Summary
在这项研究中，一种新的平台来调查在躁郁症（BD）的治疗的反应的突触体分子签名被开发和验证。从BD患者嗅上皮是通过鼻腔活检获得。那么激光捕获显微切割是结合实时RT PCR，调查BD锂反应的分子签名。
Abstract
双相情感障碍（BD）是一种严重的神经精神障碍与了解甚少病理生理学和通常用的情绪稳定，碳酸锂。动物研究和人类遗传学研究表明，锂影响参与神经元生长，存活和成熟，以及特别是分子参与Wnt信号传导该分子靶点。定的伦理挑战获得脑活检调查与锂反应在中枢神经系统（CNS）有关的动态分子改变，可以考虑使用从嗅觉组织获得的神经元来实现这一goal.The嗅觉上皮包含嗅觉受体神经元在开发和胶质状的支持细胞的不同阶段。这提供了研究中的患者的神经精神性疾病的中枢神经系统的动态变化一个独特的机会，使用从鼻腔活检安全地获得嗅觉组织。为了克服由SUBST带来的缺点活检嗅觉组织与非神经元细胞antial污染，一种新的方法，以获得富集的神经元细胞群体通过结合鼻活检与激光捕获显微切割的开发。在这项研究中，用于研究治疗相关的动态中神经元组织的分子变化的系统的开发和验证，使用了BD患者招募的锂治疗反应的分子机制的研究的小试验样品。
Introduction
双相情感障碍（BD）是一种严重的神经精神疾病，其特点是情绪的病理变化，驱动器和认知1。用于治疗BD的锂已经显示出改变的在动物研究2的大量基因的稳态mRNA水平，但它仍然是未知的，如果任何这些分子与在人体2的临床响应相关联。理解锂反应的机制将需要调查在神经组织锂诱导分子变化。不幸的是，它是不实用的，得到了BD患者的脑活检前后锂疗法，以确定锂反应的分子签名。验尸脑组织已经被用于研究在BD中的生物标记物，但是，它们不能被用来评估与情绪，认知和驱动的动态变化有关的分子标记;回顾性确定的锂治疗反应的有效性可能会产生问题4。淋巴细胞和其他血细胞可能是有用的，但在血细胞的分子变化可能不反映神经元的变化3-5。脑脊液可能不足以获得对细胞内的分子，可能反映疾病相关和药物可逆固有变化的信息。
嗅觉上皮（OE）是中枢神经系统（CNS）的一个独特的部分，胚胎学相关于边缘结构6;它是通过鼻腔活检方便。它由胶质状的发展7-9的不同阶段支撑（ 即 sustentacular）细胞，基底细胞增生，和嗅觉受体神经元。因此，OE提供了通俗易懂的学习与神经精神疾病的7动态变化的病人中枢神经系统的独特机会。研究，展示了OE的效用作为替代组织调查反映这些OCC相关疾病事件urring在大脑神经元8,9。例如，有研究利用OE调查与精神疾病相关的10-14分子型材。嗅觉系统也可用来识别临床endophenoytpes如与精神分裂症15阴性症状相关的气味赤字。此外，神经发育过程中的OE持续终生，提供了一个有用的途径精神病条件8,9的基本病理生理学模型。
然而，一个缺点使用这种组织的是嗅觉活检与非神经元细胞16的实质性的污染。例如，在先前的OE研究中所用的基因表达研究中的总RNA含有从整个鼻腔活检组织，包括从非神经细胞17的RNA提取的RNA。因此，先前的方法已经由小区的质量的限制。为了克服这个问题，一种新颖的方法，得到丰富的神经元细胞群结合鼻腔活检使用激光捕获显微切割（LCM）已开发18。
LCM是一种技术，其允许使用紫外激光切割结合红外线激光19-21细胞的选择性分离。结合LCM使用OE方法由非神经元细胞减少的OE大量污染，从而提高神经元细胞18的富集。此外，神经元层，可以从下层层在显微镜下区分，从而省去了染色。从其他细胞群使用其通过感兴趣7的细胞类型表达的初级抗体的神经元细胞类型可以进一步进行区分。因此，该过程建立了几乎纯的神经元细胞群可用于基因表达研究，免疫组织化学等形态学调查富集更简单的方法。
ve_content“>这项研究的目的是建立一个实验平台，进行调查与疾病状态和治疗反应相关的嗅觉神经元的分子变化。为了解决这个问题，一小套非吸烟患者谁见了DSM-IV诊断标准BD的基础上诊断访谈为遗传研究（DIG）22被招募进行两次经鼻活检：1的活检预处理与锂和第二活检，6周每日口服锂治疗后此外，合格的BD患者必须是：症状为抑郁症的基础上，给予蒙哥马利-艾森贝格量表（MADRS）23，临床医生得分≥10出60;对于有症状或轻躁狂躁狂，根据得分≥10出来的56对管理扬躁狂量表临床医生（YMRS） 24;或≥10两个MADRS和两个尺度医生之间的协议YMRS评价者-间信系数> 0.96活检后，神经元ENRI。通过LCM从OE地交付。以下附加的质量控制措施，以确保从组织和神经元的富集提取高质量的RNA，实时RT-PCR进行，调查所关注的基因的前后的治疗表达水平。接下来的部分包含了这种方法的有效性的描述，突出了协议的优化，并申请了故障排除的协议的策略。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注：所有研究志愿者在这项研究中给予批准的霍华德大学和约翰斯·霍普金斯大学的机构审查委员会知情同意的文件。只有谁同意签署知情同意书的文件参与者被纳入研究。该研究基地本分析组成如下：20名受试者（12 BD与10控制; 30％男性）和平均38.2（14.1）岁（SD）。
注：喷雾用RNA酶扎普所有表面由玻璃和塑料表面去除RNase污染。
1.活检程序
- 在鼻研究参与者的腔喷利多卡因（利多卡因）的液体4％和盐酸羟甲唑啉0.05％，让麻木的时间为15分钟。
- 浸泡8.5×3英寸外科cottonoids在利多卡因和羟甲唑啉的混合物中，并插入在鼻腔沿鼻中隔优越部腔，并允许静置15分钟。
- 使用30°的刚性鼻内窥镜定位鼻腔的上部，取出使用从鼻中隔的优越部向上咬鼻组织钳，考虑几个小试样鼻粘膜。
2.准备组织块
- 紧接活检，填补标准尺寸cryomolds与组织冷冻介质。
- 使用高压灭菌镊子，安装新鲜组织的冷冻介质冻结干冰。填冷冻块的剩余部分与所述冷冻介质，冷冻冷冻块的干冰上，并在-80℃存储块。
3. Cryosectioning
- 以cryosectioning准备聚萘二甲酸（PEN）膜的载玻片立即之前。喷载玻片用5分钟的RNase扎普溶液。然后用清水冲洗在酸二乙酯（DEPC）水滑梯，让空气干燥30分钟。激活在UV光下干燥载玻片30分钟。
- 冷冻切片每一块完全由30微米。继续干我的幻灯片CE，和部分冷冻尽可能。商店载玻片在-80ºC完成时。
4.激光捕获显微切割
- 通过紧接显微脱水幻灯片开始。让冷冻载玻片解冻持续10秒，然后将下面的乙醇系列应用到每个幻灯片：60％（2毫升，15秒），80％（2毫升，15秒），95％（3毫升，25秒），100 ％（7毫升，60秒）。
- 转光活化定位显微镜（PALM）显微镜上，并设置为满足以下条件：对于10X放大率设置能量至82，聚焦到74，和速度，以25 - 30。20X放大倍率，设定能量到63，聚焦到67，和速度，以5 - 6根据需要调整，以获得最佳的切割效果。
- 视觉识别使用20X或10X的放大倍率的神经元。区分从底层子黏膜在显微镜下对薄表面嗅神经元层，而无需使用染色过程。观察神经元的密集柱状外观18。
- 在步骤4.2中使用的上述显微镜铅笔功能，微量周围神经元层。追溯稍微远离神经元以防止激光神经元的燃烧。这是为了得到高品质的RNA是必不可少的。然后启动激光制导切割。
- 拿起用细尖镊子显微解剖切片，并把组织中含冰100微升裂解液微管。重复从单个样品获得的所有神经节。每个样品的总清扫时间不应超过50分钟。
- 一旦剥离完成后，立即涡样本裂解物，并保持在干冰。样品储存在-80℃总RNA分离。
5.提取总RNA和质量控制分析
- 解冻样品裂解物在冰上。进行总RNA分离与RNAqueous微套件用DNase-I灭活按照制造商的协议，没有修改（见<STRONG>图1）。总洗脱体积大约为20微升。
- 测量RNA的浓度和评价RNA质量与使用生物分析仪RNA完整性数（RIN）。符合图2中的质量控制标准样品可以用于cDNA的合成。
6. cDNA合成
- 使用经过验证的商业试剂盒合成cDNA（ 见表试剂 ）。执行通过组合0.1退火工序 - 1.0纳克的RNA（根据情况而定）和无RNA酶的水，以每管8微升的总体积。然后加入1μl的寡聚d（T）20引物和1μl的10mM的的dNTP每管混合，为10微升的总体积。
- 轻轻涡旋并离心样本和退火的样品在65℃下5分钟。在反应完成后，立即凉爽样品在冰上。
- 根据表1的规格制备预混溶液。然后加入9.5μ升主混合物和0.5μl的商业制备的逆转录酶（RT）到每个管中。加入0.5微升无RNase水，以控制管代替室温。
- 运行与第一温育，在50ºC一个RT反应50分钟，然后85ºC5分钟，并最后4ºC保持，没有骑自行车。
- 稀释所有的样品通过用5倍的水和分装。样品储存在-80ºC。
7.实时PCR - 确认神经元富集
- 根据表2的规格制备预混溶液。使用内部对照如GAPDH。比较嗅觉标记蛋白（OMP）的表达与undissected组织OMP表达显微组织，以确定神经元的浓缩。
注：OMP是一个标记为嗅觉神经元。
OMP序列：前进，5'-CTGTCGGACCTGGCCAAG-3'
反向，5'-CACCCTCGCCAAAGGTGA-3'
GAPDH序列：前进，5'-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3'
反向，5'-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3'。 - 在每孔和3微升cDNA的增加7μl反应混合液建立PCR板。
- 离心板5分钟，在300×g离心（1300转）。采用用于商业supermix诸如SYBR更环保的qPCR所指定的默认热循环条件运行实时PCR反应。
- 分析数据（ 见图2规格）。
8.实时PCR - 目的基因的表达
- 执行上显示的2倍以上的神经元浓缩样品。
- 准备在冰上每个探针（FAM标记的探针的兴趣和VIC标记的GAPDH）在根据表3的规格单独管主混合物。
- 设置在各个孔和2μlcDNA的PCR板8微升主混合物。
- 离心板5分钟，在300×g离心（1300转）。运行实时PCR反应使用def行凶热循环条件为每按生产厂家提供了基因表达的主混合物协议。分析表达式的结果（ 见图2规格）。
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Representative Results
在分子签名的研究的协议和故障诊断策略被成功地进行了优化。样品RNA的质量和神经元富集的标准中更下游的实时PCR分析中使用了标准化。 RIN和RNA的浓度进行检测的干扰因素，以检测表达水平。基于几个样品与RINS从1分析 - 10，它被确定的〜3.0和高于最小RIN足以用于本研究中的下游分析。其结果是，用于cDNA合成的RNA量的标准化为1.0纳克。因此，高品质的样品与RIN以上〜3.0和RNA的量为1.0毫微克被转换成cDNA。样品用0.1 - 1.0纳克的RNA如果有足够的样本大小是难以得到可使用。
使用实时PCR分析神经元富集了确认。显微样品中的OMP的基因表达水平与那些在undissected样品进行了比较s至确定的神经元层富集。显微切割样品2倍或更大的OMP表达相比非解剖组织被使用。
因此，通过应用这些标准，此建议的方法用于研究中的OE神经元进行了验证的分子变化的可能性。 图3示出的GSK-3β的表达水平受锂，而不是由非特异性外源因子，这表明该方法足以检测特定分子变化之前和锂处理后。更具体地，在BD中锂的治疗反应相关的分子签名的改变可以通过与临床数据结合该分子数据加以处理。
图1. RNA提取和DNA酶失活协议的 flowchar吨说明了LCM后，从样品中提取RNA的过程。总RNA洗脱2次，得到大约20微升的最大体积的RNA。洗脱的样品，然后进行了DNA酶失活的酶I处理。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.协议内容，这个数字概括了整个协议的研究实验。鼻部组织活检第一和冻结cryoblocks。切片的组织后，将神经元的层所使用的LCM解剖。 RNA提取和DNA酶失活是使用制造商的指导原则（参见图1）中进行。满足质量控制标准样品（RIN和RNA量）用于合成cDNA和我们ED的神经元富集分析。丰富的样本在现实与期望的目标时间-PCR分析使用。 请点击此处查看该图的放大版本。
在BD中和对照样品图3. GSK-3β的表达。该图显示了BD样品中之前和之后的对照样品中的第一和第二切片之间的变化中，GSK-3β的表达水平锂治疗和一致性GSK-3β的表达水平。总之，这些数据表明，GSK-3β的表达是受锂而不是非特异性外源因子。
| 试剂 | 音量 |
| 10×RT缓冲 | 2微升 |
| 25毫米氯化镁 | 4微升 |
| 0.1M的DDT | 2微升 |
| 核糖核酸酶输出 | 0.5微升 |
| 在SuperScript III | 0.5微升 |
| 核糖核酸酶自由水 | 1微升 |
表1. cDNA合成预混液。
| 试剂 | X1 | ×（＃样品） |
| 模板DNA | 3微升 | - |
| SYBR绿 | 5微升 | |
| 引物混合物 | 0.8微升 | |
| 水 | 1.2微升 | |
| 总 | 10微升 | - |
表2.神经元富集PCR预混液。
| 试剂 | X1 | ×（＃样品/引物） |
| dWater | 2微升 | |
| 预混 | 5微升 | |
| FAM标记探针 | 0.1微升 | |
| VIC标记探针 | 0.5微升 | |
| 基因 | 2微升 | - |
表3.目标PCR Master Mix中。
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Discussion
通过合并鼻腔活检和LCM获得丰富的嗅觉神经细胞层一个新的平台，并提出了在这项研究中已得到验证。这种技术可以有广泛的影响。它可以对生物标志物的研究，包括对治疗的反应，以及其他神经精神状况的药物发现的努力得到应用，使得该领域的更广泛的影响。
为了获得高质量的神经元服从下游应用，一些关键和故障排除步骤必须注意。首先，获得4 - 6片每名患者嗅觉组织到具有足够的样本大小。其次，由于样品很容易受到RNA的降解，保持组织在适当的温度下，用RNase免费提供设备和表面，使用手套工作，避免直接在样呼吸。如果RNA质量仍然较低，考虑在50分钟完成显微切割和解剖或vort后立即执行RNA提取前样品立即继续干冰储存之前在-80℃。以增加的RNA的产量，增加的LCM中解剖部分的数目。
研究在神经精神障碍的脑相关的分子变化的挑战，存在着由于缺乏无障碍研究人类大脑的。替代的方法包括在研究外周血细胞，尸检脑筋，和诱导的多能干（iPS细胞）。血细胞可能并不代表疾病相关的神经元的变化。尸检大脑不能是资源，研究与疾病进展和对药物的反应相关联的动态和状态的变化。 iPS细胞可以不直接反映状态的变化，因为这样的痕迹有可能重新编程和维护的细胞的过程中，要被擦除的。因此，使用参考组织的优点是，研究在神经元上下文状态和动态变化的能力。特别是，衍生的iPS神经元干细胞可能不能充分反映6周锂的治疗，由于培养和重新编程的步骤的效果。在本文所提出的方法，使我们能够研究治疗相关的分子的变化，并将其与变化的临床症状。必须指出的是，至少在目前，神经元从OE组织得到的量足以为在分子水平上的研究，但可能不是通过免疫组织化学的应用被限制为蛋白质的表征。因此，进一步的技术改进，也在意料之中。
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Disclosures
作者报告没有与商业利益的财务关系。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Preparation | |||
| Tissue-Tek Cryomold Molds | Sakura Finetek | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Cryosectioning | |||
| Membrane Slide 1.0 PEN (D) | Carl Zeiss Microscopy | 415190-9041-000 | |
| Rnase Zap | Ambion | AM9780 | |
| DEPC Treated Water | Quality Biological | 351-068-131 | |
| Microdissection | |||
| Microscope: PALM Series MicroLaser System | Carl Zeiss Microscopy | Model: Axiovert 200M Software: Robo v3.2 |
|
| No. 5 Dumont Microdissction Forceps | Roboz | RS-49085 | |
| RNA Extraction | |||
| RNAqueous Micro Kit | Ambion | AM1931 | |
| cDNA Synthesis | |||
| SuperScript III First Strand Synthesis Kit | Invitrogen | 18080-051 | |
| OMP qPCR | |||
| SYBR GreenER qPCR SuperMix | Invitrogen | 11760-500 | |
| Taqman qPCR | |||
| TaqMan Expression Assay Probes | Applied Biosystems | Various | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
References
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