-merket β 2-adrenerge reseptorer) og 6 mL Lipofectamine 2000 i to separate rør som inneholder 500 mL OptiMem medium. Inkuber ved RT i 5 min.
- Kombiner oppløsningene fra trinn 1.3.4 inn i et rør og blande for å oppnå en transfeksjon blanding. Inkuber transfeksjon blandingen ved RT i 20 min.
- Under inkubasjonstiden (1.3.5), ta CHO celler og vask to ganger med forvarmede (37 ° C) PBS. Erstatt PBS med 1 ml / brønn av fenolrødt-fritt DMEM/F12 medium supplert med 10% FBS, men uten antibiotika.
- Legg hele transfektereion blanding (1 ml) fra trinn 1.3.5 dråpevis til hver brønn, og rist platen frem og tilbake for å sikre fullstendig blanding.
- Inkuber for 2 til 4 timer ved 37 ° C, i 5% CO 2 og fortsette umiddelbart etterpå til neste trinn. MERK: Disse transfeksjon forholdene har blitt optimalisert for å oppnå reseptor tettheter <0,45 partikkel / mikrometer 2, som er egnet for single- molekyl bildebehandling. Justeringer kan være nødvendig ved bruk av ulike celler, konstruerer eller reagenser.
- Protein merking
- Fortynn 1 mL av fluorofor-BG stamløsning i 1 ml DMEM/F12 medium supplert med 10% FBS for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 1 mM. Ta de transfekterte celler fra inkubatoren og vaskes to ganger med forvarmet (37 ° C) PBS. Erstatt PBS med 1 ml 1 mM fluorofor-BG-løsning og inkuberes i 20 min ved 37 ° C 5% CO2 i en inkubator.
- Etter inkubering vaskes cellene treganger med DMEM/F12 medium supplert med 10% FBS, hver gang etterfulgt av 5 min inkubasjon ved 37 ° C. Ta et dekkglass (med merkede celler) med pinsett og legg den i en avbildning kammer.
- Vask to ganger med 300 mL bildebuffer. Legg 300 mL av fersk bildebufferen og fortsette umiddelbart til bildebehandling (del 2).
2. Image Acquisition
MERK: Bruk en total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskop, utstyrt med en olje-nedsenking høy numerisk apertur objektiv (f.eks 100X magnification/1.46 numerisk apertur.), Egnede lasere (f.eks 405 nm, 488 nm, 561 nm og 645 nm diodelasere), en elektron multiplisere ladningskoblet anordning (EMCCD) kamera, en inkubator og en temperaturkontroll for å visualisere én fluorescerende molekyler.
- Sett ønsket mikroskop parametre, dvs.., Laserlinje, TIRF vinkel (denne parameteren styrer inntrengningsjon dybden av flyktige feltet), eksponeringstid, bildefrekvens og antall bilder per film 10. Hold varmeapparat / inkubator og temperaturkontroll alltid på å unngå temperatur driver og kondens.
- Ta en dråpe immersjonsolje på 100X målet med mikroskop. Plasser bilde kammer med de merkede cellene på prøveholderen i mikroskopet, og bringe cellene i fokus med lysfelt belysning.
- Bytt til TIRF belysning. Hold laser strøm så lav som mulig, slik at leting etter den ønskede cellen, men på samme tid minimalisere fotobleking.
- Velg ønsket celle og fin justere fokus. Sett lasereffekten til et nivå som tillater visualisering av enkelt fluoroforer. Acquire bildesekvens og lagre rå bildesekvens filen som. Tiff.
Tre. Kalibrering (Enkelt fluoroforene om Glass og Monomere / dimeriske Receptor Controls)
- Monter hver kalibrering sample fremstilt som beskrevet i 1.2 i bilderommet. Plasser hver prøve på mikroskopet og velge den prøve som inneholdt godt adskilt diffraksjons-begrenset flekker som blekemiddel i et enkelt trinn. MERK: Disse flekker representerer enkeltmolekyler av det fluorescerende fargestoff.
- Acquire TIRF bildesekvenser som beskrevet i trinn to. Viktig: de samme bildeparametere må brukes for alle eksperimenter, inkludert de for kalibrering.
- Utfør gjenkjenning og sporing analyse som beskrevet i 4.1 til 4.2. Ekstraher intensiteten av hver partikkel som beskrevet i 4.2.6. Fra disse data, beregne gjennomsnittet (μ) og standard avvik (σ) av intensiteten av enkelt fluoroforer.
- Valgfritt: utføre den samme analyse på celler transfektert med et monomert celleoverflatereseptoren (. F.eks, CD86), N-terminalt merket med enten en eller to kopier av SNAP 10 og merket med fluorofor-BG-derivat. Follow fremgangsmåten beskrevet ovenfor for enkelt fluoroforen på glass. Anslå merking effektivitet som beskrevet i Calebiro, D. et al. 10
4. Bildeanalyse
- Bildesekvens forberedelse
- Bruk et bildebehandlingsprogram (f.eks., ImageJ) å beskjære bildene.
- Lagre enkeltbilder som separate. TIFF-bilder i en ny mappe, noe som indikerer på hvert bilde rammenummeret.
- Mål celleoverflate ved å tegne en region av interesse (ROI) langs konturen av en celle, og ved hjelp av måleverktøyet i ImageJ eller et lignende verktøy i en annen programvare. Bruk denne verdi å beregne partikkeltetthet ved å dividere det totale antall partikler som i begynnelsen av filmen ved celleoverflate.
- Partikkel gjenkjenning og sporing
MERK: Bruk ikke-kommersiell programvare, for eksempel u-spor 13, som arbeider i Matlabmiljø, for å automatisk oppdage og spore enkelt reseptor partikler.
MERK: u-spor algoritmen er basert på multiple-hypotesen sporing tilnærming. Denne tilnærmingen knytter partikler mellom rammer ved å bygge kostnads matriser, hvor de enkelte sannsynlighetene for at en gitt partikkel i én ramme tilsvarer en gitt partikkel i neste ramme, vises, forsvinner eller fusjonerer / deler med / fra andre partikler er tildelt. Den løsningen som globalt minimerer kostnadene, altså., Den med størst sannsynlighet, er endelig valgt. Dette gjør det også mulig å spore en midlertidig forsvinner partikkel, et typisk fenomen forårsaket av fluoroforen blinker. Den nyeste versjonen av u-spor (2.1.0) har grafisk brukergrensesnitt som letter utførelsen av disse analysene.- Fra Matlab ledeteksten, skriv "movieSelectorGUI" for å åpne filmen valg av grensesnitt. Følg instruksjonene for å opprette enny film database starter fra de tidligere lagrede separate bilder (se 4.1.2).
- Gi pikselstørrelsen i nm, tidsintervall i sekunder, numerisk blenderåpning, kamera bitdybde og utslipp bølgelengde av fluoroforen, kreves for partikkel deteksjon og sporing. Lagre filmen database.
- Fra filmen valg av grensesnitt, kjøre analysen, velger "single-partikler" som type objekter. Et nytt vindu vil dukke opp hvor de parametrene som brukes for partikkel deteksjon og sporing kan defineres. Begynn med standardparameterne. Senere, justere disse parametrene hvis kvaliteten på deteksjon og / eller sporing er ikke tilfredsstillende (f.eks, noen partikler ikke registrert eller spor er fragmentert) Valgfritt:. Under sporingsinnstillinger, sjekk "Export sporingsresultatene til matrise-format" for å lagre koordinatene og amplituder for alle partikler i en enkelt matrise (felt kalt "trackedFeaturedInfo"). For en nærmere beskrivelse av disse parametrene, kan du se dokumentasjonen u-spor.
- Kjør algoritme. Denne algoritmen bestemme plasseringen og intensitet over bakgrunn av hver diffraksjon begrensede base (f.eks., Enkelt reseptorer / receptor-komplekser) etter montering av en to-dimensjonal gaussisk funksjon med standard avvik lik punktspredefunksjon av mikroskopet rundt lokale intensitet maksima automatisk . Deretter kjører sporingsalgoritme. Lagre resultatene av analysene i en. Matte fil.
- Bruk "movieViewer" rutine, som finnes i u-sporet pakken, eller lignende tilpasset seg å visualisere spor og sjekke kvaliteten på gjenkjenning og sporing.
- Åpne. Matten fil for å se stillingen og amplitude (f.eks., Intensitet) av de sporede partikler på hver ramme. Data generert i trinn 4.2.4 finnes i tracksCoordAmpCG feltet i tracksFinal array og / eller i trackedFeaturedInfo. Fra det totale antall partikler som er detektert beregne partikkeltetthet dividere denne verdi med celleoverflatearealet målt ved 4.1.3.
- Valgfritt: Bruk partikkel koordinater over tid, (se 4.2.6) for å analysere bevegelse av reseptor-partikler. Beregn middelkvadrat forskyvninger (MSD) og diffusjonskoeffisienter (D) ved hjelp av Matlab eller lignende programvare. For hver partikkel, og hvert tidsintervall (Δ t) betraktes, beregner den midlere kvadrat forskyvning (MSD) ved hjelp av følgende formel:
hvor Δ t er tidsintervallet i rammer, N er antall trinn som er analysert, x og y er partikkelens x-og y-koordinatene på en ramme som angis av indeksen. Bruk MSD over tid-plott for å evaluere typen av bevegelse av en gitt partikkel: Form relasjonerindikere fri diffusjon (ie., Brownske bevegelser), en positiv krumning (ie., ser kurven som en parabel) antyder rettet bevegelse, er en negativ krumning indikerer begrenset bevegelses 14. Ved fritt diffuserende partikler, beregne diffusjonskoeffisienten (D) for hver partikkel ved å montere de oppnådde MSD data med følgende ligning:
- Beregning av partikkelstørrelse med Gaussian passende metode
MERK: Når intensiteten distribusjon av kalibreringsprøvene (single fluoroforer på glass og / eller fluorescensmerkede monomere reseptorer) er kjent, utføre en blandet Gaussian passform på fordelingen av partikkel intensiteter i begynnelsen av en bildesekvens for å bestemme størrelsen på reseptor komplekser (ie., antall reseptorer per partikkel) 10. Utfør disse analysene bruker Matlab eller similar programvare.- Beregn intensiteten av hver partikkel ved å ta gjennomsnittet av intensiteten av den partikkel fra den første ramme til rammen før den første endringen i intensitet forekom (i de fleste tilfeller en reduksjon skyldes fotobleking).
- Utfør en blandet Gaussian montering i henhold til følgende ligning:
hvor φ (i) er frekvensen av partikler med intensitet I, n er komponenten nummer, α n er en parameter som bidrar til høyden av komponent n, μ og σ er middelverdien og standardavviket for intensiteten av referanseenkelt fluoroforer . (beregnet som beskrevet i trinn 3) MERK: Bestem tHan maksimale antall komponenter (n maks) for hvert bildesekvens ved å variere n maks før tilsetningen av en komponent som ikke produserer ikke lenger en statistisk bedre passform, som bedømt ved en F-test. - Valgfritt: (. F.eks, de siste 60 bilder av en 400 ramme sekvens) Gjennomfør en blandet Gaussian passe på intensiteten distribusjon innhentet på de siste bildene av filmen. Bytt μ og σ med verdiene oppnådd etter dette passer, som gir raffinerte estimater for disse parametrene, og gjenta trinn 4.3.2.
- Beregne arealet under kurven (AUC) for hver komponent i den blandede gaussisk form. Beregn den relative overflod av reseptor-partikler av forskjellig størrelse (dvs. monomer, dimer, trimer, etc.) ved å dividere AUC-verdien av hver komponent av AUC for hele fordelingen.
- Valgfritt: Bruk av data fra forskjellige celler og de tilsvarende partikkel-densiteter (beregnet som beskrevet i 4.2.6) for å generere flater hvor fordelingen av partikler med forskjellige størrelser som er korrelert med partikkeltetthet 10.
- Beregning av partikkelstørrelse med trinn montering fremgangsmåte
MERK: Bruk et skritt sittende analyse som en alternativ metode for å bestemme størrelsen på reseptor komplekser 10. Til grunn for denne analysen er at lys-indusert ødeleggelse (photobleaching) av en enkelt fluoroforen resulterer i sin øyeblikke forsvinning - dermed partikler inneholdende n fluoroforer er forventet å progressivt blekemidler produsere en intensitetsprofil med n trinn.- Pakk intensitet profiler av hver partikkel fra. Matten fil generert av u-spor eller lignende oppdagelse / sporing (se 4.2.6).
- Bruk et trinn sittende algoritme, slik som den presentertei ref.. 10, for å telle antall bleketrinn for hver partikkel.
- Valgfritt: bruke resultatene for å generere fordelinger som viser den relative mengde av reseptor-partikler av forskjellig størrelse og korrelere dem med partikkeltetthet som tidligere beskrevet for resultatene av den blandede Gaussian beslaget (se 4.3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den beskrevne protokoll kan anvendes på en rekke forskjellige membranproteiner. Som et eksempel, er representative resultater oppnådd med β 2-adrenerge og GABA-B-reseptorer rapportert 10.. Siden fluorescerende signaler fra enkle molekyler er svake, er minimering av bakgrunnsfluoresens det første viktig steg til vellykkede resultater. Således er det viktig å bruke omfattende renset dekkglass (figur 2A), så vel som for å minimalisere prøve autofluorescens (f.eks., Ved hjelp av fenol-rød frie media). Det neste trinn er å bestemme fluorescens-intensiteten av enkelt fluoroformolekyler. Dette kan gjøres ved bildebehandling enkelt fluoroforene oppdaget på en ren dekkglass (figur 2B). Vanligvis er en seriell fortynning av fluoroforen som brukes for å velge de beste forutsetninger for analysen, f.eks. Konsentrasjonen som gir godt adskilt og jevnt fordelte enkelt fluoroforer. Tilleggs fortsrols kan utføres av tenkelig monomere kontroll proteiner, f.eks., NAP-merket CD86 reseptorer merket med en Fluoroforen-BG derivat. Når disse foreløpige kontroller og kalibrering er utført, kan de virkelige eksperimenter begynne. Figur 3A viser den første rammen i en typisk TIRF bildesekvens av en celle tilført med SNAP-merket β 2-adrenerge reseptorer og merket med en Fluoroforen-BG derivat. Flekkene representerer enkelt reseptorer eller reseptor komplekser. Dette bildet viser også en egnet partikkeltetthet for automatisk deteksjon og sporing -. Ifølge vår erfaring, tettheter over 0,45 partikler / mikrometer 2 resultere i dårlig relativ kvalitet og bør unngås 10 Figur 3B viser resultatene av den algoritme som brukes på samme bildesekvens. Hver blå sirkelen indikerer en oppdaget partikkel. Resultatene av sporingsalgoritmen er rapportert i figur 3C,hvor de blå splines representerer baner av de individuelle partikler. De baner av hver partikkel kan deretter brukes til å beregne sin diffusjonskoeffisienter. Denne metode gjør det også mulig å fange dynamiske arrangementer som vist i figur 3D, hvor to partikler tilsynelatende gjennomgå en transient interaksjon. Figur 4 viser fordelingen av diffusjonskoeffisienter målt for to forskjellige GPCR, dvs.., Β 2-adrenerge og GABA-B-reseptorer. Denne type analyse tillatt oss å vise at en stor andel av GABA B-reseptorer er immobile eller har en svært lav mobilitet 10. Det blandede Gaussian montering og trinn sittende analyser gir en nøyaktig kvantifisering av størrelsen av reseptor-komplekser på overflaten av levende celler (figur 5). Denne analysen kan også avsløre komplekse fordelinger, f.eks. Den sameksistens av monomerer og dimerer som er vist i eksemplet i fig 5A.Figurene 5B og 5C gir to eksempler på partiklene bleking i ett eller to trinn, og det tilsvarende trinn sittende analyse at fullstendig tilordnet dem som monomere og dimere reseptorer, respektivt.
Figur 1. Arbeidsflyt av en typisk single-molekyl eksperiment som beskrevet i denne protokollen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Cover rengjøring og klargjøring av prøver kalibrerings. (A)Sammenligning av bakgrunnsfluorescens før og etter omfattende dekk rengjøring. Dekk ble fotografert av TIRF mikroskopi. (B) TIRF bilder av økende konsentrasjoner av en Fluoroforen-BG derivat oppdaget på rengjorte dekkglass. Målestokk:. 10 mikrometer Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Typiske single-molekyl bilder og resultater for påvisning / sporing algoritmer. (A) CHO celler transfektert med SNAP-merket β 2-adrenerge reseptorer og merket med en Fluoroforen-BG derivat ble visualisert ved TIRF mikroskopi. Vist er det første bildet av den oppkjøpte bildesekvens. Målestokk:. 5 mikrometer (B)0; oppdaget partiklene er indikert med blå sirkler på toppen av det opprinnelige bildet (C) De baner som oppstår ved anvendelsen av sporingsalgoritmen til samme bildesekvens er vist på en hvit bakgrunn.. Øyeblikksbildet svarer til situasjonen på ramme nei. 35. Grønne segmenter, sammenslåing hendelser. Røde segmenter, splitting hendelser. (D) Representative baner hentet fra to reseptor partikler (blå og grønn, henholdsvis), som gjennomgår en tilsynelatende forbigående samhandling (rød). De to partiklene flette, flytte sammen i flere rammer, og delt på nytt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Analyse av reseptor mobility. er de baner av individuelle partikler som brukes til å beregne sine diffusjonskoeffisienter. I dette eksemplet, er fordelingen av diffusjons-koeffisienter som beregnes for to forskjellige GPCR rapportert. β 2-adrenerge reseptorer er karakterisert ved hurtig lateral diffusjon på celleoverflaten, mens GABA-B-reseptorer har begrenset bevegelighet. Modifisert fra Calebiro, D. et al. 10
Figur 5. Analyse av størrelsen reseptor-kompleksene. (A) Størrelsen på reseptor-kompleksene kan være nøyaktig beregnet ved å tilpasse fordelingen av partikkel intensiteter med en gaussisk blandingsmodell. Den rapporterte eksempelet viser anvendelsen av denne analysen til en celle som uttrykker SNAP-merket β 2-drenergic reseptorer. Beslaget avslører to components: en som korresponderer med intensiteten av enkelt-fluoroforer (hovedsakelig superimposable til det av kalibreringsprøvene, så vel som fordelingen oppnådd etter partiell bleking av prøven, er vist her), og en med omtrent dobbelt intensitet. De to komponentene kan tildeles som monomerer og dimerer, henholdsvis, og områdene under de to komponentene kan bli brukt for å estimere den relative overflod av monomere og dimere reseptorer. (B) Eksempel på et monomert reseptor partikkel bleking i ett trinn. (C ) Eksempel på en dimer reseptor partikkel med den karakteristiske to-trinns bleking. De røde linjer i (B) og (C) er et resultat av trinnet sittende algoritme. Figuren ble endret fra Calebiro, D. et al. 10 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrevne protokoll tillater analyse av den romlige arrangement, mobilitet og størrelsen av celle-overflate-reseptor-kompleksene ved enkelt-molekyl nivå. Sammenlignet med bruk av fluorescerende proteiner, merking med små organiske fluoroforer, som er lysere og mer photo, har fordelen av å tillate utvidet visualisering av enkelt reseptor partikler. Siden ekstremt lave nivåer blir oppnådd (<0,45 reseptor partikler / mikrometer 2), egenskapene til reseptorene og andre membran-proteiner kan bli analysert ved tettheter som ikke overskrider fysiologiske seg. Videre er virkningene av reseptorstimulering med agonister 10 eller andre manipulasjoner for eksempel med sikte på å reprodusere en patologisk situasjon, kan analyseres. I tillegg, på grunn av fleksibiliteten av merking strategi med SNAP / klippet koder 11,12, forskjellige fluoroforer kan brukes i henhold til sine spesifikke behov - skal bemerkes at kombinasjonen av SNAPog CLIP-koder kan brukes til å utføre to-farge eksperimenter, f.eks., for å observere colocalization mellom to samspill proteiner. Endelig kan denne protokollen endres på flere punkter, for eksempel ved hjelp av forskjellige celler, transfeksjonsmetoder og merking strategier.
Kritiske trinnene omfatter minimering av bakgrunn og autofluorescence (ved hjelp av omfattende renset dekkglass, fenol-rød frie medier og filtrert løsninger), optimalisering av transfeksjon forhold (f.eks., Mengden av plasmid DNA og tid etter transfeksjon) for å oppnå ekstremt lave nivåer , effektiv merking og valget av en lys og tilstrekkelig photo fluoroforen. Når det gjelder valg av fluoroforen, rød / langt-red de vanligvis gi bedre resultater fordi mobil autofluorescence er høyere i den blå / grønne delen av det synlige spekteret og vanligvis nesten ubetydelig over 550 nm. Spesiell oppmerksomhet bør rettes mot å unngå fotobleking avfluoroforene under søket etter en passende celle og fokusjustering. Prøver med fluoroforene oppdaget på glass dekkglass samt monomere og dimeriske reseptor kontroller (f.eks., CD86 med enten en eller to SNAP tags) 10 bør vurderes å kalibrere analyse og sjekk merking effektivitet.
Grensene for denne tilnærmingen er i stor grad avhengig av tid og rom oppløsningen som kan oppnås tradisjonelt. Dette er for det meste bestemt av antall fotoner som samles inn fra en fluorofor samt av følsomheten og anskaffelseshastighet på kameraet benyttes. Typiske verdier for den lokaliseringspresisjon av en enkelt, detektert partikkel er 20 til 30 nm (for sammenligning den romlige oppløsningen av konvensjonelle fluorescens-mikroskopi er omtrent 200-300 nm). Disse verdiene er fremdeles større enn den virkelige størrelsen av en typisk membran protein (omtrent 2-8 nm). Siden reseptorer faller på en avstand nedenfor diffraksjon grensen av mikroomfang (ca 200-300 nm) blir gjenkjent som en enkelt partikkel, bør hensiktsmessige kontroller og statistiske analyser brukes til å trekke tilfeldige colocalizations (falske positiver) fra antall sanne reseptor-reseptor interaksjoner 8-10 Maksimal oppkjøpet kurs som kan oppnås med. omløps EMCCD kameraer kan overstige 1 KHz, i det minste i avling-modus (det vil si. blir bare en del av sensoren som brukes). Imidlertid er anskaffelseshastigheten også begrenset av det antall fotoner som sendes ut av en enkelt fluorofor som nå kameraet. I praksis tider på minst 10 eksponering - er 20 msek generelt nødvendig. Av denne grunn er typiske innhentingsHastigheten varierer mellom 10 og 50 Hz, f.eks. Ett ramme hver 20 til 100 millisekunder. Fremtidig utvikling i fluoroforen design, optiske komponenter og oppdagelsen teknologien kan tillate å ytterligere øke tid og rom oppløsning på single-molekyl metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | AppliChem GmbH | A1585 | CAUTION: toxic and irritating substance as well as a possible carcinogen |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | CAUTION: strong base and highly corrosive reagent |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 32205 | |
| Glass coverslip | Marienfeld-Superior | 111640 | 24 mm diameter, 0.13-0.16 mm thickness |
| 0.2 mm sterile filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| CHO cells | ATCC, USA | ATCC CCL-61 | Chinese hamster ovary cell line |
| 6-well cell culture plate | Nunc | 140675 | |
| DMEM/F-12 medium | GIBCO, Life Technologies | 11039-021 | Phenol-red free medium |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S 0115 | |
| Penicillin - streptomycin | Pan Biotech GmbH | P06-07 100 | |
| Trypsin-EDTA | Pan Biotech GmbH | P10-23100 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Life Technologies | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen, Life Technologies | 31985-047 | |
| Fluorophore-conjugated benzylguanine | New England BioLabs | S9136S | SNAP-Surface Alexa Fluor 647. Make a 1 mM stock solution in DMSO. Store at -20°C. |
| DMSO | AppliChem GmbH | A1584 | |
| Imaging buffer: | 137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.3, sterile-filtered | ||
| NaCl | AppliChem GmbH | A1371 | |
| KCl | AppliChem GmbH | A3582 | |
| CaCl2 | AppliChem GmbH | A2303 | |
| MgCl2 | AppliChem GmbH | A3618 | |
| HEPES | AppliChem GmbH | A3724 | |
| Imaging chamber | Molecular Probes, Life Technologies | A-7816 | Attofluor Cell Chamber, for microscopy |
| TIRF-M | Leica | Model: DMI6000B | |
| TIRF objective | Leica | 11 506 249 | HCX PL Apo 100x/1.46 Oil CORR |
| EM-CCD camera | Roper Scientific | Photometrics Cascade 512B | |
| Temperature controller | Pecon | Tempcontrol 37-2 digital | |
| ImageJ software | NIH, USA | http://rsbweb.nih.gov/ij | |
| u-track software | Laboratory for computational cell biology, Dept. of Cell Biology, Harvard Medical School, USA | http://lccb.hms.harvard.edu/software.html | |
| Matlab software | The MathWorks, USA |
References
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J.
- Angers, S., Salahpour, A., Bouvier, M. Dimerization: an emerging concept for G protein-coupled receptor ontogeny and function. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 42, 409-435 (2002).
- Ferré, S., et al. Building a new conceptual framework for receptor heteromers. Nat Chem Biol. 5, 131-134 (2009).
- Milligan, G. G. protein-coupled receptor hetero-dimerization: contribution to pharmacology and function. Br J Pharmacol. 158, 5-14 (2009).
- Lohse, M. J. Dimerization in GPCR mobility and signaling. Curr Opin Pharmacol. 10, 53-58 (2010).
- Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y.
- Triller, A., Choquet, D. New concepts in synaptic biology derived from single-molecule imaging. Neuron. 59, 359-374 (2008).
- Hern, J. A., et al. Formation and dissociation of M1 muscarinic receptor dimers seen by total internal reflection fluorescence imaging of single molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 2693-2698 (2010).
- Kasai, R. S., et al. Full characterization of GPCR monomer-dimer dynamic equilibrium by single molecule imaging. J Cell Biol. 192, 463-480 (2011).
- Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 743-748 (2013).
- Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nat Biotechnol. 21, 86-89 (2003).
- Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chem Biol. 15, 128-136 (2008).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat Methods. 5, 695-702 (2008).
- Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: applications to membrane dynamics. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 26, 373-399 (1997).
