Abstract
単一分子顕微鏡は、これらの側面（ 例えば 、動力学、異なる状態や集団、一時的な相互作用の共存）は、一般的にアンサンブル測定で隠されている、などに関して、特に、シグナル伝達分子の挙動を解析するための強力なアプローチとして浮上している標準的な生化学的または顕微鏡の方法で得られたもの。従って、このような受容体 - 受容体相互作用などの動的イベントは、高時空間解像度で生細胞におけるリアルタイムで追跡することができる。このプロトコルは、小さくて明るい有機蛍光団と直接生きた細胞の表面上の単一の受容体を可視化する全反射蛍光（TIRF）顕微鏡を用いた標識に基づく方法について説明します。このアプローチは、いずれかが正確に、受容体を局在化受容体複合体のサイズを測定し、そのような一過性受容体 - 受容体相互作用などの動的イベントをキャプチャすることを可能にする。プロトコルは、PE方法の詳細な説明を提供しています試料調製、画像取得および画像解析を含む単一分子実験を、rform。一例として、2つのG-タンパク質共役受容体を分析するこの方法の適用、 すなわち 、β2 -アドレナリン及びγ-アミノ酪酸タイプB（GABA B）は受容体が報告されている。プロトコルは、他の膜タンパク質および異なる細胞モデル、トランスフェクション法および標識戦略に適合させることができる。
Introduction
受容体は、細胞表面感覚細胞外環境に位置しており、このような臭気物質、イオン、小神経伝達物質および大きいタンパク質ホルモンのような様々な刺激に応答する。細胞膜の流動性は、受容体及び他の膜タンパク質の移動を可能にする。これは、タンパク質複合体およびそのような機能単位にアセンブルし、細胞内部にシグナルを伝達する受容体によって使用されるような一過性のタンパク質 - タンパク質相互作用の発生の形成に必須である。例えば、細胞表面受容体1の最も大きなファミリーを構成するG-タンパク質共役受容体（GPCR）は、シグナル伝達の微調整調節に関与することが表示され、di-/oligomersを形成することが示唆されている重要な生理的および薬理学的結果2-5があるかもしれません。
単一分子顕微鏡で直接高spatiotempで可視化する大きな可能性を秘めている経口解像度の関連付けを含む生きている細胞の表面上に位置する個々の受容体の動的挙動は、二量体およびより高次の分子複合体6-10を形成する。これは通常、分子の数千から数百万の平均的挙動を報告し、標準的な生化学的および顕微鏡の方法に比べていくつかの利点を提供しています。
十分に明るく、光安定性、フルオロフォアとタンパク質標識は、単一分子顕微鏡検査のために不可欠です。このプロトコルは、共有結合し、細胞表面の受容体に小さな、明るい有機蛍光団を接続するために最近導入され、SNAPタグ11を利用しています。 SNAPは、不可逆的に蛍光団結合ベンジルグアニン（BG-フルオロフォア）誘導体で標識することができるヒトDNA修復酵素のO 6 -アルキルグアニン-DNAアルキルトランスフェラーゼに由来する20 kDのタンパク質タグである。 CLIP、SNAPに由来し、さらに設計タグは、代わりに蛍光団-Cで標識することができるonjugatedベンジルシトシン誘導体12。
本稿で報告されたプロトコルは、トランスフェクトし、ラベルの小さい有機蛍光団との11の受容体をSNAP-タグおよび生細胞10の表面上の単一の受容体または受容体複合体を視覚化するために全反射蛍光（TIRF）顕微鏡を使用する方法について説明します。細胞外SNAP-タグ化細胞表面タンパク質10の> 90％の標識効率の報告されたプロトコールをもたらす。受容体複合体のサイズおよび移動度を分析するために、ならびに一過性受容体 - 受容体相互作用を捕捉するために単一分子データを使用する方法に関するさらなる情報は、提供される。プロトコル全体の概略的なワークフローは、 図1に示されている。一例として、SNAP-タグ化Gタンパク質共役受容体（GPCR）を有するチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞のトランスフェクションは、フルオロフォア-BG誘導体で標識し、続いてよくquantifへの応用として、yおよびモニタ受容体di-/oligomerizationが記載されている。このプロトコルは、他の細胞表面タンパク質と蛍光タグ（ 例えば 、CLIP）、ならびに他のトランスフェクションおよび標識方法にまで拡張することができる。
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Protocol
1。サンプルの調製
- カバーガラス清掃
注：ヒュームフードの下で動作します。- 個々のカバースリップを分離し、カバースリップホルダーにガラス製カバースリップ（直径24mm）を配置するためにきれいなピンセットを使用してください。
- ビーカーにカバースリップでホルダーを置き、カバーグラスがカバーされるまで、クロロホルムを追加します。室温で1時間にわたり浴超音波処理器中で蒸発し、超音波処理を減らすためにアルミホイルでビーカーをカバーしています。ビーカーからカバースリップホルダーを取り、カバーグラスを乾燥させます。
- 代わりにクロロホルムを5M NaOH溶液でステップ1.1.2を繰り返します。
- 新しいビーカーにカバースリップホルダーを取り、蒸留水で3回洗浄する。 100％エタノールを充填したガラス細胞培養プレート中で洗浄し、カバースリップを置く。
- キャリブレーションサンプルの調製
- 適切な溶媒に蛍光染料を溶解させる。
- までの蛍光色素の1:10連続希釈液を調製1時から1 nMのフィルタに（0.22μm）の水を滅菌した。
- 100％エタノールに保存掃除カバースリップを取り、フィルター滅菌水で洗う。スポット別々に洗浄カバースリップ上の各蛍光色素希釈液20μl。カバーグラスを滅菌フードの下で乾燥させます。使用するまで、光とホコリからカバースリップを保護します。単一の蛍光分子（ステップ3を参照）の強度を推定するために、これらのサンプルを使用しています。
- トランスフェクション
- 10％ウシ胎児血清（FBS）を補充した1時01分ダルベッコ改変イーグル培地/栄養混合物F-12で培養CHO細胞（DMEM/F12）、100 U / mlペニシリンおよび37℃で100μg/ mlのストレプトマイシン、内5％のCO 2 注：自家蛍光を最小限にするために、実験を通じてフェノールレッドを含まない培地を使用してください。
- 、100％エタノール溶液から清浄カバースリップを取り、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）でそれらを洗浄し、6ウェル細胞培養plの各ウェルに1カバースリップを置く食べた。
- トリプシン処理は、カウントし、3×10 5細胞/ウェルカバースリップを含有する6ウェル細胞培養プレート中の密度でシードCHO細胞。細胞が約達成するために、24時間インキュベーター（37℃、5％CO 2）で成長しましょう。トランスフェクションのための最適な細胞密度は80％コンフルエント。
- 各ウェルには、（ 例えば 、2 -アドレナリン受容体βSNAP-タグ）所望のプラスミドDNAの2μgのを希釈し、500μlのOptiMEM培地を含む2別々のチューブ内の6μlのリポフェクトアミン2000。室温で5分間インキュベートする。
- 1チューブにステップ1.3.4からのソリューションを組み合わせて、トランスフェクション混合物を得るために混ぜる。室温で20分間トランスフェクション混合物をインキュベートする。
- インキュベーション（1.3.5）の間に、CHO細胞を取得し、予め温めた（37℃）PBSで二回洗浄する。 1ミリリットル/ 10％FBSを添加したフェノールレッドを含まないDMEM/F12培地のよくなく、抗生物質なしで、PBSを交換してください。
- 全体トランスフェクトを追加イオン混合物を穏やかに各ウェルに滴下して、ステップ1.3.5（1 ml）を加え、完全な混合を確実にするためにプレートを前後に揺する。
- CO 2 5％、37℃で2〜4時間インキュベートし、次のステップに直後に進むNOTE：これらのトランスフェクション条件は、受容体密度を達成するために最適化された<単一のに適している0.45個/μm2で、分子イメージング。異なるセル、構築物または試薬を使用する際に調整が必要になることがあります。
- タンパク質標識
- 1μMの最終濃度を得るために、10％FBSを補充した1ミリリットルDMEM/F12培地中のフルオロフォア-BGストック溶液1μlを希釈する。インキュベーターからトランスフェクトされた細胞を取り、あらかじめ温めておいた（37℃）PBSで2回洗浄します。 1μMの蛍光団のBG溶液1mlを含むPBSを交換し、37℃、5％CO 2インキュベーター内で20分間インキュベートする。
- インキュベーション後、細胞を3を洗浄10％FBSを補充したDMEM/F12培地中、37℃で5分間インキュベートした各時間に回ピンセットで（標識された細胞との）カバースリップを取り、イメージング室に配置します。
- 300μlの撮像緩衝液で2回洗浄する。新鮮なイメージングバッファー300μlのを追加し、画像化（その2）にすぐに進んでください。
2画像の取得
注：全反射蛍光を使用してください（TIRF）顕微鏡、油浸高開口数の対物レンズ（ 例えば 、100X magnification/1.46開口数）を装備した、適切なレーザ（例えば405nm、488nmの、561 nmおよび645ナノメートルダイオードレーザ）、電子増倍電荷結合素子（EMCCD）カメラ、インキュベーター、単一蛍光分子を可視化する温度制御。
- すなわち 、所望の顕微鏡のパラメータを設定します。、レーザーライン、全反射角度が（このパラメータは、溶込みを制御エバネッセント場の深されたTiON）、露出時間、フレームレート、動画10あたりの画像数。温度ドリフトや結露を避けるために、常にオンヒーター/インキュベーターと温度制御を維持する。
- 顕微鏡の100倍の対物レンズにイマージョンオイルの滴を入れてください。顕微鏡の試料ホルダーに標識した細胞を画像化室を配置し、明視野照明を使用して焦点の細胞をもたらす。
- 全反射照明に切り替えます。しかし、同時に、所望の細胞を探索する光退色を最小にできるように、できるだけ低いレーザパワーを保つ。
- 所望のセルを選択し、細かいピントを調整します。シングルフルオロフォアの可視化を可能にするレベルにレーザーパワーを設定します。画像シーケンスを取得し、。TIFFなどの生イメージシーケンスファイルを保存します。
3。キャリブレーション（ガラス及び単量体/二量体受容体のコントロールにシングルフルオロフォア）
- 各校正SAMPLを組み立てるイメージングチャンバーに1.2で説明したように、電子用意しました。顕微鏡で各サンプルを配置し、単一のステップで漂白十分に分離回折限界スポットを含むサンプルを選択します。 注：これらのスポットは、蛍光色素の単一分子を表す。
- 工程2に記載されTIRF画像シーケンスを取得する重要 ：同じ撮像パラメータは、較正のためのものも含め全ての実験に使用されなければならない。
- 4.1から4.2に詳述され検出および追跡分析を行う。 4.2.6で説明したように各粒子の強度を抽出します。これらのデータから、平均値（μ）および単一蛍光体の強度の標準偏差（σ）を計算します。
- オプション：単量体細胞表面受容体（ 例えば CD86）をトランスフェクトした細胞上で同じ分析を行い、N-末端SNAP 10の1つまたは2つのいずれかのコピーで標識して蛍光団-BG誘導体で標識された。 Folloガラス上の単一のフルオロフォアのために上記の手順ワット。 Calebiro、D. らの説明に従って、標識効率を推定する。10
4。画像解析
- 画像シーケンスの準備
- 画像をトリミングする画像処理ソフトウェア（ 例えば、ImageJは ） を使用します。
- 独立した個々のフレームを保存します。TIFF画像を新規フォルダに、各画像フレーム番号に示す。
- 細胞の輪郭に沿って関心領域（ROI）を描き、ImageJの内のメジャーツールまたは別のソフトウェアで同様のツールを使用して、細胞表面の面積を測定する。細胞表面面積でムービーの冒頭粒子の総数で割ることによって粒子密度を計算するためにこの値を使用します。
- 粒子検出および追跡
注：このようなU-トラック 13として使用する非商用のソフトウェアは、MATLABでの作業自動的に検出し、単一の受容体粒子を追跡するための環境を、。
注：U- トラックアルゴリズムは、複数の仮説の追跡手法に基づいています。このアプローチは、1フレーム内で指定された粒子は、次のフレームで所定の粒子に対応している表示され、消えたり/他の粒子から/で分割併合する個々の確率が割り当てられているコスト行列を、構築することにより、フレーム間の粒子をリンクします。世界的に、コストを最小化する解、 すなわち 、最も確率の高い1は、最終的に選択されています。また、これは一時的に消え、粒子、蛍光体の点滅によって引き起こされる典型的な現象を追跡することができます。 U-トラック （2.1.0）の最新バージョンは、これらの分析の実行を容易にするグラフィック·ユーザ·インタフェースがあります。- 映画の選択インターフェイスを開くには、MATLABコマンドプロンプトで、「movieSelectorGUI」。作成するために指示に従ってください以前に保存した別々の画像から始まる新しいムービーデータベース（4.1.2を参照）。
- 粒子検出および追跡するために必要な画素サイズ以下で、秒単位の時間間隔、開口数、カメラのビット深さ及びフルオロフォアの発光波長を提供する。映画のデータベースを保存します。
- 映画の選択インタフェースから、オブジェクトの種類として、「単粒子 」 を選択、分析を実行します。粒子検出および追跡に使用されるパラメータを定義することができる場所に新しいウィンドウが表示されます。デフォルトのパラメータで始まります。 。検出および/ またはトラッキングの品質はオプション （ 例えば 、いくつかの粒子が検出されたか、トラックが断片化されていない）満足のいくものであれば、後は、これらのパラメータを調整します。トラッキング設定の下で、保存するために「 マトリックス形式にエクスポート追跡結果 " をチェック「trackedFeaturedInfoと呼ばれる単一の行列（フィールド内のすべての粒子の座標と振幅」）。これらのパラメータの詳細については、U-トラックのマニュアルを参照してください。
- 検出アルゴリズムを実行します。このアルゴリズムは、自動的に各回折限界スポット局所強度極大の周りの顕微鏡の点広がり関数に等しい標準偏差が2次元ガウス関数をフィッティングすることによって（ すなわち 、単一の受容体/受容体複合体）の背景の上の位置と強度を決定。その後、追跡アルゴリズムを実行します。 。マットファイルで分析結果を格納します。
- トラックを視覚化し、検出および追跡の品質をチェックするために、U-トラックパッケージに含まれる「movieViewer "ルーチン、または類似したカスタムのものを使用してください。
- 各フレームで追跡粒子の位置と振幅（ すなわち 、強度）を表示します。matファイルを開きます。ステップ4.2.4で生成されたデータはtracksFinal ARのtracksCoordAmpCGフィールドに含まれています線、および/またはtrackedFeaturedInfo中。粒子の総数から4.1.3で測定された細胞表面面積でこの値を除算粒子密度を算出し検出した。
- オプション：受容体の粒子の動きを分析すること（4.2.6参照）を時間をかけて、粒子の座標を使用します。 Matlabのまたは類似のソフトウェアを使用して、平均二乗変位（MSD）と拡散係数（D）を計算します。各粒子と考えられるすべての時間間隔（Δt）は 、次の数式を使用して、平均二乗変位（MSD）を計算する。
Δtはフレーム内の時間間隔であり、Nが分析ステップ数であり、xおよびyは、インデックスが示すフレームにおいて、粒子のx座標とy座標である。線形関係：指定された粒子の運動の種類を評価するために、時間のプロット上でMSDを使用監督の動きを示唆している自由拡散（ すなわち 、ブラウン運動）、正の曲率（ すなわち 、曲線は放物線のように見える）を示し、負の曲率は、限られた運動14の指標である。自由に拡散粒子の場合には、以下の式を用いて得られたMSDデータを当てはめることにより各粒子の拡散係数（D）を計算する。
- ガウシアンフィッティング法と粒子サイズの計算
NOTE：キャリブレーションサンプル（ガラスおよび/ または蛍光標識された単量体の受容体上の単一のフルオロフォア）の強度分布がわかれば、受容体複合体のサイズを決定するために、画像シーケンスの開始時に、粒子強度の分布に混合ガウスフィットを実行する（ すなわち 、粒子当たりの受容体の数）10。 Matlabのか、Sを使用して、これらの分析を実行imilarソフトウェア。- 強度の最初の変更が発生する前の（光退色に起因する減少がほとんどの場合）のフレームに最初のフレームからの粒子の強度を平均化することにより、各粒子の強度を計算します。
- 次の式に従って混合ガウスフィッティングを行います。
φ（i）は 、粒子がiの強度を有する周波数であり、nは成分の数であり、αnの成分nの高さに寄与するパラメータであり、μ及びσは、平均値と基準単一のフルオロフォアの強度の標準偏差である（ステップ3で説明したように計算される） 注 ：Tの決定F検定により判断されるように、彼は徐々に成分を添加するまでのn maxが増加することによって、各画像シーケンスのためのコンポーネント（N 最大 ）の最大数は、もはや、統計学的に優れたフィッティングを生じないない。 - オプション：（。 例えば 、400フレームシーケンスの最後の60フレーム）ムービーの最後のフレームに得られた強度分布に混合ガウスフィットを実行します。これらのパラメータのための洗練された推定値を提供する。このフィッティングの後に得られた値とμとσを交換して、ステップ4.3.2を繰り返します。
- 混合ガウスフィットの各成分の曲線下面積（AUC）を計算する。異なるサイズ分布全体のAUCで、各成分のAUC値を除算すること（すなわち、モノマー、ダイマー、トリマーなど）の受容体粒子の相対的な存在量を計算します。
- オプション：別の細胞と異なるサイズの粒子の分布は粒子密度10と相関してプロットを生成する（4.2.6で説明したように計算される）に対応する粒子密度から、使用データ。
- ステップフィッティング法と粒子サイズの計算
注：受容体複合体10のサイズを決定するための別の方法として、ステップフィッティング分析を使用してください。 n個の蛍光団を含むこのように粒子徐々に漂白nステップで強度プロファイルを生成することが期待される-この分析のための基礎は、その瞬間の消失、単一のフルオロフォアの結果の光誘起破壊（退色）があることである。- U-トラックまたは同様の検出/追跡ソフトウェア（4.2.6を参照）によって生成される。matファイルから各粒子の強度プロファイルを抽出します。
- このような提示1工程として、フィッティングアルゴリズムを使用REF IN。 10、各粒子のための漂白ステップの数をカウントする。
- オプション ：（4.3参照）は、異なる大きさの受容体粒子の相対量を示す分布を生成し、予め混合ガウスフィッティングの結果を説明したように粒子密度とそれらを関連付けるために、結果を使用しています。
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Representative Results
記載されたプロトコルは、異なる膜タンパク質の種々に適用することができる。例として、β2 -アドレナリン作動性およびGABA B受容体を用いて得られた代表的な結果を10で報告されている。単一分子からの蛍光シグナルが弱いので、バックグラウンド蛍光の最小化が成功した結果の最初の重要なステップである。これにより、広範囲にカバースリップを洗浄（ 図2A）を使用すること、ならびに試料の自己蛍光（ 例えば 、フェノールレッドを含まない培地を使用することによって）を最小化することが重要である。次のステップは、単一のフルオロフォア分子の蛍光強度を決定することである。これは、清浄なカバーガラス（ 図2B）上にスポットし、単一のフルオロフォアを撮像することによって行うことができる。典型的には、フルオロフォアの連続希釈は、分析のための最良の条件を選択するために使用される、すなわち 、十分に分離され、均一に分布し、単一のフルオロフォアを生じる濃度。追加CONTROLSが単量体制御タンパク質を撮像することにより行うことができる、 例えば 、フルオロフォア-BG誘導体で標識されたNAP-標識CD86受容体。これらの予備的なコントロールやキャリブレーションが実行された後は、実際の実験を開始することができます。 図3（a）は、2 -アドレナリン受容体βSNAP-タグおよび蛍光団-BG誘導体で標識されたトランスフェクトされた細胞の典型的なTIRF画像シーケンスの最初のフレームが表示されます。スポットは、単一の受容体または受容体複合体を表す。 、我々の経験によると貧弱な追跡品質が0.45個/μm2の結果上記の密度と10を避けるべきである。図3（b）は、検出アルゴリズムの結果が同じに適用される番組-この画像はまた、自動検出および追跡するのに適した粒子密度を示しています。画像シーケンス。各青い円が検出された粒子を示している。追跡アルゴリズムの結果は、 図3Cに報告されている青色のスプラインは、個々の粒子の軌跡を表す。各粒子の軌道は、次に、それらの拡散係数を計算するために使用することができる。この方法はまた、2つの粒子は、明らかに、過渡的相互作用を受け、図3（d）に示すように、動的なイベントを捕捉することができる。 図4は、 すなわち 、2つの異なったGPCRについて測定拡散係数の分布を示し、β2 -アドレナリン作動性及びGABA B受容体。このタイプの分析は、私たちはGABA B受容体の大部分は不動であるか、または非常に低い移動度10を有していることを示すことができた。混合ガウスフィッティング及びステップフィッティングの分析は、生きている細胞の表面上の受容体複合体の大きさを正確に定量化（ 図5）を提供する。 図5Aの例に示すように、この分析は、複雑な分布は、 例えば 、単量体および二量体の共存を明らかにすることができる。図5Bおよび5Cは、1つまたは2つのステップと正確にはそれぞれ、単量体および二量体の受容体としてそれらを割り当てられた対応するステップフィッティング分析において漂白粒子の2つの例を提供する。
図1。このプロトコルで説明するように、典型的な単一分子実験のワークフロー。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2カバースリップ洗浄及びキャリブレーションサンプルの調製（A）広範なカバースリップ洗浄前後のバックグラウンド蛍光との比較。カバーガラスを全反射顕微鏡で画像化した。きれいにカバースリップ上にスポットし、フルオロフォア-BG誘導体の濃度を増加させ（B）のTIRF画像を。スケールバー：10μmのは、 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図3。代表的な単一分子の画像および検出/追跡アルゴリズムの結果。 （A）2 -アドレナリン受容体βSNAP-タグおよびBGのフルオロフォアで標識された誘導体でトランスフェクトされたCHO細胞を、TIRF顕微鏡で可視化した。取得された画像シーケンスの最初のフレームが示されている。スケールバー：5μmの（B）。0;検出された粒子は、原画像の上に青い円で示されている（C）は 、同じ画像シーケンスの追跡アルゴリズムの適用から得られた軌道が白地に示されている。スナップショットは、フレームなしの状況に対応しています。 35。グリーンセグメント、イベントをマージする。赤色セグメント分割イベント（D）は、2つの受容体から得られた代表的な粒子軌道は（青および緑のそれぞれ）、見かけの一過性の相互作用（赤色）を受けている。 2つの粒子は、いくつかのフレームのために一緒に移動し、マージして、再度分割します。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
受容体mobiliの図4。分析ティ。個々の粒子の軌道は、それらの拡散係数を計算するために使用される。この例では、2つの異なるGPCRを算出するための拡散係数の分布が報告されている。 GABA B受容体は移動性を制限しているのに対し、β2 -アドレナリン受容体は、細胞表面上の速い横方向拡散によって特徴付けられる。 Calebiro、D. ら 10から変更
図5受容体複合体の大きさの分析。 （A）受容体複合体のサイズを正確にガウスの混合モデルを用いて粒子強度の分布を当てはめることによって推定することができる。報告された例は、2 - drenergic受容体βSNAP-タグを発現する細胞に、この分析の適用を示す。フィッティングは2℃を明らかにomponents：シングル蛍光体の輝度（キャリブレーションサンプルのものと同様に、サンプルの部分漂白後に得られた分布に主に重ね合わせること、ここに示されている）と、倍程度の強度の1に相当する1。 2つの成分はそれぞれ、モノマーおよびダイマーとして割り当てることができ、二つの成分の下の領域は、単量体および二量体の相対存在量を推定するために使用することができる。一段階で単量体の粒子の漂 白（B）実施例（C特徴的な2段階の漂白と二量体粒子の）例。 （B）および（C）中の赤線は、ステップフィッティングアルゴリズムの結果である。図はCalebiro、D. らから変更されました。10 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
記載されたプロトコルは、単一分子レベルでの細胞表面受容体複合体の空間的配置、移動度及びサイズの分析を可能にする。蛍光タンパク質の使用と比較して、より明るく光安定性である小さな有機フルオロフォアで標識化は、単一の受容体粒子の可視化を拡張できるという利点を有する。非常に低い発現レベルが達成されているので（<0.45レセプター個/μm2）は 、受容体および他の膜タンパク質の特性は、生理的なものを超えない密度で分析することができる。また、アゴニスト10又は他の操作と受容体刺激の効果は、例えば、病理学的な状況を再現することを目的とし、分析することができる。また、原因SNAP / CLIPタグ11,12で標識戦略の柔軟性に、異なる蛍光体は、自分の特定のニーズに応じて使用することができます-注目すべきは、SNAPの組み合わせおよびCLIPタグは、例えば 、二色実験を行うために使用することができる、2つの相互作用タンパク質の間の共局在を観察する。最後に、このプロトコルは、異なる細胞、トランスフェクション法および標識戦略を用いて、例えば、いくつかの点で変更することができる。
重要なステップは、非常に低い発現レベルを達成するために、トランスフェクション条件（ 例えば 、トランスフェクション後のプラスミドDNAと時間の量）の最適化（広範囲に洗浄カバーガラス、フェノールレッドを含まない培地と濾過した溶液を使用して）、背景と自家蛍光の最小化を含む、効率的な標識、明るく、十分に光安定性フルオロフォアの選択。細胞の自家蛍光は可視スペクトルの青/緑の部分が高く、550 nmを超える、通常はほとんど無視できる程度であるため、蛍光体の選択に関する、赤/遠赤色のものは、通常、より良い結果を与える。特に注意は、光退色を避けることに留意する必要があります適当な細胞やフォーカス調整のための検索時に蛍光団。カバーガラス上にスポットされたフルオロフォア、ならびに単量体および二量体の受容体対照を有する試料（ 例えば 、CD86は、1つまたは2つのいずれかSNAPタグ付き）10は、分析を較正し、標識効率を確認するために考慮されるべきである。
このアプローチの限界は、現在、達成可能な時空間分解能に大きく依存している。これは、主に1蛍光団からだけでなく、使用するカメラの感度及び取得速度によって収集された光子の数によって決まります。 （比較のため、従来の蛍光顕微鏡の空間分解能は、約200 - 300 nm）を30nmの - 単独、検出された粒子の局在化精度の典型的な値は20である。 （ - 8nmの約2）これらの値は、依然として、一般的な膜タンパク質の実際のサイズよりも大きい。受容体は、微小の回折限界以下の距離で落下するので範囲（約200から300 nm）を単一の粒子として検出され、適切なコントロールおよび統計解析が真の受容体-受容体相互作用8月10日の番号からランダム共局在（偽陽性）を減算するために使用されるべきで達成可能な最大取り込みレート。現在のEMCCDカメラ（ すなわち 、センサの一部のみが使用される）は、少なくとも作物モードで、1キロヘルツを超えることができる。しかしながら、取得速度は、カメラに到達する単一フルオロフォアによって放出される光子の数によって制限される。実際には、少なくとも10の露光時間 - 20ミリ秒が、一般的に必要とされる。このため、典型的な捕捉速度、 すなわち 、10と50Hzの間で変化する。は、1フレーム毎に20〜100ミリ秒。蛍光体の設計、光学部品および検出技術の将来の発展はさらに単一分子法の時空間解像度を上げるようにすることができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | AppliChem GmbH | A1585 | CAUTION: toxic and irritating substance as well as a possible carcinogen |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | CAUTION: strong base and highly corrosive reagent |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 32205 | |
| Glass coverslip | Marienfeld-Superior | 111640 | 24 mm diameter, 0.13-0.16 mm thickness |
| 0.2 mm sterile filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| CHO cells | ATCC, USA | ATCC CCL-61 | Chinese hamster ovary cell line |
| 6-well cell culture plate | Nunc | 140675 | |
| DMEM/F-12 medium | GIBCO, Life Technologies | 11039-021 | Phenol-red free medium |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S 0115 | |
| Penicillin - streptomycin | Pan Biotech GmbH | P06-07 100 | |
| Trypsin-EDTA | Pan Biotech GmbH | P10-23100 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Life Technologies | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen, Life Technologies | 31985-047 | |
| Fluorophore-conjugated benzylguanine | New England BioLabs | S9136S | SNAP-Surface Alexa Fluor 647. Make a 1 mM stock solution in DMSO. Store at -20°C. |
| DMSO | AppliChem GmbH | A1584 | |
| Imaging buffer: | 137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.3, sterile-filtered | ||
| NaCl | AppliChem GmbH | A1371 | |
| KCl | AppliChem GmbH | A3582 | |
| CaCl2 | AppliChem GmbH | A2303 | |
| MgCl2 | AppliChem GmbH | A3618 | |
| HEPES | AppliChem GmbH | A3724 | |
| Imaging chamber | Molecular Probes, Life Technologies | A-7816 | Attofluor Cell Chamber, for microscopy |
| TIRF-M | Leica | Model: DMI6000B | |
| TIRF objective | Leica | 11 506 249 | HCX PL Apo 100x/1.46 Oil CORR |
| EM-CCD camera | Roper Scientific | Photometrics Cascade 512B | |
| Temperature controller | Pecon | Tempcontrol 37-2 digital | |
| ImageJ software | NIH, USA | http://rsbweb.nih.gov/ij | |
| u-track software | Laboratory for computational cell biology, Dept. of Cell Biology, Harvard Medical School, USA | http://lccb.hms.harvard.edu/software.html | |
| Matlab software | The MathWorks, USA |
References
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